Патент на изобретение №2208049

(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам повышения продуктивности микроорганизмов, используемых в пищевой и фармацевтической промышленности. Суспензию микроорганизмов подвергают облучению в спектральных интервалах ближнего ИК и видимого диапазона, соответствующих полосам поглощения растворенного в суспензии молекулярного кислорода. Дозу облучения рассчитывают по формуле D = D_ox/f(), где D_o = D(_o) – оптимальная доза облучения суспензии в центре _o выбранной полосы поглощения О₂, – вероятность поглощения фотонов в выбранном объеме суспензии, f () – контур полосы поглощения растворенного молекулярного кислорода, причем f (f(_o) = 1). Способ позволяет повысить продуктивность микроорганизмов различных видов. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам повышения продуктивности микроорганизмов, используемых в пищевой и фармацевтической промышленности.

Известны способы повышения активности (стимуляции) двух-трех десятков нефотосинтезирующих микроорганизмов под влиянием однократных доз оптического излучения в некоторых спектральных интервалах. С 1929 года известно, что монохроматический свет, особенно в голубой области спектра, ускоряет рост инфузорий [1]. Описан способ стимуляции видимым светом размножения и дыхания дрожжевых клеток Torula utilis [2]. Известен способ ускорения развития и повышения концентрации микроорганизмов к концу стационарной стадии роста, и, следовательно, увеличения количества нарабатываемых ими продуктов жизнедеятельности, путем облучения их определенными дозами оптического излучения в узких спектральных интервалах ближнего УФ и коротковолнового участка видимого диапазона [3] . Облучение суспензии дрожжевых клеток малыми световыми дозами по определенному режиму ускоряет развитие клеток в питательной среде и повышает концентрацию клеток при достижении ими стационарной фазы роста. Аналогичные результаты были получены с помощью облучения гелий-неоновым лазером (632,8 нм) дрожжевых клеток [4], а также бактерий Escherichia coli [5, 6] . Известен обзор работ по повышению метаболической активности некоторых микроорганизмов с помощью монохроматического излучения в видимом диапазоне [7] . Авторами установлено, что первичной причиной наблюдаемых фотобиологических эффектов является поглощение некоторой части падающего излучения теми или иными присущими клеткам фотоактивными биомолекулами (клеточными фоторецепторами). Однако известно, что в биотехнологиях используется множество разнообразных микроорганизов, различающихся в деталях клеточной структуры, и биомолекулы любого заданного типа, включая фоторецепторы, могут присутствовать в них в разном количестве копий, иметь структурные модификации, а порой вовсе не синтезироваться. Следовательно, наблюдаемая авторами фоточувствительность может варьироваться от вида к виду вплоть до полного отсутствия. Это создает определенный риск при планировании возможного практического применения и приводит к оценке рассматриваемых способов как не обладающих универсальностью и недостаточно технологичных.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения (прототипом) является способ ускорения роста дрожжевых клеток Candida guilliermondii и повышения продуктивности бактерий Bacillus brevis, описанный в работе [8]. Суспензию микроорганизмов облучали однократной дозой света на длине волны 440 нм, используя в качестве источника излучения ртутную лампу ДРШ-1000 с дифракционным спектрографом. Облучение клеточной суспензии проводили, основываясь на принципе равномерного облучения клеток, в 100 мл кювете размером 5210 см из расчета 1 млн. клеток на 1 мл питательной среды, после чего суспензию переносили в колбы с измененным составом питательной среды и инкубировали на качалке при температуре 32^oС. Контролем служили те же культуры, выращенные в аналогичных условиях из необлученного инокулята. Эффект фотостимуляции был отмечен при освещении клеток посевного материала интенсивностью 4 мВт/см² в течение 60 с. Для дрожжевых клеток он заключался в сокращении лаг-фазы, уменьшении времени между последовательными клеточными делениями, ускоренном установлении стационарной фазы, увеличении общей биомассы на 40-50%. Для бактериальных клеток при 30 с экспозиции наблюдалось увеличение образования грамицидина С на 50-100% по сравнению с контролем.

Недостатком способа-прототипа, как и прочих аналогов, является использование фоторецепторов, специфичных для каждого вида микроорганизмов. Отвечающие за фотостимуляцию фоторецепторы могут быть связаны с различными клеточными структурами, из-за чего спектр их поглощения в микроорганизмах разных видов будет меняться, приводя к спектральному сдвигу максимума возбуждения и требуя соответствующего изменения длины волны возбуждающего излучения, что неудобно в практических приложениях. Кроме того, чтобы достичь одинаковой степени стимуляции всех клеток в суспензии, необходимо создать для них условия равномерного облучения, что может быть выполнено только в оптически тонких слоях. Следовательно, при облучении суспензий приходится использовать либо тонкие кюветы, либо малые концентрации клеток, и это резко ограничивает количество стимулируемых клеток. Более того, в случае наличия источника излучения с длиной волны, несколько отличной от рекомендуемой, невозможно расчитать, насколько надо изменить дозу облучения, чтобы получить тот же эффект.

Задачей заявляемого изобретения является создание универсального и технологичного оптического способа повышения продуктивности микроорганизмов различных видов и в объемах суспензий, не ограниченных условием малой оптической толщины, с указанием метода расчета необходимой дозы облучения в случае отклонения длины волны источника излучения от оптимального значения.

Это достигается тем, что для повышения продуктивности микроорганизмов предлагается подвергать суспензию микроорганизмов воздействию оптического излучения, спектральный состав которого должен лежать внутри полос поглощения растворенного молекулярного кислорода, производить перемешивание суспензии в процессе облучения, либо непосредственно после него, а дозу облучения рассчитывать по формуле:
D = D_o/f(),
где D_o = D(_o) – оптимальная доза облучения суспензии в центре _o выбранной полосы поглощения молекулярного кислорода, – вероятность поглощения фотона в выбранном объеме суспензии, f() – приведенный контур полосы поглощения растворенного молекулярного кислорода, причем f(_o) = 1. При этом используется особый, независимый от молекулярного состава клеточных структур, вид фоторецепции, обнаруженный в экспериментах с суспензиями эритроцитов и ряда других клеток человека и называемый светокислородным эффектом [9, 10]. Роль первичного фоторецептора выполняет свободно диффундирующий в клеточной суспензии молекулярный кислород. Продуктом оптического возбуждения является молекула синглетного кислорода, имеющая, как давно установлено, высокую биологическую активность [11]. Синглетным кислородом называют возбужденную молекулу кислорода, находящуюся на нижнем (синглетном) уровне, на котором происходит быстрая релаксация энергии электронного возбуждения со всех вышележащих элетронно-колебательных уровней. Поэтому светокислородный эффект наблюдается при оптическом возбуждении молекулярного кислорода во всех полосах его поглощения, причем наиболее эффективная длина волны находится в ближнем ИК диапазоне (1264 нм), где в клетках отсутствуют конкурирующие фотоактивные молекулы [10]. Механизм светокислородного эффекта аналогичен известному фотодинамическому эффекту [12], но не требует каких-либо сенсибилизаторов. Синглетный кислород вступает во взаимодействие с клеткой либо путем непосредственного контакта, либо посредством переноса возбуждения по сетке водородных связей, образуемой молекулами воды между собой и с экспонированными в водную среду участками белковых молекул (ферментов) клетки [13, 14], причем после дезактивации молекула синглетного кислорода вновь превращается в исходную молекулу кислорода в основном состоянии. При оптимальной дозе облучения за время экспозиции генерируется достаточное количество молекул синглетного кислорода для перевода клеток в активированное состояние. Поскольку синглетный кислород образуется в суспензии всюду, куда проникает фотон, в предлагаемом способе снимаются ограничения на объем и концентрацию клеток, обусловленные требованием малой оптической толщины. Эффективность предлагаемого способа тем выше, чем полнее поглощаются в облучаемом объеме фотоны. Это достигается выбором концентрации микроорганизмов, объема и формы содержащей суспензию кюветы, а также геометрии облучения. Благодаря распространенности кислорода в природе предлагаемый способ применим к любым микроорганизмам, способным жить в аэробных условиях, что, в свою очередь, упрощает и удешевляет этап лабораторных испытаний. Дополнительным преимуществом предлагаемого способа является возможность точной оптической дозиметрии биотехнологического процесса по полезной доле поглощенной световой энергии, поскольку эффективность стимуляции определяется не поглощением молекул клетки, а растворенным кислородом, концентрация которого в условиях равновесия с атмосферой хорошо известна. В результате достигается удобство и экономичность в использовании способа в производственных условиях.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Суспензию микроорганизмов приготовляют известным способом и инкубируют в известных условиях до достижения необходимой стадии развития, определяемой эмпирически. Затем суспензию подвергают воздействию оптического излучения в пределах известных спектральных полос поглощения растворенного молекулярного кислорода дозой D = Р, где Р – мощность излучения, – время экспозиции, производя перемешивание суспензии одним из известных способов в процессе облучения, либо непосредственно после него одним из известных способов, например, магнитной мешалкой или циркуляцией. Величину дозы определяют по формуле:
D = D_o/f(),
где D_o = D(_o) – оптимальная доза облучения суспензии в центре _o выбранной полосы поглощения молекулярного кислорода, – вероятность поглощения фотона молекулой кислорода в выбранном объеме суспензии, расчитываемая по спектру поглощения суспензии, f() – приведенный контур полосы поглощения растворенного молекулярного кислорода, причем f(_o) = 1. Обработанная таким образом суспензия используется известным способом в исследовательских или производственных целях.

Пример 1. Интенсификация брожения дрожжевых клеток. Использовались сухие дрожжи Saccharamyces cerevisiae для хлебопекарной промышленности. Разводка суспензии производилась из расчета 0,5 г дрожжей на 110 мл питательной среды (2% сахарозы + 0,5% пшеничной муки), что соответствовало 70 млн клеток/мл. Вода – водопроводная, кипятилась 5 мин, остывала до 60^oC, затем в нее последовательно добавляли сахарозу и муку и интенсивно перемешивали. Полученную взвесь сливали в стеклянную колбу и давали отстояться в течение 40-60 мин, затем надосадочную жидкость отливали в другую колбу и использовали для разводки суспензии. Дрожжи растирали в фарфоровой ступке с небольшим количеством питательной среды до консистенции однородной кашицы, полученный инокулянт вносили в колбу с питательной средой посредством нескольких смывов и перемешивали круговыми движениями. Затем суспензию разливали по 10 мл в пробирки, закрывали их пробками с газоотводными гибкими трубками для контроля выхода продукта брожения – углекислого газа и ставили в термостат с температурой 34^oС. Через 30 мин к концу лаг-фазы развития клеток часть из пробирок облучали снизу сквозь дно излучением полупроводникового лазера с длиной волны 1264 нм и мощностью 1,8 мВт в течение времени, задаваемого отдельно для каждой пробирки. Необлученные пробирки служили контролем. Затем все пробирки вновь возвращались в термостат. Регистрировалась динамика выхода углекислого газа, характеризующая интенсивность брожения, по мере последующего развития культуры. Результаты одной из экспериментальных серий показаны в табл. 1.

Видно, что при оптимальной экспозиции 25 с вместо обычно следуемой экспоненциальной фазы происходит индуцируемый облучением переход к интенсивному брожению, заканчивающийся через 1,5 часа вместо обычного времени порядка суток. При этом конечный выход углекислого газа (“энергия брожения”) возрастает в 2,5 раза, по сравнению со с необлученным контролем.

Пример 2. Стимуляция спиртообразования. Использовалась чистая культура дрожжевых клеток S.cerevisiae (ЛТВ-7), полученная из лаборатории виноделия Дагестанского научного центра, приготовленная аналогичным методом на питательной среде (5% сахара + 0,5% муки) при температуре 34^oC. Процедура облучения не отличалась от таковой в примере 1. Результаты приведены в табл. 2.

Видно, что выход спирта в облученной суспензии возрастает почти в три раза по сравнению с необлученным контролем.

ЛИТЕРАТУРА
1. Hutchinson A. H., Ashton M.R. The specific effects of monochromatic light on the growth of Paramecium. Can. J. Res., v.l, p. 292-304 (1929).

2. Конев С.В., Лыскова Т.Н., Прокопова Ж.В. Стимулирующее действие видимого света на деление и дыхание дрожжевых клеток. Изв. Укр. АН, т. 6, с. 51-56 (1970).

3. Рубин Л.Б., Еремеева О.В., Фрайкин Г.Я., Швинка Ю.Э. О существовании у микроорганизмов фотохромной системы регуляции. Доклады АН СССР, т. 210, 4, с. 971-975 (1973).

4. Федосеева Г.Е., Кару Т.И., Ляпунова Т.С., Помощникова Н.А., Мейсель М. Н. Чувствительность различных дрожжевых культур к действию низкоинтенсивного красного света. Микробиология, т. 56, в. 5, с. 792-796 (1987).

5. Tiphlova O.A., Каru T.I. Stimulation of Escherichia coli division by low-intensity monochromatic light. Photochem. Photobiol., v.48, p. 467-471 (1988).

6. Bertoloni G., Sacchetto r., Baro E., Jori G. Biochemical and morphological changes in Escherichia coli irradiated by coherent and noncoherent 632,8 nm light. J. Photochem. Photobiol. B, v. 18, p. 191-196 (1993).

7. Karu Т. Activation of metabolism of nonphotosynthesizing microorganisms with monochromatic visible (laser) light. Lasers in Life Scienses, v.7, N 1, p. 11-33 (1996).

8. Фрайкин Г.Я., Рубин Л.В., Еремеева О.В., Хургес Г.М., Горюхова Н.М., Афанасьева В. П., Градова Н.Б., Калунянц К.А., Ваганова М.С., Осипова В.Г., Фридман Я. С. Практическое использвание метода фотостимуляции развития при культивировании промышленных штаммов микроорганизмов. Прикладная биохимия и микробиология, т. 10, в. 1, с. 5-9, (1974).

9. 3ахаров С.Д., Еремеев Б.В., Перов С.Н. Сравнение эффектов лазерного воздействия на эритроциты на длинах волн 1,26 и 0,63 мкм. Краткие сообщ. по физике, 1, с. 15-16 (1989).

10. Ю. Захаров С. Д., Иванов А.В. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей. Квантовая электроника, т. 26, 3, с. 192-214 (1999).

11. Шинкаренко Н. В., Алесковский В.Б. Химические свойства синглетного молекулярного кислорода и значение его в биосистемах. Успехи химии, т. 51, в. 5, с. 713-735 (1982).

12. Porphyrin photosensitization. Ed. D.Keessel, T.J.Dougherty. N.-Y., Plenum Press, 1983.

13. Захаров С.Д., Минц Р.И., Скопинов С.А., Чудновский В.М. Структурная модель неспецифического биостимулирующего действия лазерного излучения: роль слабопоглощающих фоторецепторов и альтерации структурного состояния растворов биомолекул. В сб. “Действие электромагнитного излучения на биологические объекты и лазерная медицина (ред. В.И. Ильичев). Владивосток, изд. Дальневосточного Отд. АН СССР, 1989, с. 41-52.

14. Захаров С.Д., Скопинов С.А., Чудновский В.М., Перов С.Н., Панасенко Н. А., Вольф Е.Б., Еремеев Б.В. Первичные механизмы неспецифического воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на эритроциты с участием молекулярного кислорода. Изв. АН СССР, сер. физич., т. 54, с. 1629-1635 (1990).

Формула изобретения

1. Способ повышения продуктивности микроорганизмов, заключающийся в том, что суспензию микроорганизмов подвергают облучению оптическим излучением с длиной волны и дозой D, отличающийся тем, что спектральный состав излучения выбирают внутри полос поглощения растворенного в суспензии молекулярного кислорода, производят перемешивание суспензии в процессе облучения, либо непосредственно после него, дозу облучения рассчитывают по формуле D= D_ох/f(), где D_o = D(_o) – оптимальная доза облучения суспензии в центре _o выбранной полосы поглощения молекулярного кислорода, – вероятность поглощения фотонов в выбранном объеме суспензии, f() – контур полосы поглощения растворенного молекулярного кислорода, причем f(_o) = 1.

2. Способ повышения продуктивности микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что облучение проводят внутри инфракрасной полосы поглощения ¹_g_^3–_g(0-0) молекулярного кислорода.

3. Способ повышения продуктивности микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что концентрацию микроорганизмов в суспензии, объем и форму содержащей суспензию кюветы и геометрию облучения выбирают таким образом, чтобы обеспечить полное поглощение фотонов в облучаемом объеме.

РИСУНКИ