Патент на изобретение №2205220

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -ГИДРОКСИКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО МИКРООРГАНИЗМА И НОВЫЙ МИКРООРГАНИЗМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к получению -гидроксикислот. В частности, предусматривает получение -гидроксикислот, представленных общей формулой [II] RCH (ОН) СООН, где R означает атом водорода, необязательно замещенный C₁-С₆-алкил, необязательно замещенный С₂-С₆-алкенил, необязательно замещенный С₁-С₆-алкоксил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенную арилокси-группу или необязательно замещенный гетероцикл, в результате действия микроорганизма на -гидроксинитрилы [I], RCH(ОН)CN, в которой R определен выше. При этом происходят гидролиз и превращение -гидроксинитрилов в -гидроксикислоты [II], -гидроксикислоты [II] накапливаются в водном растворе. В качестве микроорганизма используют микроорганизм, имеющий концентрационную устойчивость к -гидроксинитрилам [I] и/или -гидроксикислотам [II] и стабильность предпочтительно в присутствии цианида. Целевой продукт затем выделяют из реакционной среды. В качестве вышеупомянутых микроорганизмов, имеющих концентрационную устойчивость к -гидроксинитрилам [I] и -гидроксикислотам [II] и достаточно высокую стабильность, используют Variovarax spp. , Arthrobacter spp. и особенно – штамм Arthrobacter NSSC104. Это дает возможность накопить -гидроксикислоты [II] с высокой концентрацией, т.е. обеспечить их эффективное получение. Прибавление цианида к реакционной системе, обеспечивающее один из вариантов способа, приводит к более эффективному получению -гидроксикислот [II]. 3 с. и 12 з.п. ф-лы, 4 табл.

Настоящее изобретение относится к способу получения -гидроксикислоты, основанному на гидролизе гидроксинитрила с применением микроорганизмов и новым микроорганизмам. Из -гидроксикислот молочная кислота полезна при употреблении в пищу, при пивоварении и в других индустриальных аспектах, а 2-гидрокси-4-метилтиомасляная кислота применяется в качестве пищевой добавки для скота.

Уровень техники
До сих пор были известны следующие способы получения -гидроксикислот [II] , использующие -гидроксинитрил [I] в качестве исходного вещества для микроорганизмов.

(1) Способ получения молочной, гликолевой и других кислот при использовании микроорганизмов, таких как Bacillus spp., Bacterizium spp., Micrococcus spp. и Brevibacterium spp., описанный в патенте Японии ShO 58-15120.

(2) Способ получения молочной, гликолевой 2-гидроксиизомасляной кислоты с использованием микроорганизмов, принадлежащих к Corynebacterium spp., раскрытый в патенте Японии Laid-open Sho 61-56086.

(3) Способ получения молочной кислоты 2-гидроксиизомасляной кислоты, 2-гидрокси-2-гидроксифенилпропионовой кислоты и миндальной кислоты с использованием микроорганизмов, таких как Pseudomonas spp., Arthrobacter spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Cocryaboros spp. и Fusarium spp., раскрытый в патенте Японии Laid-open Sho 63-222696.

(4) Способ получения лактона 2-гидрокси-3,3-диметил-4-масляной кислоты с использованием микроорганизма, такого как Arthrobacter spp., Aspergillus spp. , Bacillus spp. , Bacterizium spp., Cocryaboros spp., Corynebacterium spp. , Micrococcus spp. , Nocardia spp., Penicillium spp. и Fusarium spp., раскрытый, в патенте Японии Laid-open Sho 64-10996.

(5) Способ получения 2-гидроксиизомасляной кислоты с использованием микроорганизма, такого как Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Arthrobacter spp., и Brevibacter spp., описанный в патенте Японии Laid-open Hei 4-40897.

(6) Способ получения -гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты с использованием микроорганизма, такого как Caseobater spp., Pseudomonas spp., Arthrobacter spp., Corynebacterium spp., Brevibacterium spp., Nocardia spp., Rhodococcus spp., и Arthrobacter spp., раскрытый в патенте Японии Laid-open Hei 4-40898.

(7) Способ получения 4-метилтиомасляной кислоты с использованием микроорганизма, такого как Alcaligenes spp., Rhodococcus spp. и Goldona spp., описанный в WO 96/09403.

(8) Способ получения -гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты с использованием микроорганизма, такого как Pantosa spp., Micrococcus spp. Bacterizium spp., раскрытом в патенте Японии Laid-open Hei 8-173175.

Однако способы получения -гидроксикислот, перечисленные выше, не всегда могут быть отнесены к удовлетворительным, потому что они не могут продуцировать нужное вещество с большой концентрацией. Например, в случае молочной кислоты ее образуется только 9.8 мас.% при применении в качестве микроорганизма одного из Corynebacterlum spp. (патент Японии Laid-open Sho 61-56086), только 10 мас.% при применении одного из микроорганизмов Pseudomonas spp. (патент Японии Laid-open Sho 63-222696), и только 0.15% при применении Arthrobacter spp. (патент Японии Laid-open Sho 63-222696). В то же время оказалось, что генерация -гидроксиизомасляной кислоты с использованием одного из микроорганизмов Pseudomonas spp. протекает с выходом 0.8 мас.% (патент Японии Laid-open Sho 63-222696), образующиеся количества -гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты составляют 188 ммоль (2.8 мас.%) с использованием одного из микроорганизмов Caseobater spp. (патент Японии Laid-open Hei 4-40898), 55 ммоль, (0.8 мас.%) с использованием одного из микроорганизмов Arthrobacter spp. (патент Японии Laid-open Hei 4-40898) и 940 ммоль (14 мас. %) с использованием одного из микроорганизмов Alcaligenes spp. (WO96/09403) соответственно.

Причина низкой образующейся концентрации таких продуктов, что описано выше, заключается в том, что энзиматическая активность может снижаться в присутствии синильной кислоты (Agricultural Biological Chemistry, vol.46, page 1165, 1982), которая образуется при частичной диссоциации -гидроксинитрила в воде наряду с соответствующим альдегидом или кетоном (Chemical Reviews, vol.42, page 189, 1948). Далее необходимо также принимать во внимание, что родственный фермент инактивируется и образующимся альдегидом за очень короткое время. Для решения проблемы предотвращения такой инактивации были предложены способы, которые заключаются в добавлении либо кислых сульфит-ионов, либо дитионит-ионов (патент Японии Laid-open Hei 5-192189) или фосфит-ионов или гипофосфит-ионов (патент Японии Laid-open Hei 7-213296). Однако даже с использованием таких добавок, как описано выше, концентрация накопленной -гидроксикислоты не слишком высока.

Обычно, когда концентрация продукта остается низкой, то специалистам в данной области техники ясно, что осуществление такого промышленного процесса будет сложным и длительным. Поэтому было очень трудно реализовать эффективное производство -гидроксикислот в промышленном масштабе по способам, описанным выше. Настоящее изобретение предлагает способ накопления -гидроксикислот с высоким уровнем концентрации с использованием микроорганизмов и способ эффективного продуцирования -гидроксикислот.

Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения провели скрининговое исследование для того, чтобы найти микроорганизмы, имеющие преимущества для промышленности, которые энзиматически превращают -гидроксинитрилы общей формулы [I] RCH(OH)CN, где R означает атом водорода, необязательно замещенный С₁-С₆-алкил, необязательно замещенный С₂-С₆-алкенил, необязательно замещенный С₁-С₆-алкоксил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенную арилокси-группу или необязательно замещенный гетероцикл, в -гидроксикислоты общей формулы [II] RCH(OH)COOH, в которой R обозначен выше, причем активность превращения нитрила устойчива к инактивирующему влиянию и -гидроксинитрила [I], и -гидроксикислоты [II], и такая активность превращения устойчиво сохраняется в течение долгого времени, а также сохраняется способность к накоплению -гидроксикислоты [II] с высоким уровнем концентрации.

В результате авторы наконец нашли такую требуемую, как это описано выше, активность у микроорганизмов, которые принадлежат к Variovorax spp. и Arthrobacter spp. Более того они установили, что описанная выше энзиматическая активность может быть улучшена прибавлением в реакционную среду цианидсодержащего вещества общей формулы [III] Mm(CN)n, где М означает атом водорода, ион аммония или ион металла, a m и n имеют значения 1 или 3, для достижения целей настоящего изобретения.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения -гидроксикислоты [II], отличающемуся тем, что -гидроксикислота [II] получается, накапливается и аккумулируется в водном растворителе в присутствии микроорганизмов, имеющих как концентрационную устойчивость и стойкость к -гидроксинитрилу [I], так и к и/или -гидроксикислоте [II] в способе получения -гидроксикислоты [II], в котором -гидроксинитрил [I] гидролизуется в микробиологической реакции, тем самым превращаясь в -гидроксикислоту [II], причем в описанную реакционную систему добавляется цианидное соединение.

Настоящее изобретение далее описано детально.

В качестве используемых микроорганизмов можно использовать микроорганизм без особого ограничения, если этот микроорганизм сохраняет свою концентрационную устойчивость к либо -гидроксинитрилам, либо к -гидроксикислотам в течение времени, необходимого для достижения цели настоящего изобретения, и обладает надежностью в сохранении ферментативной активности в течение долгого периода. В качестве примеров таких микроорганизмов приводятся такие микроорганизмы, как штамм Variovorax paradoxus IAM 12374 линия и штамм Arthrobacter NSSC 104 (FERM P-15424). Штамм Variovorax paradoxus IAM 12374 можно легко получить в Институте микробиологии Токийского университета (IAM). В то же время штамм Arthrobacter NSSC 104 был недавно выделен из природных источников авторами настоящего изобретения, депонирован и детально описан.

Депонирование FERM ВР-5829 (Передана из Bikouken Microorganism, депонирование Р-15424).

Сведения о депонировании: отечественное депонирование было произведено 6 февраля 1996 года и международное депонирование было произведено 20 февраля 1997 года.

Место депонирования: 1-3, Higashi-1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi, Japan.

Организация депонирования: Институт биотехнологии и промышленной технологии, Академия промышленной технологии, Министерство труда и промышленности.

В то же время микробиологические свойства штамма Arthrobacter NSSC 104 следующие:
Форма: полиморфная бацилла
Проба на окраску по Граму: положительная
Цикл палочек кокки: положительный
Образование спор: отрицательно
Подвижность: отрицательная
Диаминокислота в стенке клетки: лизин
Требование к наличию кислорода: аэробное
Образование оксидазы: отрицательное
Образование каталазы: положительное
Деструкция ДНК: положительная
Разжижение желатина: положительное
Крахмальное разрушение: положительное
Казеиновое разрушение: положительное.

Требование к наличию витамина: отрицательное
Гликолильный тест: отрицательный (по ацетильному типу)
Хиноновый тип: МК-9 (Н2)
Состав сахара в клетки стенки:
галактоза +
глюкоза +
После оценки микробиологических свойств штамма NSSC 104 по Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1986) штамм был идентифицирован как бактериальный штамм, принадлежащий к Arthrobacter ssp. Штамм был депонирован депозитным номером, указанным выше, в Институте биотехнологии и промышленной технологии. Академии промышленной технологии, Министерства труда и промышленности.

Далее описываются предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Культивация микроорганизмов, используемых в настоящем изобретении, осуществляется в стандартной среде, содержащей вещество, индуцирующее фермент, если это необходимо, источник углерода, усвояемый микроорганизмами, источник азота, неорганические ионы и органические питательные вещества. В качестве примера для ферментативно индуцированной субстанции, применяемой в настоящем изобретении, приводятся нитрильные соединения, включающие изобутиронитрил и ему подобные, и циклические амидные соединения, включающие -капролактамы и ему подобные. В качестве источников углерода используются, если это необходимо, углеводы, включающие глюкозу и ей подобные, спирты, включающие этанол и ему подобные соединения, органические кислоты и т.д. В качестве источника азота используются аминокислоты, нитраты, аммонийные соли и им подобные. В качестве неорганических ионов используются в зависимости от требований фосфат-ионы, ионы калия, ионы магния, сульфат-ионы, ионы железа и им подобные. В качестве органических питательных веществ, если это необходимо, используются витамины, аминокислоты и т.д. и замоченное зерно, содержащее те же вещества, дрожжевые экстракты, полипептон, бульонные экстракты и им подобные. Культивация проводится в должным образом поддерживаемых условиях: рН в области от 6 до 9, температура в области от 25 до 37^oС и аэробные условия.

Реакция гидролиза, вызываемая действием микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением, протекает посредством получения культивированных клеток микроорганизмов, как это описано выше, с получением обработанных клеток микроорганизмов, таких как иммобилизованные клетки, неочищенные ферменты и иммобилизованные ферменты и с осуществлением контакта обработанных клеток с -гидроксинитрилом [I] в водной среде. Когда иммобилизуют клетки микроорганизмов или ферменты, можно применять обычный метод иммобилизации, такой как метод связывания переносчика или метод ловушек. Когда получают неочищенные ферменты, то могут быть использованы обычные методы их очистки, такие как высаливание сульфатом аммония и хроматография, после дробления клеток микроорганизмов ультразвуком, гомогенизатором высокого давления или подобными методами. Для реакции гидролиза используют клетки микроорганизмов в дозах от 0,01% до 10% от веса сухого остатка, после полного прохождения реакции клетки могут быть использованы повторно посредством их выделения, фильтрации, центрифугирования и метода концентрации с помощью ультрафильтрационных мембран. В качестве водного растворителя могут быть использованы вода и водный раствор, содержащий минеральные составляющие, такие как буфер и органический растворитель, в результате чего водный раствор может расслоиться на два слоя.

В настоящем изобретении R, содержащийся в -гидроксинитриле общей формулы [I] RCH(OH)CN, означает атом водорода, необязательно замещенный С₁-С₆-алкил, необязательно замещенный С₂-С₆-алкенил, необязательно замещенный С₁-С₆-алкоксил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенную арилокси-группу или необязательно замещенный гетероцикл.

В более избирательном плане R означает водород, С₁-С₆-алкил, такой как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил и гексил;
С₁-С₆-алкилтио С₁-С₆-алкил, такой как метилтиометил, 1-метилтиоэтил, 2-метилтиоэтил, 1-метилтиопропил, 2-метилтиопропил, 3-метилтиопропил, 1-метилтиобутил, 2-метилтиобутил, 3-метилтиобутил, 4-метилтиобутил, 6-метилтиогексил, этилтиометил, 1-этилтиоэтил, 2-этилтиоэтил, 1-этилтиопропил, 2-этилтиопропил, 3-этилтиопропил, 1-этилтиобутил, 2-этилтиобутил, 3-этилтиобутил, 4-этилтиобутил, пропилтиометил, 1-пропилтиоэтил, 2-пропилтиоэтил, 1-пропилтиопропил, 2-пропилтиопропил, 3-пропилтиопропил, 1-метилтиоизопропил, 1-этилизопропил, 1-пропилтиобутил, 2-пропилтиобутил, 3-пропилтиобутил, 4-пропилтиобутил, пропилтиометил, 1-пропилтиоэтил, 2-пропилтиоэтил, 1-изопропилтиопропил, 2-изопропилтиопропил, 3-изопропилтиопропил, 1-изопропилтиобутил, 2-изопропилтиобутил, 3-изопропилтиобутил и 4-изопропилтиобутил,
гидрокси -С₁-С₆-алкил, такой как гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, 2-гидроксиэтил, 1-гидроксипропил, 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 1-гидроксибутил, 2-гидроксибутил и 3-гидроксибутил,
карбокси-С₁-С₆-алкил, такой как карбоксиметил, 2-карбоксиэтил, 1-карбоксиэтил, 3-карбоксипропил, 2-карбоксипропил и 1-карбоксипропил,
карбамоил-С₁-С₆-алкил, такой как карбамоилметил, 1-карбамоилэтил, 2-карбамоилэтил, 1-карбамоилпропил, 2-карбамоилпропил и 3-карбамоилпропил,
меркапто-С₁-С₆-алкил, такой как меркаптометил, 1-меркаптоэтил, 2-меркаптоэтил, 1-меркаптопропил и 3-меркаптопропил,
карбамидино-С₁-С₆-алкил, такой как карбамидинометил, 1-карбамидиноэтил, 2-карбамидиноэтил, 1-карбамидинопропил, 2-карбамидинопропил и 3-карбамидинопропил,
необязательно замещенный С₁-С₆-арилалкил, такой как бензил, 2-хлоробензил, 4-метилбензил, 4-метоксибензил, 3-нитробензил, 4-гидроксибензил, -метилбензил и ,-диметилбензил,
С₁-С₆-алкил, замещенный гетероциклом, таким как 3-индолилметил, 2-индолилметил, 2-(3-индолил)этил, 1-(3-индолил)этил, 2-индолилметил, 2-(2-индолил)этил, 1-(2-индолил)этил, 4-имидазолилметил, 2-имидазолилметил, 1-(4-имидазолил)этил, 2-(4-имидазолил)этил,
необязательно замещенный С₂-С₆-алкенил, такой как винил, пропенил, изопропенил, аллил, 1-хлораллил, 2-хлораллил и кротил,
необязательно замещенную С₁-С₆-алкокси-группу, такую как метокси-, этокси-, пропокси- и трифторметокси-группу,
необязательно замещенный арил, такой как фенил, 2-хлорофенил, п-толил, 3-нитрофенил, 4-цианофенил, -нафтил и -нафтил,
необязательно замещенную арилокси-группу, такую как фенилокси-, 2-хлорофенилокси-, п-толилокси-, 3-нитрофенокси-, -нафтилокси- и -нафтилокси-группу, или
от 3-х до 7-ми членный гетероцикл, который включает по крайней мере один из атомов, выбранных из атомов азота, кислорода и серы как гетероатомов, такой как 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-хлоро-3-пиридил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пирролил, 3-пирролил, 2-фурил и 3-фурил.

В качестве более конкретных примеров -гидроксинитрилов [I] приводят нитрил молочной кислоты, миндальной кислоты, 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил, и им подобные.

-Гидроксинитрил [I] используется в реакции в концентрации от 0.1 до 50 мас. % и далее может прибавляться в течение всего процесса реакции по мере необходимости. Величину рН реакционной смеси выдерживают в пределах от 5 до 11, используя либо подходящий буфер либо кислоту и щелочь. Реакция предпочтительно протекает при температуре от 4 до 50^oС, более предпочтительно от 20 до 40^oС. В качестве примеров цианидных соединений, используемых в настоящем изобретении и представленных общей формулой [III], приведены: циановодород, цианид натрия, цианид калия, цианид кальция, цианид магния, цианид tarium, цианид аммония и им подобные. Цианиды обычно используются в реакциях в концентрациях от 0.4 до 1000 мМ, предпочтительно от 4 до 500 мМ, и могут быть добавлены дополнительно в процесс реакции, если это необходимо.

Следовательно, -гидроксикислота [II] , соответствуя -гидроксинитрилу [I] , который прибавляют за период времени от 6 до 120 час, накапливается в виде ее аммонийной соли в концентрации 15 мас.% и более. Клетки микроорганизмов, применяемые в реакции, могут быть использованы повторно для реакции гидролиза без существенной потери ферментативной активности.

Полученный продукт выделяют и очищают обычно используемыми способами, такими как концентрирование и экстракции, и продукт может быть отделен от соединений аммония с применением методов экстракции органическим растворителем, термическим разложением и им подобными, если это требуется. В качестве примеров продукта, который является -гидроксикислотой [II], приведены молочная кислота, миндальная кислота, 2-гидрокси-4-метилтиомасляная кислота и им подобные.

Наилучшие варианта осуществления изобретения
Настоящее изобретение далее объяснено детально на следующих примерах.

Пример 1
Среду объемом 2 мл, содержащую 0.3% бульона, 0.5% пептона и 0.5% хлорида натрия, помещают в пробирку и другую среду объемом 20 мл, состав которой указан ниже, в 100 мл склянку треугольной формы с петлями, затем обе среды стерилизуют в течение 15 мин при 121^oС, одну петлю штамма Variovorax paradoxus IAM 12374 вносят в пробирку, содержащую 2 мл среды, и штамм культивируют при встряхивании в течение ночи при 30^oС, затем переносят 0.2 мл среды в склянку треугольной формы с петлями. Перенесенную среду культивируют при 30^oС в течение 3 дней. Затем культивационную среду центрифугируют, полученные клетки микроорганизмов промывают физиологическим раствором. Затем клетки микроорганизмов суспендируют в растворе 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.5) с образованием 0.1 мас.% раствора, считая на сухой остаток. Затем в раствор фосфатного буфера прибавляют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил для получения раствора с конечной концентрацией 160 мМ и проводят гидролиз при 30^oС при умеренном встряхивании. После этого тоже количество 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрила прибавляют 9 раз к буферному раствору в течение 12 час, так что общее время прохождения этой реакции равно 120 час. После завершения реакции реакционную смесь центрифугируют для удаления клеток микроорганизмов, а концентрацию 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты, содержащейся в супернатанте, определяют с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (колонка: TSK гель ODS-80TM; носитель: ацетонитрил/вода/трифторуксусная кислота=20/80/0.1). Тем самым подтверждают уровень накопления 2-гидрокси-4-метилтиобутирата аммония, составляющего 25 мас.%. Найденный выход составляет 98%.

Дрожжевой экстракт – 0.5%
Глицерин – 0.5%
Дигидрофосфат калия – 0.1%
Моногидрофосфат калия – 0.1%
NaCl – 0.02%
Сульфат натрия – семиводный гидрат – 0.02%
-Капролактам – 0.5%
рН – 7.2 (регулируется 2N гидроксидом натрия)
Пример 2
Среду объемом 2 мл, содержащую 0.3% бульона, 0.5% пептона и 0.5% хлорида натрия, помещают в пробирку и другую среду объемом 20 мл, состав которой указан ниже, в 100 мл склянку треугольной формы с петлями, затем обе среды стерилизуют в течение 15 мин при 121^oС. Одну петлю штамма Arthrobacter spp. NSSC 104 вносят в пробирку, содержащую 2 мл среды, и штамм культивируют при встряхивании в течение ночи при 30^oС, затем переносят 0.2 мл среды в склянку треугольной формы с петлями. Перенесенную среду культивируют при 30^oС в течение 5 дней при постоянном встряхивании. Затем культивационную среду центрифугируют, полученные клетки микроорганизмов промывают физиологическим раствором. Затем клетки микроорганизмов суспендируют в растворе 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.5) с образованием его 0.6 мас.% раствора, считая на сухой остаток. Затем в раствор фосфатного буфера прибавляют нитрил молочной кислоты для получения раствора с конечной концентрацией 124 мМ и проводят реакцию гидролиза при 30^oС при умеренном встряхивании. После этого то же количество нитрила молочной кислоты прибавляют 20 раз к буферному раствору в течение 5 час, так что общее время прохождения этой реакции равно 100 час. После завершения реакции реакционную смесь центрифугируют для удаления клеток микроорганизмов, а концентрацию молочной кислоты, содержащейся в супернатанте, определяют с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (колонка: TSK гель ODS-80TM; носитель: ацетонитрил/вода/трифторуксусная кислота= 5/95/0.1. Тем самым подтверждают уровень накопления аммонийлактата, составляющего 23 мас.%. Найденный выход составляет 93%.

Вытяжка круто замоченного зерна – 1.0% (стерилизовано отдельно)
Сахороза – 1.0% (стерилизовано отдельно)
Дигидрофосфат калия – 0.1%
Моногидрофосфат калия – 0.1%
NaCl – 0.02%
Сульфат магния семиводный гидрат – 0.02%
Сульфат железа (II) – 0.001% (стерилизовано отдельно)
-Капролактам – 0.5%
рН – 7.2% (регулируется 2N гидроксидом натрия)
Пример 3
По тому же самому способу, описанному в Примере 2, штамм Arthrobacter spp. NSSC 104 суспендируют в растворе 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.5) с образованием его 4 мас.% раствора, считая на сухой остаток. Затем в раствор фосфатного буфера прибавляют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил для получения раствора с конечной концентрацией 200 мМ и проводят реакцию гидролиза при 30^oС при умеренном встряхивании. После этого тоже количество 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрила добавляют к гидролизному раствору еще 7 раз с интервалом 1 час и далее 8 раз с интервалом 1.5 час, так что общее время прохождения этой реакции равно 19 час. После завершения реакции реакционную смесь центрифугируют для удаления клеток микроорганизмов, а концентрацию 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты, содержащейся в супернатанте, определяют также, как это описано в Примере 1. Тем самым подтверждают уровень накопления 2-гидрокси-4-метилтиобутирата аммония, составляющего 49 мас.%. Найденный выход составляет 96%.

Пример 4
По тому же самому способу, описанному в Примере 2, штамм Arthrobacter spp. NSSC 104 суспендируют в дистиллированной воде с образованием его 3.2 мас. % раствора, считая на сухой остаток. Затем к суспензии постоянно прибавляют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил со скоростью 0.46 г/час на 1 г клеток микроорганизма в расчете на массу сухого остатка. Затем суспензию гидролизуют при 30^oС в течение 20 час, поддерживая рН в области 7.4-7.6 раствором 0.5 М водного аммиака. После завершения реакции полученную суспензию центрифугируют для удаления клеток микроорганизмов. Клетки микроорганизма собирают, затем промывают 3 раза, используя 40-кратное по весу количество дистиллированной воды, и промытые клетки вновь суслендируют в дистиллированной воде в том же количестве, которое использовалось при первом промывании и используют для второй реакции. Получение клеток микроорганизма и промывание клеток микроорганизма в процессе второй реакции осуществляют по методу, используемому для первой реакции. После повторения описанной выше методики реакции 10 раз определяют концентрацию 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты в супернатанте для каждой репликации по методу, описанному в Примере 1. Полученные данные приведены в табл. 1.

Пример 5
По тому же самому способу, описанному в Примере 2, штамм Arthrobacter spp. NSSC 104 суспендируют в 0.1 М водном растворе цианида натрия с образованием его 5 мас.% раствора, считая на сухой остаток. Затем к раствору постоянно прибавляют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил, затем проводят реакцию гидролиза при 30^oС в течение 10 час, поддерживая рН в области 7.4-7.6 с помощью рН контроллера. После завершения реакции полученный раствор центрифугируют для удаления клеток микроорганизма, а концентрацию молочной кислоты, содержащейся в супернатанте, определяют по тому же методу, который описан в Примере 2. Для сравнения также контролировали и другие реакции, в которых применялось добавление цианида натрия. Результаты показаны в табл. 2.

Пример 6
По тому же самому способу, описанному в Примере 2, штамм Arthrobacter spp. NSSC 104 суспендируют в 0.1 М водном растворе цианида калия с образованием его 5 мас.% раствора, считая на сухой остаток. Затем к раствору постоянно прибавляют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил, затем проводят реакцию гидролиза при 30^oС в течение 10 час, поддерживая рН в области 7.4-7.6 с помощью рН контроллера. После завершения реакции полученный раствор центрифугируют для удаления клеток микроорганизма, а концентрацию 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты, содержащейся в супернатанте, определяют по тому же методу, который описан в Примере 1. Для сравнения также контролировали и другие реакции, в которых применялось добавление цианида калия. Результаты показаны в табл. 3.

Пример 7
По тому же самому способу, описанному в Примере 2, штамм Arthrobacter spp. NSSC 104 суспендируют в 40 мМ водного раствора циановодорода с образованием его 5 мас.% раствора, считая на сухой остаток. Затем к раствору постоянно прибавляют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил, затем проводят реакцию гидролиза при 30^oС в течение 10 час, поддерживая рН в области 7.4-7.6 с помощью рН контроллера. После завершения реакции полученный раствор центрифугируют для удаления клеток микроорганизма, а концентрацию 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты, содержащейся в супернатанте, определяют по тому же методу, который описан в Примере 1. Для сравнения также контролировали и другие реакции, в которых применялось добавление циановодорода. Результаты показаны в табл. 4.

Пример для сравнения
Культивирование и каталитическая реакция штамма Arthrohacter spp. NSSC 104 проводится по способу культивации и методу гидролиза, описанным в патенте Японии Laid-open Hei 4-40898.

(1) Среда (размерность масс/объем)
Глицерин – 2%
Дрожжевой экстракт – 0.3%
Дигидрофосфат калия – 0.68%
Моногидрофосфат калия – 0.71%
Сульфат натрия – 0.28%
Хлорид магния – 0.04%
Хлорид кальция – 0.004%
Сульфат магния – 0.0004%
Хлорид железа (II) – 0.00006%
Сульфат цинка – 0.00005%
Агар – 1.8%
-Хлоропропионитрил – 0.05%
рН – 7.5%
(2) Условия культивации
Одну петлю клеток микроорганизма извлекают из среды и помещают в среду пластинки агара, затем культивируют при 30^oС в течение 48 час в анаэробных условиях.

(3) Реакция гидролиза
Клетки микроорганизмов собирают из среды пластинки агара и затем промывают 3 раза 0.05М фосфатным буфером (рН 7.5) с использованием центрифугирования. Осажденные клетки вновь суспендируют в 0.05М фосфатном буфере в количестве 1.5 мл, поддерживая значение ОD₆₅₀ до 25, прибавляют 100 мМ 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрила до его конечной концентрации и затем выдерживают реакционную смесь при 25^oС в течение 20 час при встряхивании. После завершения реакции полученный раствор центрифугируют для удаления клеток микроорганизма, а концентрацию 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты в супернатанте определяют с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения (колонка: TSK гель ODS-80ТМ; носитель: ацетонитрил/вода/трифторуксусная кислота= 20/80/0.1). Концентрация 2-гидрокси-4-метилтиомасляной кислоты составляет 0.01 мМ.

В патенте Японии Laid-open Hei 4-40898 описано, что штамм Arthrobacter HR4 позволяет аккумулировать 2-гидрокси-4-метилтиомасляную кислоту до уровня 5 мМ по методу культивации и методу гидролиза, описанным выше. Таким образом, ясно показано, что штамм Arthrobacter NSSC 104 является совершенно отличным от штамма Arthrobacter HR4.

Преимущества настоящего изобретения
Согласно настоящему изобретению получение -гидроксикислоты [II] может быть эффективно осуществлено применением используемой ферментативной реакции микроорганизмов, которые можно использовать повторно и которые обладают устойчивостью и стабильностью по отношению к -гидроксинитрилу [I] и/или -гидроксикислоте [II] при высоком уровне концентрации. Кроме того, получение -гидроксикислоты [II] может быть осуществлено с более эффективным результатом при добавлении цианидного соединения в реакционную систему.

Промышленное использование изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения -гидроксикислоты [II] в индустриальном масштабе при применении -гидроксинитрила как исходного вещества и при применении ферментативной реакции микроорганизмов, которые обладают и концентрационной устойчивостью и стойкостью по отношению к -гидроксинитрилу [I] и/или к -гидроксикислоте [II], что является значительным открытием для родственных областей промышленности.

Формула изобретения

1. Способ получения -гидроксикислоты общей формулы II RCH(OH)COOH,
где R означает водород, С₁-С₆-алкил, С₁-С₆-алкилтио-С₁-С₆-алкил, гидрокси-С₁-С₆-алкил, карбокси-С₁-С₆-алкил, карбамоил-С₁-С₆-алкил, меркапто-С₁-С₆-алкил, карбамидино-С₁-С₆-алкил, С₁-С₆-арил, необязательно замещенный заместителем, выбранным из группы, содержащей хлор, метил, метокси, нитро, гидрокси, С₁-С₆-алкил, замещенный индолилом или имидазолилом, С₂-С₆-алкенил, необязательно замещенный хлором, С₁-С₆-алкоксил, необязательно замещенный фтором, арил, необязательно замещенный хлором, метилом, нитро, циано, арилокси, необязательно замещенный хлором, метилом, нитро, 3-7-членный гетероцикл, включающий, по крайней мере, один из атомов, выбранный из азота, кислорода и серы, отличающийся тем, что -гидроксикислота общей формулы II, где R имеет указанные выше значения, образуется и накапливается в водном растворе в присутствии микроорганизмов, обладающих как концентрационной устойчивостью, так и стойкостью к -гидроксинитрилу общей формулы I
RCH(OH)CN,
где R имеет указанные выше значения,
и/или к -гидроксикислоте общей формулы II, в которой R определен выше, в процессе превращения -гидроксинитрила общей формулы I, в которой R определен выше, в -гидроксикислоту общей формулы II, в которой R определен выше, в результате гидролитической реакции, проходящей под действием ферментативной активности микроорганизмов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R означает атом водорода, необязательно замещенный С₁-С₆-алкил или необязательно замещенный фенил.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R означает атом водорода, С₁-С₆-алкилтиоалкил, С₁-С₆-гидроксиалкил или фенил.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем соединения общей формулы I
RCH(OH)CN,
где R имеет указанные выше значения, выбирают из группы соединений, состоящей из нитрила молочной кислоты, нитрила миндальной кислоты и 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрила.

5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем микроорганизм, обладающий концентрационной устойчивостью и стойкостью к соединениям, представленным общей формулой I
RCH(OH)CN,
и/или соединениям, представленным общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
относится к Variovarax spp.

6. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем микроорганизм, обладающий концентрационной устойчивостью и стойкостью к соединениям, представленным общей формулой I
RCH(OH)CN,
и/или соединениям, представленным общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
относится к Arthrobacter spp.

7. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем микроорганизм, обладающий концентрационной устойчивостью и стойкостью к соединениям, представленным общей формулой I
RCH(OH)CN,
и/или соединениям, представленным общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
относится к штамму Arthrobacter spp. NSSC 104.

8. Штамм Arthrobacter spp. NSSC 104 (FERM P-15424), обладающий способностью к трансформации -гидроксинитрила общей формулы I
RCH(OH)CN
в -гидроксикислоту общей формулы II
RСН(ОН)СООН,
в которых R имеет значения, указанные в п. 1.

9. Способ получения -гидроксикислоты общей формулы II
RCH(OH)COOH,
в которой R определен выше,
отличающийся тем, что осуществляют гидролиз соединений, представленных общей формулой I
RCH(OH)CN,
в которой R определен выше,
посредством использования ферментативной активности микроорганизма, определенного в п. 1, причем процесс ведут в присутствии цианидных соединений, представленных общей формулой III M_m(CN)_n,
в которой М означает атом водорода, ион аммония или ион металла;
m и n независимо принимают значения 1, 2 и 3.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R означает атом водорода, необязательно замещенный С₁-С₆-алкил или необязательно замещенный фенил.

11. Способ по п. 9 или 10, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R означает атом водорода, С₁-С₆-алкилтиоалкил, С₁-С₆-гидроксиалкил или фенил.

12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем соединения, представленные общей формулой I
RCH(OH)CN,
в которой R определен выше,
выбирают из группы соединений, включающей нитрил молочной кислоты, нитрил миндальной кислоты и 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил.

13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем микроорганизм является микроорганизмом, принадлежащим к Variovarax spp.

14. Способ по п. 9, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH(OH)COOH,
где R имеет указанные выше значения,
причем микроорганизм является микроорганизмом, принадлежащим к Arthrobacter spp.

15. Способ по п. 9, отличающийся тем, что получают соединения, представленные общей формулой II
RCH (ОН) СООН,
где R имеет указанные выше значения, причем микроорганизм является микроорганизмом, принадлежащим к штамму Arthrobacter NSSC 104.

Приоритеты по пунктам:
29.02.1996 по пп. 1-8;
10.12.1996 по пп. 9-15.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за
поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.02.2010

Дата публикации: 10.01.2011