Патент на изобретение №2205218

(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК P31NC, КОДИРУЮЩАЯ 125 АМИНОКИСЛОТНЫЙ НУКЛЕОКАПСИДНЫЙ БЕЛОК ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЕГО ЭКСПРЕССИЮ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ E.COLI

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано в диагностике заболеваний свиней. Сконструирована in vitro рекомбинантная плазмидная ДНК p31NC, кодирующая полипептид RNC, в котором аминокислотная последовательность Met Arg Gly Ser His His His His His His Ile Pro своим С-концом соединена с последовательностью нуклеокапсидного белка (NC-белка) вируса РРСС. Плазмидная ДНК состоит из химически регулируемого (IPTG) промотора/оператора фага Т5, синтетического рибосом-связывающего сайта, терминатора транскрипции фага лямбда, гена -лактамазы и BamHI/HindIII-фрагмента, кодирующего 125 аминокислотный NC-белок вируса РРСС. Конструкция обеспечивает эффективный биосинтез полипептида. Полученный рекомбинантный полипептид обладает антигенными свойствами вируса РРСС. Полученная плазмидная конструкция обеспечивает IPTG-индуцируемый биосинтез рекомбинантного антигена вируса РРСС в клетках бактерий Е.coli. Использование изобретения позволяет расширить арсенал синтетических полипептидов для изготовления высокочувствительных и специфичных средств диагностики РРСС для использования на территории, где циркулирует популяция вируса, вызвавшая это заболевание. 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую нуклеокапсидный белок (NC-белок) вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) под контролем индуцибельного промотора, обусловливающего биосинтез полипептида. Рекомбинантная плазмидная ДНК p31NC кодирует полипептид NC, в котором аминокислотная последовательность MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisIlePro своим С-концом соединена с последовательностью NC-белка вируса РРСС. Плазмидная ДНК состоит из химически регулируемого (IPTG) промотора/оператора фага Т5, синтетического рибосом-связывающего сайта, терминатора транскрипции фага лямбда, гена -лактамазы и фрагмента, кодирующего МС-белок вируса РРСС. Конструкция обеспечивает эффективный биосинтез полипептида. Полученный рекомбинантный белок обладает антигенными свойствами вируса РРСС. Полученная плазмидная конструкция обеспечивает IPTG-индуцируемый биосинтез рекомбинантного антигена вируса РРСС в клетках бактерий E.coli. Предлагаемое изобретение может быть использовано в диагностических серологических исследованиях.

Вирус РРСС-этиологический агент заболевания, которое характеризуется репродуктивными проблемами взрослого поголовья, респираторными расстройствами у поросят и наносит значительный экономический ущерб. Геном вируса представляет собой одноцепочечную РНК-молекулу положительной полярности размером около 15000 нуклеотидов. Известны две группы вируса РРСС, которые характеризуются значительным уровнем отличий – американская и европейская (1).

Важное наблюдение было сделано при сравнении антигенных характеристик вирусов из разных групп. Установлено, что сыворотки, полученные на европейские изоляты, значительно хуже реагировали с американскими изолятами вируса, а сыворотки, полученные на американские изоляты, в некоторых случаях вообще не реагировали с изолятами вируса европейской группы. Продемонстрирована возможность серодифференциации штаммов из различных серогрупп с использованием моноклональных антител (2).

В дополнение к серологическим различиям имеется все возрастающее количество свидетельств, подтверждающих различия на уровне нуклеотидной структуры РНК вируса. Различия касаются не только вариаций в нуклеотидной и аминокислотной структуре, но и размеров вирусных белков. Так, размер NC-белка американских штаммов составляет 123 аминокислоты, а размер NC-белка европейских штаммов составляет 128 аминокислот.

Известно, что уровень экспрессии NC-белка в инфицированных клетках очень высок и его количество составляет от 20 до 40% белка вириона. Большинство антител, образующихся в организме во время РРСС-инфекции, специфичны для NC-белка, т.е. данный белок является наиболее приемлемым субъединичным антигеном для детекции вирусспецифических антител. Антитела, специфичные для NC-белка, появляются в организме на 14 день после инфекции и детектируются в течение 6 месяцев. Установлено также, что в структуре NC-белка имеются как консервативные эпитопы, общие для представителей обеих геногрупп, так и вариабельные, характерные для конкретной геногруппы. Поэтому использование рекомбинантного NC-белка в качестве антигена позволяет с одной стороны детектировать вирусспецифические антитела против всех возможных штаммов вируса, а с другой стороны осуществлять их серодифференциацию. Другие преимущества использования рекомбинантного белка в качестве антигена связаны с аспектами экономичности, технологичности и биологической безопасности. Вирус РРСС принадлежит к тем вирусным агентам, которые репродуцируются лишь на нескольких культурах клеток с небольшими титрами и в силу биологических особенностей вируса плохо поддаются очистке. Замена нативного инфекционного вируса рекомбинантным белком позволяет значительно упростить технологию, уменьшить стоимость получения антигена и производить биологически безопасные диагностические наборы.

При проведении молекулярной характеризации отечественных изолятов вируса РРСС нами установлено, что они принадлежат к европейской группе, но уровень отличий на уровне аминокислотной последовательности достигает 16%, а размер NC-белка отличается от аналогичного показателя как американских (123 аминокислоты), так и европейских штаммов (128 аминокислот) и составляет 125 аминокислот (3).

Данные структурные особенности отечественных изолятов вируса, касающиеся нуклеокапсида, одного из наиболее консервативных вирусных белков, несомненно выражаются ив их измененных антигенных характеристиках по сравнению с соответствующими характеристиками NC-белка западно-европейских и американских изолятов вируса. В свою очередь измененные антигенные характеристики не могут не влиять на способность антигена детектировать антитела в серологических реакциях.

Таким образом, при разработке диагностических тестов представляется целесообразным использование в качестве антигена вирусного белка с антигенными характеристиками, аналогичными характеристикам антигена в исследуемой популяции вируса. Антигенные свойства самого NC-белка и особенности патогенеза вируса в инфицированных клетках убедительно обосновывают выбор именно этого компонента вируса в качестве наиболее предпочтительного антигена для детекции антивирусных антител.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая NС-белок вируса РРСС размером 128 аминокислот и система его экспрессии в клетках насекомых. Методом непрямой ELISA было показано, что данный белок способен детектировать вирусспецифические антитела в сыворотке крови вакцинированных животных с чувствительностью, близкой к 100% (4).

Основным недостатком данного решения является использование для конструирования экспрессирующей плазмиды структуры NC-белка западно-европейского генотипа вируса РРСС, которая существенно отличается от структуры NC-белка отечественных изолятов.

Другим недостатком является использование технологически сложной и дорогостоящей бакуловирусной системы экспрессии, которая обычно используется для получения гликозилированных продуктов. В случае NC-белка вируса РРСС применение этой системы не оправдано, так как нативный NC-белок не подвергается процессу гликозилирования в инфицированных клетках.

В задачу создания настоящего изобретения входило конструирование in vitro новой рекомбинантной плазмиды, кодирующей NC-белок отечественных изолятов вируса РРСС под контролем индуцибельного промотора, обусловливающего биосинтез полипептида в клетках бактерий Escherichia coli, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вирусспецифических антител и специфически взаимодействующих с поли- и моноклональными антителами к вирусу РРСС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала синтетических полипептидов для изготовления высокочувствительных и специфичных средств диагностики РРСС для использования на территории Российской Федерации, где циркулирует популяция вируса, вызвавшая это заболевание.

Указанный технический результат достигнут тем, что сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК p31NC, кодирующая 125 аминокислотный NC-белок вируса РРСС, который индуцирует образование вирусспецифических антител и специфически взаимодействует с поли- и моноклональными антителами против вируса РРСС и обеспечивает высокий уровень его биосинтеза в клетках бактерий E. coli.

Кодируемый плазмидой p31NC полипептид содержит полную аминокислотную последовательность МС-белка, соединенную своим N-концом с полигистидиновым трактом, который используется для аффинной очистки рекомбинантного продукта.

Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая полипептид NC, характеризуется следующими признаками:
кодирует аминокислотную последовательность гибридного белка:
MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisIlePro-NC-белок,
содержит
HindIII/BamHI-фрагмент ДНК плазмиды pQE31, включающего промотор/оператор фага Т5, синтетический рибосом-связывающий сайт, терминатор транскрипции фага лямбда и в качестве генетического маркера ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p31NC клеток бактерий E.coli к ампициллину;
содержит также
BamHI/Hindlll-фрагмент, кодирующий 125 аминокислотный NС-белок вируса РРСС.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:
– фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды p31NC;
– фиг. 2 – нуклиотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность 125 аминокислотного NC-белка вируса РРСС.

Синтетический ген, кодирующий NC-белок вируса РРСС, получают амплификацией фрагмента генома вируса (ген NC-белка) в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров, в структуре которых содержатся сайты кливажа для эндонуклеаз BamHI и HindIII. Таким образом, в процессе амплификации гена NC-белка осуществляется олигонуклеотид – направленный мутагенез с образованием синтетического фрагмента, фланкированного сайтами BamHI и HindIII. Далее проводят клонирование амплифицированного фрагмента в плазмиде pGEM, так как исходный материал содержит гетерогенную вирусную популяцию. Для клонирования проводят рестрикцию плазмиды и фрагмента эндонуклеазами BamHI и HindIII с последующим лигированием. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM109. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и скрининг колоний проводят BamHI/HindIII рестрикцией. Структура фрагмента подтверждается определением нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК между сайтами BamHI и HindIII.

Для конструирования экспрессирующей плазмиды р31МС плазмидную ДНК pGEM-NC линеаризуют эндонуклеазами BamHI и HindIII и из рестрикционной смеси фрагмент гена NC-белка выделяют электрофорезом в 4% полиакриламидном геле с последующей элюцией. С другой стороны ДНК плазмиды рQЕ31 линеаризуют рестриктазами BamHI и HindIII и очищают гель-фильтрацией. После этого проводят лигирование плазмиды pQE31 с фрагментом гена NC-белка, трансформацию лигазной смесью компетентных клеток JM 109, а трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг проводят рестрикцией с последующим определением нуклеотидной последовательности BamHI/HindIII-фрагмента рекомбинантной плазмиды.

Рекомбинантная плазмидная ДНК p31NC кодирует рекомбинантный белок, в котором аминокислотная последовательность MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisIlePro своим С-концом соединена с последовательностью NC-белка вируса РРСС. После трансформации рекомбинантной плазмидой p31NC компетентных клеток E.coli, например, JM109, экспрессии в них рекомбинантного белка и очистки его методом аффинной хроматографии, данный рекомбинантный белок NC-белок может быть использован в качестве антигена вируса РРСС при различных модификациях диагностических серологических тестов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение РНК вируса из патматериала.

Образец патматериала (1 г) растирают в ступке со стеклянным порошком и добавляют 9 мл STE-буфера. Суспензию осветляют центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин. 100 мкл осветленной суспензии смешивают с 200 мкл 6 М гуанидинизотиоцианата и инкубируют 3-5 мин при комнатной температуре. Добавляют 300 мкл 96% этанола, перемешивают и пропускают смесь через центрифужную миниколонку со стекловолокнистым фильтром типа GF/F (Whatman). Миниколонку с фильтром промывают 2 мл 80% этанола и центрифугируют 1 мин при 13000 g для полного удаления этанола. Затем миниколонку переносят в новую пробирку на 1,5 мл и РНК элюируют с фильтра 50 мкл воды. Через 1-2 мин после добавления воды пробирку с миниколонкой центрифугируют при 13000 g в течение 30 сек, миниколонку удаляют, а раствор РНК используют для реакции обратной транскрипции и апмлификации.

Пример 2. Синтез кДНК на матрице вирусной РНК.

Выделенную вирусную РНК добавляют к реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 8 мМ MgCl₂; 50 мМ KCl; 15 пмоль праймера “Н”; 1 мМ dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 10 ед. обратной транскриптазы. Реакцию проводят в течение 30 минут при 42^oС. После этого содержимое пробирки прогревают в течение 3 мин при 95^oС.

Пример 3. Полимеразная цепная реакция.

5 мкл раствора, содержащего кДНК, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 15 мМ трис-HCl, рН 9,0; 50 мМ KCl; 2,5 мМ МgСl₂, 0,1% BSA; 0,2 мМ каждого из четырех dNTP, 2 единицы Taq-полимеразы и по 25 пмоль праймеров “Н” и “В”. ПЦР состоит из 25 циклов: 95^oС – в течение 30 сек, 56^oС – в течение 30 сек, 73^oС – в течение 1 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73^oС в течение 3 мин.

Пример 4. Конструирование рекомбинантной плазмиды pGEM-NC.

После завершения ПЦР реакционную смесь переосаждают спиртом и растворяют в 25 мкл воды. Затем 20 мкл раствора, содержащего амплифицированные фрагменты кДНК, гидролизуют при температуре 37^oС в течение 1-2 часов в присутствии эндонуклеаз BamHI и HindIII в реакционной смеси “R” следующего состава: 10 мМ Трис-HCl; 10 мM MgCl₂; 100 мМ KCl; 1 мМ DTT (рН 8,7). Очистку фрагмента от продуктов гидролиза проводят на миниколонках со стекловолокнистым фильтром, аналогичную процедуру гидролиза осуществляют с плазмидой pGEM с последующей очисткой методом гель-фильтрации. Лигирование фрагмента и плазмиды проводят в течение часа при 37^oС в 20 мкл реакционной смеси “L” состава: 20 мМ Трис-HCl; рН 7,5; 10 мМ MgCl₂; 0,5 мМ rATP; 5 мM DTT; 10 ед. Т4 ДНК лигазы. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM109.

Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки E.coli JM109 высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37^oС до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCl₂, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора СаСl и выдерживают при 0^oС в течение 30 минут. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М СаСl и через 3 часа используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М CaCl₂, затем добавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0^oС, затем 2 мин – при 42^oС и снова 10 мин – при 0^oС, после чего добавляют 1 мл LB-бульона, инкубируют 1 час при 37^oС и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду pQEM-NC идентифицируют рестрикцией плазмидной ДНК. Для этого клетки бактерий E.coli JM109, снятые с LB-агара с ампициллином, выращивают при 37^oС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с процедурой щелочной денатурации с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту добавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37^oС, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1: 1), ДНК высаживают этанолом и растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера. 5 мкл раствора плазмидной ДНК инкубируют в буфере “R”, содержащем 20 мM трис-HCl, рН 7,5; 50 мM NaCl, 10 мM MgCl₂ и по 10 ед. эндонуклеаз BamHI и HindIII в течение часа при 37^oС. Затем реакционную смесь из каждой пробирки смешивают с 5 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин, бромфеноловый синий и наносят в “карман” 2% агарозного геля, который после электрофореза окрашивают этидиум бромидом и анализируют под ультрафиолетом. Окончательную структуру BamHI/HindIII-фрагмента плазмиды pGEM-NC подтверждают определением нуклеотидной последовательности методом дидезокситерминации.

Пример 5. Конструирование экспрессирующей плазмиды p31NC.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pGEM-NC в 80 мкл буфера “R” прибавляют 20 ед. каждой из рестрикционных нуклеаз BamHI и HindIII и инкубируют 90 мин при 37^oС. Одновременно 2 мкг ДНК плазмиды pQE31 обрабатывают в 20 мкл буфера “R” эндонуклеазами BamHI и HindIII. Анализ полноты гидролиза проводят элетрофорезом в 1% агарозном геле. Линеаризованную плазмиду pQE31 очищают гель-фильтрацией, а фрагмент электрофорезом в 4% ПААГе с последующей электроэлюцией на бумагу ДЕ-81, с которой фрагмент снимают 1,5 М NaCl₂, осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера. Далее этот фрагмент (0,2 мкг) лигируют в 20 мкл буфера “L” с мкг ДНК плазмиды pQE31 в присутствии 10 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 60 мин при 37^oС. 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток JM109. Приготовление компетентных клеток, трансформацию и анализ клонов E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду p31NC проводят, как описано в примере 4. Одновременно полученные клоны после индукции IPTG анализируют с помощью SDS-электрофореза. ДНК-клоны отбирают по наличию теоретически предсказанных фрагментов и индуцируемого рекомбинантного белка, выделяемого в чистом виде аффинной хроматографией.

Окончательную структуру рекомбинантной плазмидной ДНК p31NC подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе встроенного фрагмента, содержащего ген нуклеокапсидного белка. Экспрессию целевого гена проверяют по наличию рекомбинантного белка размером 17 килодальтон, выделяемого с помощью аффинной хроматографии, после индукции IPTG трансформированных целевой плазмидой p31NC клеток E.coli JM109.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить экспрессирующую плазмидную ДНК p31NC, кодирующую ген NC-белка вируса РРСС.

Пример 6.

Полученной плазмидной ДНК p31NC трансформируют компетентные клетки бактерий E. coli JM109 по методу, описанному в примере 4, и получают клетки Е. соli NC109, продуцирующие рекомбинантный полипептид, вызывающий образование вирусспецифических антител.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на “Рекомбинантную плазмидную ДНК p31NC, кодирующую 125 аминокислотный нуклеокапсидный белок вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и обеспечивающую его экспрессию в клетках бактерий E.coli”
1. Wensvoort G. et.al. Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome virus. J.Vet. Diangn. Invest., 1992, V. 4, p.134-138.

2. Nelson E. A. et al. Differentiation of US and European Isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies. J.Clin. Microbiol., 1993, V.31, N 12, 1-6.

Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК р3INC, кодирующая 125 аминокислотный нуклеокапсидный белок вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и обеспечивающая его экспрессию в клетках бактерий Е. coli, характеризующаяся тем, что содержит BamHI/HindIII фрагмент ДНК плазмиды рQE31, включающий промотор/оператор фага Т5, синтетический рибосом-связывающий сайт, терминатор транскрипции фага лямбда и в качестве генетического маркера ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой р31NC клеток бактерий Е. coli к ампицилину, и BamHI/HindIII-фрагмент, кодирующий 125 аминокислотный нуклеокапсидный белок вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.03.2007

Извещение опубликовано: 27.01.2008 БИ: 03/2008