Патент на изобретение №2205216

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ENTEROCOCCUS FAECIUM В-2240D – ПРОДУЦЕНТ ОПТИЧЕСКИ ЧИСТОЙ L(+)-МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И ПРОМЫШЛЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L(+)-МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ

(57) Реферат:

Изобретения относятся к биотехнологии и касаются нового штамма бактерий Enterococcus faecium B-2240 D – продуцента оптически чистой L(+)-молочной кислоты и промышленного способа получения L(+)-молочной кислоты или ее солей. Способ включает ферментацию монокультуры бактерий Enterococcus faecium на питательной среде, для приготовления которой используются отходы и вторичные ресурсы перерабатывающих отраслей промышленности, разделение культуральной жидкости на твердую и жидкую фазы и выделение целевых продуктов. Штамм E. faecium B-2240 D депонирован в коллекции-депозитарии ВКМ, является высокопродуктивным продуцентом L(+)-молочной кислоты. Использование изобретений позволяет получать целевые продукты с весьма низкой себестоимостью, выходом до 95% и оптической чистотой до 99,8%. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Изобретения относятся к биотехнологии и экологии, касаются микробиологического синтеза молочной кислоты и представляют собой штамм – продуцент оптически чистой L(+)-молочной кислоты, промышленный способ ее производства. Изобретения могут быть использованы в пищевой, химико-фармацевтической, парафармацевтической, парфюмерно-косметической промышленности, медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и производстве биополимеров.

Уровень техники
Молочная кислота и ее соли находят чрезвычайно широкое применение в пищевой, фармацевтической, парфюмерно-косметической промышленности, медицине, сельском хозяйстве и в производстве биопластмасс.

В связи с вышеизложенным особое значение приобретают получение высокопродуктивных промышленных штаммом-продуцентов оптически чистой L(+)-молочной кислоты и разработка эффективных и экологичных промышленных способов ее производства.

В настоящее время для промышленного биосинтеза молочной кислоты используются молочнокислые бактерии или грибы. Грибы являются менее технологичными в производственном процессе и, кроме того, промышленное их применение приводит к сдвигу экологического равновесия.

Что касается молочнокислых бактерий, то для производства молочной кислоты используются, как правило, их палочковидные формы. Известно, что кокковые формы бактерий обладают большей скоростью роста, обеспечивающей, следовательно, ускорение накопления молочной кислоты в культуральной жидкости и сокращение производственного цикла. Поэтому использование кокковых форм молочнокислых бактерий для промышленного производства молочной кислоты представляется предпочтительным.

Известны способы получения L(+)-молочной кислоты с помощью кокковых форм молочнокислых бактерий (WO 97/04120, С 12 Р 7/56; WO 98/28433, С 12 Р 7/56; WO 99/19503, C 12 Р 7/56, С 12 L 1/20; JP 57110192, C 12 P 7/56, C 12 R 1/225). Недостатками известных способов являются: высокая себестоимость целевого продукта в связи с использованием дорогих искусственных питательных сред, недостаточная оптическая чистота молочной кислоты, низкая экономичность и загрязнение окружающей среды отходами производства. Таким образом, известные способы являются по сути лабораторными и не применимы в условиях промышленного производства.

Ближайшим аналогом заявляемого способа получения L(+)-молочной кислоты является способ получения ее с помощью монокультуры кокковой формы бактерий – Streptococcus lactis, включающий культивирование бактерий на молочной сыворотке с последующим фильтрованием культуральной жидкости, очисткой фильтрата пропусканием его через катионит, затем анионит с десорбцией целевого продукта серной кислотой, концентрированием и осветлением его активированным углем. (А. с. СССР 735590, С 07 С 59/08, А 23 С 21/00; Колеснов А.Ю., Володина Е.М., Альперович Е.Д. “Ферментативный анализ изомеров молочной кислоты в молочных продуктах и сыре”, Пищевая промышленность, 1997, N 3, с.32).

Несмотря на использование в качестве сырья вторичного ресурса – молочной сыворотки, известный способ обладает рядом существенных недостатков: низким коэффициентом использования углеводов; сложной многостадийной обработкой больших объемов растворов; значительным расходом вспомогательных материалов (щелочи и кислоты); необходимостью обезвреживания и утилизации больших количеств сточных вод. Таким образом, низкая эффективность и неэкологичность известного способа исключают его широкое промышленное применение.

Способ получения L(+)-молочной кислоты с использованием бактерий вида Enterococcus faecium в литературе не описан.

Известна смешанная культура из двух штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus faecium и Lactobacillus acidophilus (NCAIM/P/B – 001002 “Lactinoc – В”). Однако указанные штаммы в симбиозе являются продуцентами DL-молочной кислоты (HU 204569 В, С 12 Р 7/56; HU 206521 В, C 12 Р 7/56). При этом штамм Streptococcus faecium не является основным продуцентом целевого продукта, а выполняет, по-видимому, защитную функцию, предотвращая микробное заражение культуральной жидкости, поскольку вносится в питательную среду или первым, или в значительно меньшем количестве (соотношение Streptococcus faecium и Lactobacillus acidophilus в питательной среде составляет 10-20:90-80% по массе).

Штаммы бактерий Enterococcus faecium – промышленные продуценты L(+)-молочной кислоты в литературе не описаны.

Краткое описание чертежа
В дальнейшем изобретения поясняются чертежом, который иллюстрирует ДНК – фингерпринт штаммов Enterococcus faecium методом полимеразной цепной реакции с использованием модифированных праймеров рибосомальных последовательностей.

Сущность изобретений
В основу изобретений положена задача выделения нового высокопродуктивного штамма Enterococcus faecium – продуцента оптически чистой L(+)-молочной кислоты и разработки высокоэффективного, экологичного способа получения L(+)-молочной кислоты.

Задача изобретений в части штамма решена тем, что получен новый, генетически устойчивый штамм Enterococcus faecium B-2240D. Техническими результатами заявленного изобретения являются высокая скорость роста бактериальных клеток, что обеспечивает сокращение производственного цикла и увеличение удельного выхода целевых продуктов, высокая продуктивность штамма и синтез молочной кислоты исключительно в L(+)-форме.

Штамм энтерококков В-2240 D наряду с другими лабораторными штаммами (Е. faecium GK1, Е. faecium К/5, Е. faecium К/4 и Е. faecium GK2) выделен из молочной сыворотки и селекционирован путем длительных пересевов отдельных колоний на среде, содержащей, г/л: пептон – 1,0, глюкозу – 20,0, твинн-80 – 1 мл, К₂НРO₄ – 2,0, Мg₂НРO₄7Н₂O – 0,2, MnSQH₂O – 0,5, цистеин – 0,2, гидролизат молока – 0,2, дрожжевой автолизат – 50,0
Отбор штамма энтерококков осуществляли по качеству колоний и количеству образующейся в процессе биосинтеза молочной кислоты в культуральной жидкости. Генетической устойчивости отбираемых штаммов достигали путем их неоднократных пересевов на плотные питательные среды. Выросшие на них колонии затем пересевали в жидкую питательную среду для лактобацилл (аналог МРС -1)
В результате получен новый генетически устойчивый штамм энтерококков. Идентификацию микроорганизма проводили в соответствии с определителем Bergey’s Manual of Determenative Bacteriology, 9 edition, 1994, William, USA; lnt. J. Syst. Bacteriol/Vol/ 34, 1984, p.31-34.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) под номером В-2240 D. Штамм характеризуется следующими признаками:
– культурально-морфологическими
Штамм растет в жидких питательных средах, содержащих 2 мас.% лактозы или глюкозы. Через 24 часа роста клеток при температуре 45^oС в мазке, окрашенном по Граму, присутствуют клетки сферической формы с размерами 0,7-0,8 мкм – одиночные, парные или образующие короткие цепочки. На твердых агаризованных средах образует мелкие прозрачные колонии округлой формы. Из органических источников азота могут быть использованы такие как пептон, дрожжевые гидролизат или автолизат.

В зависимости от используемого состава сред и условий культивирования получают культуральную жидкость с титром клеток от 1,010⁹ до 1,510⁹ кл. в 1 мл.

– физиологическими
Штамм является факультативным анаэробом, растет при температуре от +10^oС до +50^oС, (температурный оптимум – 45^oС), при рН от 5,5 до 7,0 (оптимум рН – 6,8.) Растет на питательных средах с содержанием ферментативного гидролизата пекарских дрожжей и молочной сыворотки.

– биохимическими
Штамм в питательных средах усваивает в качестве источника углеводов лактозу, глюкозу, сахарозу, L-арабинозу, маннит, мелибиозу, рибозу, галактозу, фруктозу, маннозу, мальтозу с образованием L(+)-молочной кислоты.

– маркерными
ДНК-фингерпринт штамма Enterococcus faecium осуществляли методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием модифицированных праймеров рибосомальных последовательностей, (triplicate arbitrary primers polimerase chain reaction TAP -PCR) в соответствии с известной методикой (S.M. Cusich, D.J. О Sullivan.2000.Use of a single, triplicate arbitralry primed-PCR procedure for molecular fingerprinting of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology, v. 66(5) p.2227-2231.) Для проведения PCR использовали следующие праймеры ДНК:
Cag-cag-ccg-ccg-taa-tac
Cag-cfg-ccg-cgg-taa-ttc
Реакцию проводили при температурах отжига 40^oС, 42^oС, 44^oС и 46^oС в течение одной минуты в не менее двух аналитических повторностях.

Электрофорез продуктов PCR проводили в 1,5%-ном агарозном геле при напряженности поля 5V/см. В качестве маркера использовали Lambda DNA/Eco47111 (in bp): 8112226, 6555, 6442, 3676, 2606, 2555, 2134, 2005, 1951, 1611, 1420, 1284, 985, 974, 894, 597, 590, 513, 511, 433,398, 345, 310, 308, а в качестве типовой культуры – штамм В -5460 Enterococcus faecium ATCC 8043. Результаты ДНК-фингерпринта отобранных штаммов E. faecium B-2240 D и Е. faecium GK 2 при различных температурах отжига представлены на чертеже.

При анализе представленных результатов обнаруживаются существенные различия между заявленным штаммом и типовой культурой, что позволяет считать ДНК-фингерпринт достаточно надежной генетической характеристикой заявленного штамма и использовать PCR для его идентификации.

– биотехнологическими
Максимальная продуктивность штамма составляет 123 г/л L(+)-молочной кислоты в течение 72 часов в условиях примера 4.

При этом штамм Enterococcus faecium не теряет вышеуказанную продуктивность в течение 25 циклов культивирования.

Антагонистические свойства:
Заявленный штамм обладает широким спектром противомикробного дейстия. В качестве тест-культур использовали следующие виды:
Pseudomonas aeruginosa, Sfaphylococcus aureus /шт.209 – Р АТСС 6538 /, Bacillus mesentericus /шт. 1/, Bacillus mesentericus /шт. 2/, Bacillus subtilis /шт. 3-a /, Bacillus licheniformis, Bacillus sphaericus, Bacillus sporoginesis /шт. 3в./, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonia, Salmonella tuphimurium, Shigella flexneri, Escherichia coli 212X ATCC 25922, Mycobacterium smegmatis NNCCDO 20, Nocaardia asteroides 436, Aspergillus niger F-2093.

Культуры выращивали на мясопептонном бульоне и мясопептонном агаре в течение суток при температуре 37^oС. В работе использовали метод радиальных штрихов (Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1979, – 479 с.) Полученные результаты представлены в таблице 1.

Техническими результатами заявленных изобретений в части способа являются: увеличение выхода и чистоты целевых продуктов, ускорение производственного цикла, повышение удельной продуктивности производственного процесса при снижении себестоимости целевых продуктов; улучшение инфраструктуры перерабатывающих отраслей промышленности путем утилизации их отходов и вторичных ресурсов.

Способ получения L(+)-молочной кислоты или ее солей согласно изобретению включает следующие стадии:
а) ферментацию монокультуры молочнокислых бактерий Enterococcus faecium на белково-углеводной питательной среде;
б) разделение культуральной жидкости на твердую и жидкую фазы;
в) выделение целевого продукта.

В частных случаях реализации способ может быть отъемно-доливным, для приготовления питательной среды могут использоваться отходы и вторичные ресурсы перерабатывающих отраслей промышленности; при этом в качестве сырья целесообразно использовать отходы зерно- и картофелеперерабатывающей промышленности или вторичные ресурсы – различные виды молочной сыворотки, или плодово-ягодные и овощные выжимки, или пивную дробину, или спиртовую барду, или дрожжевой гидролизат, или дрожжевой автолизат; сырье при необходимости подвергают предварительной обработке – водно-термическому и/или ферментативному воздействию и/или введению комплекса минерально-органических добавок. Выделение целевого продукта может включать концентрирование жидкой фазы или концентрирование и очистку активированным углем, или концентрирование, очистку активированным углем и ионообменными смолами, или концентрирование, очистку активированным углем и ионообменными смолами и кристаллизацию целевого продукта; при выделении молочной кислоты из лактатов их разлагают сильными минеральными кислотами. В качестве бактерий вида Enterococcus faecium целесообразно использовать штамм Enterococcus faecium В – 2240 D – продуцент оптически чистой L(+)-молочной кислоты.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретений.

ПРИМЕР 1
Из молочной сыворотки были выделены пять штаммов энтерококков, различающихся характером роста на твердой агаризованной питательной среде. Эти штаммы по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам были идентичны и отнесены к виду Enterococcus faecium. Кислотообразующую способность выделенных штаммов оценивали путем культивирования их на стандартной стерильной жидкой питательной среде для лактобацилл (аналог МРС-1) с содержанием глюкозы не менее 4 мас. % и измерения количества образовавшейся в культуральной жидкости молочной кислоты. Инокулят в количестве пяти объемных процентов вносили в колбы с питательной средой объемом 750 мл и проводили периодическое культивирование на качалке при минимальном числе оборотов и при соблюдении следующих параметров: температуре 45^oС, рН 6,8. В качестве нейтрализующего агента использовали 20%-ный раствор гидроксида натрия. После 24 часов культивирования определяли рост бактерий и количество образовавшейся в процессе биосинтеза молочной кислоты в культуральной жидкости. Полученные результаты представлены в таблице 2.

На основании полученных результатов в качестве продуцента для промышленного получения молочной кислоты отобран штамм Е. faecium В-2240 D, который был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Штамм Enterococcus faecium GK 1, выделенный из молочной сыворотки, идентифицирован на основании нижеуказанных свойств в соответствии с Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA; Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 34, 1984, p. 31-34. Штамм характеризуется следующими признаками:
Родовыми:
Морфология клеток: клетки беловато-серого цвета жидкие сферические диаметром 0,7-0,8 мкм, парные или короткие цепочки в жидкой среде.

Реакция по Граму положительная.

Спорообразование отсутствует.

Пигменты не образует.

Факультативный анаэроб, хемоорганотроф с ферментативным типом метаболизма, нуждается в комплексных питательных средах.

Углеводы ферментирует с образованием молочной кислоты.

Каталазо-отрицательный. Растет при температуре 45^oС; при рН 9,6; в среде с 6,5% NaCl; с 40% желчных кислот (растет на среде МакКонки).

Видовыми:
Образует аммиак из аргинина.

Гидролизует аргинин.

Не обладает ферментом желатиназой.

Реакция Фогест-Проскауэра положительная.

Пируват, цитрат, малат не используется как источник энергии для роста.

Образует кислоту из L-арабинозы, маннита, мелибиозы, сахарозы, галактозы, фруктозы, маннозы, амигдалина, мальтозы, лактозы, маннита, глицерина. Не образует кислоту из ксилозы, рамнозы, рафинозы.

Культуральные свойства:
Оптимальная температура роста 37^oС.

Условия поддержания и хранения: ежемесячные пересевы на агаризованной среде; метод хранения – лиофилизация в сепарированном молоке.

Штамм не патогенен и не токсичен для человека. Штамм не генномодифицирован и генноустойчив.

Штамм Е. faecium K/5, выделенный из молочной сыворотки, идентифицирован на основании нижеуказанных свойств в соответствии с Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA; Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 34, 1984, p. 31-34.

Штамм характеризуется следующими признаками:
Родовыми:
Морфология клеток: клетки белого с кремовым оттенком цвета, жидкие сферические диаметром 1,2-1,5 мкм, парные или короткие цепочки в жидкой среде.

Реакция по Граму положительная.

Спорообразование отсутствует.

Пигменты не образует.

Факультативный анаэроб, хемоорганотроф с ферментативным типом метаболизма, нуждается в комплексных питательных средах.

Углеводы ферментирует с образованием молочной кислоты.

Каталазо-отрицательный. Растет при температуре 45^oС; при рН 9,6; в среде с 6,5% NaCl; с 40% желчных кислот (растет на среде МакКонки).

Видовыми:
Образует аммиак из аргинина.

Гидролизует аргинин.

Не обладает ферментом желатиназой.

Реакция Фогест-Проскауэра положительная.

Пируват, цитрат, малат не используется как источник энергии для роста.

Образует кислоту из L-арабинозы, маннита, мелибиозы, сахарозы, галактозы, фруктозы, маннозы, амигдалина, мальтозы, лактозы, маннита, глицерина. Не образует кислоту из ксилозы, рамнозы, рафинозы.

Культуральные свойства:
Оптимальная температура роста 37^oС.

Условия поддержания и хранения: ежемесячные пересевы на агаризованной среде; метод хранения – лиофилизация в сепарированном молоке.

Штамм не патогенен и не токсичен для человека. Штамм не генномодифицирован и генноустойчив.

Штамм Е. faecium K/4, выделенный из молочной сыворотки, идентифицирован на основании нижеуказанных свойств в соответствии с Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA; Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 34, 1984, p. 31-34. Штамм характеризуется следующими признаками:
Родовыми:
Морфология клеток: клетки белого с кремовым оттенком цвета, жидкие сферические диаметром 0,9-1,0 мкм, парные или короткие цепочки в жидкой среде.

Реакция по Граму положительная.

Спорообразование отсутствует.

Пигменты не образует.

Факультативный анаэроб, хемоорганотроф с ферментативным типом метаболизма, нуждается в комплексных питательных средах.

Углеводы ферментирует с образованием молочной кислоты.

Каталазо-отрицательный. Растет при температуре 45^oС; при рН 9,6; в среде с 6,5% NaCl; с 40% желчных кислот (растет на среде МакКонки).

Видовыми:
Образует аммиак из аргинина.

Гидролизует аргинин.

Не обладает ферментом желатиназой.

Реакция Фогест-Проскауэра положительная.

Пируват, цитрат, малат не используется как источник энергии для роста.

Образует кислоту из L-арабинозы, маннита, мелибиозы, сахарозы, галактозы, фруктозы, маннозы, амигдалина, мальтозы, лактозы, маннита, глицерина. Не образует кислоту из ксилозы, рамнозы, рафинозы.

Культуральные свойства:
Оптимальная температура роста 37^oС.

Условия поддержания и хранения: ежемесячные пересевы на агаризованной среде; метод хранения – лиофилизация в сепарированном молоке.

Штамм не патогенен и не токсичен для человека. Штамм не генномодифицирован и генноустойчив.

Штамм Е. faecium GK 2, выделенный из молочной сыворотки, идентифицирован на основании нижеуказанных свойств в соответствии с Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA; Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 34, 1984, p. 31-34.

Штамм характеризуется следующими признаками:
Родовыми:
Морфология клеток: клетки беловато-серого цвета жидкие сферические диаметром 1,0-1,2 мкм, парные или короткие цепочки в жидкой среде.

Реакция по Граму положительная.

Спорообразование отсутствует.

Пигменты не образует.

Факультативный анаэроб, хемоорганотроф с ферментативным типом метаболизма, нуждается в комплексных питательных средах.

Углеводы ферментирует с образованием молочной кислоты.

Каталазо-отрицательный. Растет при температуре 45^oС; при рН 9,6; в среде с 6,5% NaCl; с 40% желчных кислот (растет на среде МакКонки).

Видовыми:
Образует аммиак из аргинина.

Гидролизует аргинин.

Не обладает ферментом желатиназой.

Реакция Фогест-Проскауэра положительная.

Пируват, цитрат, малат не используется как источник энергии для роста.

Образует кислоту из L-арабинозы, маннита, мелибиозы, сахарозы, галактозы, фруктозы, маннозы, амигдалина, мальтозы, лактозы, маннита, глицерина. Не образует кислоту из ксилозы, рамнозы, рафинозы.

Культуральные свойства:
Оптимальная температура роста 37^oС.

Условия поддержания и хранения: ежемесячные пересевы на агаризованной среде; метод хранения – лиофилизация в сепарированном молоке.

Штамм не патогенен и не токсичен для человека. Штамм не генномодифицирован и генноустойчив.

ПРИМЕР 2
Штамм Enterococcus faecium B-2240 D для проведения ферментации восстанавливают следующим образом: содержимое ампулы вносят в пробирку со стерильной средой МРС-1 или стерильной средой для лактобацилл и термостатируют при температуре 45^oС в течение 24 часов в термостате, затем из нее готовят инокулят, который вносят в колбы объемом 750 мл в количестве 5-10% и проводят культивирование в течение 24 часов. В качестве питательной среды используют смесь дрожжевого автолизата и молочной сыворотки. Приготовление дрожжевого автолизата осуществляют следующим образом: хлебопекарские дрожжи с содержанием влаги 25 мас.% смешивают с дистиллированной водой в соотношении 3:1 и полученную суспензию с содержанием 600 г дрожжевых клеток в 1 л воды переводят в реактор, снабженный мешалкой и рубашкой. Суспензию разогревают при помешивании до температуры 47-49^oС и выдерживают при перемешивании в течение 18-24 часов. Завершение процесса автолиза определяют по накоплению аминного азота в смеси. Используют автолизат с содержанием аминного азота 250-300 мг%. Для остановки процесса автолиза смесь пастеризуют при 60^oС в течение одного часа, стерилизуют два раза текучим паром 30 мин. (Одинцова Е.Н. Микробиологические методы Е 072 с 0-42 Определение витаминов). Молочную сыворотку пастеризуют при температуре 65-70^oС в течение 20-25 минут. Для приготовления питательной среды смешивают дрожжевой автолизат и молочную сыворотку в соотношении 1: 1, доводят рН среды перед внесением посевного материала до значения 6,8-6,9, температуру до 45^oС. Регулирование рН среды в колбах производят добавлением 20%-ного раствора гидроксида натрия.

ПРИМЕР 3
Получение L(+)-молочной кислоты или ее солей проводили путем культивирования массы заявленного штамма в 1000 литровых ферментационных аппаратах, снабженных блоками управления и контрольно-измерительными приборами с коэффициентом первоначального заполнения питательной средой 0,5. В качестве питательной среды использовали пастеризованную творожную сыворотку в количестве 400 литров и стерильный дрожжевой автолизат (8,0 литров в смеси с 0,8 кг дифосфата аммония). Питательную среду подогревали до температуры 45^oС, устанавливали начальное значение рН среды 6,6-6,8 и засевали чистой стартерной культурой, составляющей до 20% от объема питательной среды.

На протяжении всего периода ферментации соблюдали следующие условия: температура составляла 45^oС, культуральную жидкость периодически перемешивали при минимальном количестве оборотов мешалки, значение рН ее при этом поддерживали в интервале 6,6-6,8 в начале ферментации, далее отключали рН-статирование и процесс проводили при снижении значения рН до 5,9-5,8 за счет естественного закисления среды вследствие накопления молочной кислоты в культуральной жидкости, возвращали значение рН на уровень 6,6-6,8. В качестве нейтрализующего агента использовали 20%-ный раствор гидроксида натрия.

С целью максимального накопления целевого продукта в период активного кислотообразования в ферментационной среде поддерживали концентрацию лактозы в интервале 3- 4 мас.% путем периодического внесения в нее сгущенной молочной сыворотки с содержанием лактозы 23-25 мас.% с таким расчетом, чтобы к концу процесса ферментационная среда содержала не более 0,5-0,3 мас.% остаточной лактозы. В связи с увеличением объема ферментационной среды и соответственным уменьшением концентрации питательных веществ и витаминов в среду вносили дрожжевой автолизат с минеральными добавками дифосфата аммония до необходимых его концентраций в питательной среде. Через каждые 6 часов в динамике производили отбор проб из ферментационного аппарата и определяли содержание лактозы и лактата натрия в культуральной жидкости. За 24 часа культивирования накопление лактата натрия составило 3,36 мас.%, за 48 часов культивирования – 7,84 мас.%, за 72 часа культивирования – 9, 83 мас.%, за 96 часов культивирования – 12,27 мас.%.

ПРИМЕР 4
В данном примере осуществляли отъемно-доливной способ получения молочной кислоты или ее натриевой соли. Из ферментера по предыдущему примеру отбирали до 20% посевного материала суточной культуры (предпочтительно 16-18-часовую культуру) и вносили стерильно в следующий ферментационный аппарат с предварительно подготовленной питательной средой.

Содержимое ферментационного аппарата, из которого отбирали посевной материал, доводили до первоначального объема питательной средой и проводили цикл биосинтеза молочной кислоты с соблюдением технологических условий аналогично ПРИМЕРУ 3. Накопление лактата натрия за 24 часа культивирования составило – 5,72 мас.%, за 48 часов – 9,62 мас.%, за 72 часа культивирования – 15,3 мас. %. Выход лактата натрия от использованного субстрата составил 95 мас.%.

ПРИМЕР 5
Ферментацию осуществляли согласно ПРИМЕРАМ 3 и 4. В качестве нейтрализующих агентов использовали гидроокись кальция или гидроокись магния, или углекислый кальций, или углекислый магний, или водный раствор аммиака. В результате конечным продуктом биосинтеза являлись кальциевые или аммонийные, или магниевые соли молочной кислоты. Ферментацию заканчивали через 72 часа, при этом было синтезировано от 10,5 мас.% до 13,5 мас.% лактатов.

ПРИМЕР 6
В качестве сырья для приготовления питательной среды использовали картофельную мезгу – отход переработки картофеля на крахмал. Содержание крахмала в мезге составляло 5,7 мас.%. Предварительная подготовка картофельной мезги заключалась в ее водно-термической и ферментативной обработке. Водно-термическую обработку осуществляли путем разбавления мезги водой и развариванием ее при атмосферном давлении. Ферментативная обработка заключалась в последовательном осахаривании разваренной мезги амилосубтилином из расчета 2 Ед/г крахмала и глюкоаваморином Г18Х из расчета 6 Ед/г крахмала сырья. Контроль гидролиза осуществляли йодной пробой и тестированием содержания редуцирующих веществ в среде. В осахаренную питательную среду вносили дифосфат аммония и дрожжевой автолизат до конечных концентраций 0,2 и 0,1 мас.%. соответственно. Ферментацию и регулирование значений рН и температуры проводили аналогично ПРИМЕРАМ 3 и 4, но в качестве сахаросодержащей среды, используемой для поддержания глюкозы на оптимальном уровне, применяли концентрированный путем выпаривания гидролизат картофельной мезги. Выход лактата натрия через 72 часа культивирования составил 11,7 мас.%, что соответствовало 93 мас.% от потребленного сахара.

В качестве сырья для приготовления питательной среды использовали и другие отходы крахмального производства – кукурузную или зерновую мезгу с аналогичными выходами по лактату натрия.

ПРИМЕР 7
В качестве сырья для приготовления питательной среды использовали отходы консервного производства – яблочные выжимки. Содержание общих сахаров колебалось в зависимости от сорта яблок и составляло от 9 до 12 мас.%. Предварительная обработка яблочных выжимок заключалась в водно-термическом воздействии, как указано в ПРИМЕРЕ 6, и ферментативном расщеплении пектиновых веществ до сахаров пектолитическим ферментом пектофоетидином П10Х в концентрации 36 Ед/г пектина. В результате такой обработки количество сахара в среде увеличивалось на 1,5-2,5 мас.%. Особенностью данного процесса являлось ферментативное воздействие непосредственно в ферментере, то есть одновременно протекали гидролиз яблочных выжимок и конверсия образующихся из них сахаров до целевого продукта. В связи с высоким содержанием сахаров в питательной среде дополнительного их внесения в процессе ферментации не требовалось. Режим ферментации поддерживали аналогично ПРИМЕРАМ 3 и 4 с той разницей, что в питательную среду не добавляли дифосфат аммония и дрожжевой автолизат. Выход лактата натрия через 72 часа культивирования достиг 12,3 мас.%, что составило 95,3 мас.% от потребленного сахара.

В качестве питательной среды использовали и другие плодово-ягодные выжимки, содержащие не менее 4,0 мас.% общего сахара
ПРИМЕР 8
Культивирование штамма Е. faecium GK1 вели в аналогичных ПРИМЕРУ 3 условиях. Накопление лактата натрия в ферментационной среде за 24 часа культивирования составило 3,25 мас.%, за 48 часов – 5,02 мас.%, за 72 часа – 7,09 мас. %. Отъемно-доливной способ обеспечил накопление в ферментационной среде за 24 часа культивирования 3,95 мас.% лактата натрия, за 48 часов – 7,5 мас. %, за 72 часа – 8,96 мас.%.

ПРИМЕР 9
Культивирование штамма Е. faecium K/5 вели в аналогичных ПРИМЕРУ 3 условиях. Накопление лактата натрия в ферментационной среде за 24 часа культивирования составило 5,18 мас.%, за 48 часов – 7,51 мас.%, за 72 часа – 9,01 мас. %. Отъемно-доливной способ обеспечил накопление в ферментационной среде за 24 часа культивирования 5,42 мас.% лактата натрия, за 48 часов – 8,09 мас.%, за 72 часа – 9,76 мас.%
ПРИМЕР 10
Культивирование штамма Е. faecium K/4 вели в аналогичных ПРИМЕРУ 3 условиях. Накопление лактата натрия в ферментационной среде за 24 часа культивирования составило 5,45 мас.%, за 48 часов – 7,92 мас.%, за 72 часа – 9,67 мас. %. Отьемно-доливной способ обеспечил накопление в ферментационной среде за 24 часа культивирования 5,99 мас.% лактата натрия, за 48 часов – 8,97 мас.%, за 72 часа культивирования – 10,02 мас.%.

ПРИМЕР 11
Культивирование штамма Е. faecium GK 2 вели в аналогичных ПРИМЕРУ 3 условиях. Накопление лактата натрия в ферментационной среде за 24 часа культивирования составило 3,44 мас. %, за 48 часов – 5,11 мас.%, за 72 часа – 7,75 мас. %. Отьемно-доливной способ обеспечил накопление в ферментационной среде за 24 часа культивирования 4,02 мас.% лактата натрия, за 48 часов – 7,64 мас.%, за 72 часа – 9,43 мас.%.

ПРИМЕР 12
Для приготовления питательной среды использовали искусственную белково-углеводную среду, содержащую 0,5 мас.% белка сои, 3,5 мас.% глюкозы и 1,5 мас. % мальтозы. В указанную среду вносили дрожжевой гидролизатдо конечной концентрации 0,1 мас.%.

Ферментацию и регулирование рН и температуры проводили аналогично примерам 3 и 4, но в качестве продуцента использовали штамм Е. faecium K/5, а в качестве сахаросодержащей среды, используемой для поддержания глюкозы на оптимальном уровне, применяли концентрированный раствор глюкозы.

Выход лактата натрия через 72 часа культивирования составил 9,5 мас.%, что соответствовало 89 мас.% от потребленных углеводов.

ПРИМЕР 13
В качестве питательной среды использовали продукты микробиологической переработки дрожжевой биомассы, а именно дрожжевой автолизат или дрожжевой гидролизат (вторичные ресурсы микробиологического производства таких продуктов, как пива, вина, дрожжей, спирта, кормовой биомассы и т.п.)
При необходимости в указанную среду добавляли углеводы до конечной концентрации не менее 3-4 мас.%.

Ферментацию и регулирование значений рН и температуры проводили аналогично примерам 3 и 4, но в качестве продуцента использовали штамм Е. faecium K/4, а в качестве сахаросодержащей среды, используемой для поддержания глюкозы на оптимальном уровне, применяли концентрированный путем выпаривания гидролизат картофельной мезги или другой источник углеводов.

Выход лактата натрия через 72 часа составил 10,0 мас.%, что соответствовало 90 мас.% от потребляемых сахаров.

ПРИМЕР 14
Культуральную жидкость, содержащую лактаты, полученную после ферментации, проведенной согласно предыдущим примерам, подвергали дальнейшей обработке разделением ее на твердую и жидкую фазы общеизвестными методами: фильтрацией, сепарированием, центрифугированием, ультрафильтрацией. В зависимости от применяемого метода, используемого вида сырья соотношение твердой и жидкой фазы находилось в пределах, мас.% 11-35:89-65.

Жидкую фазу, содержащую 12,5-19,0 мас. % лактатов, концентрировали с использованием либо вакуум-выпарных установок, либо мембранной технологии и применяли, например, для технических целей или направляли на последующую технологическую обработку для получения целевого продукта с большей степенью чистоты. Технологическая обработка сконцентрированной жидкой фазы включала очистку при помощи бентонита, желатины или активированного угля различных марок. При необходимости очистку продолжали с помощью ионообменных смол и концентрировали полученный раствор. При необходимости лактаты выделяли из последнего кристаллизацией. Для перевода в свободную молочную кислоту лактаты на любой из вышеуказанных технологических стадий подвергали разложению сильными минеральными кислотами.

В результате получали L(+)-молочную кислоту с оптической чистотой согласно примерам 3, 4, 6 и 7 до 98,7-99,8%.

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Enterococcus faecium ВКМ B-2240 D – продуцент оптически чистой L(+)-молочной кислоты.

2. Способ получения (L+)-молочной кислоты или ее солей, включающий ферментацию монокультуры кокковой формы молочно-кислых бактерий на белково-углеводной питательной среде с последующим разделением культуральной жидкости на твердую и жидкую фазы и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве монокультуры молочно-кислых бактерий используют бактерии вида Enterococcus faecium.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что он является отъемно-доливным.

4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что для приготовления питательной среды в качестве сырья используют отходы и вторичные ресурсы перерабатывающих отраслей промышленности.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве сырья используют отходы зерно- и картофелеперерабатывающей промышленностей или вторичные ресурсы – различные виды молочной сыворотки, или плодово-ягодные и овощные выжимки, или пивную дробину, или спиртовую барду, или дрожжевой гидролизат, или дрожжевой автолизат.

6. Способ по п. 4 или 5, отличающийся тем, что сырье подвергают предварительной обработке.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что предварительная обработка представляет собой водно-термическое и/или ферментативное воздействие и/или введение комплекса минерально-органических добавок.

8. Способ по п. 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, отличающийся тем, что выделение целевого продукта включает концентрирование жидкой фазы или концентрирование и очистку активированным углем, или концентрирование, очистку активированным углем и ионообменными смолами, или концентрирование, очистку активированным углем, ионообменными смолами и кристаллизацию целевого продукта.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что при выделении L(+)-молочной кислоты из лактатов их разлагают сильными минеральными кислотами.

10. Способ по п. 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, отличающийся тем, что в качестве бактерий вида Enterococcus faecium используют штамм Enterococcus faecium ВКМ B-2240 D – продуцент оптически чистой (L+)-молочной кислоты.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.10.2004

Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006