Патент на изобретение №2205024

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ЖИДКОГО ЛИСТЕРИОЗНОГО ЛИСТЕРИНА ДЛЯ ВНУТРИКОЖНОЙ ПРОБЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики листериоза. Сущностью способа является получение аллергена листериозного для внутрикожной пробы путем наращивания культуры вакцинного штамма АУФ, инактивации, лиофильного высушивания, с проведением гидролиза 1% раствором уксусной кислоты на водяной бане в течение 6 часов при температуре 1001^oС, затем в холодильнике в течение 181 часов. Техническим результатом является повышение специфичности и специфической активности препарата и возможность его промышленного получения.

Изобретение относится к препаратам для диагностирования физиологического состояния организма посредством постановки внутрикожной пробы, а именно для диагностики листериоза у людей и животных.

Известен способ приготовления аллергена, заключающийся в инактивации полученной двухсуточной культуры листерий прогреванием при 100^oС. Антиген из убитых нагреванием культур вызывал сильные реакции, как у иммунизированных, так и у контрольных животных и обладал неспецифическими свойствами, что является недостатком этого способа (1).

Известен способ получения аллергена, основанный на получении суточной агаровой культуры листерий, которую дважды промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (рН 7,4), в виде густой взвеси (до млрд. микробных клеток в 1 мл) подвергали ежедневному замораживанию и оттаиванию в течение 30 дней. После этого взвесь прогревали в течение 1,5 ч при 100^oС на водяной бане, затем центрифугировали до полной прозрачности надосадочной жидкости. Затем надосадочную жидкость прогревали в течение часа в тех же условиях, после этого в различных разведениях (1:100; 1:500; 1:1000; 1:10000) испытывали как аллерген на здоровых и инфицированных кроликах. Для внутрикожных проб было принято разведение 1:1000, которое в дозе 0,1 мл вызывало у 4-х из 5 пораженных кроликов гиперемию до 7-12 мм в диаметре через 24-48 часов и не вызывало никакой реакции у 4 здоровых кроликов (2).

Недостатком этого способа является длительность процесса получения препарата и то, что он может быть применен только в научных целях, а не для промышленного производства препарата.

Целью изобретения является повышение эффективности получения препарата – аллергена листериозного для диагностики листериоза у людей и животных.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения жидкого аллергена листериозного, основанном на наращивании бакмассы и ее инактивации, проводят слабый гидролиз инактивированной бакмассы листериозного микроба после термической денатурации балластных белков.

Существенным отличительным признаком является следующее действие в способе получения аллергена жидкого листериозного – листерина для внутрикожной пробы: слабый гидролиз инактивированной и обезжиренной бакмассы листериозного микроба после термической денатурации балластных белков с последующей фильтрацией с корректировкой рН.

Этот отличительный признак необходим и достаточен для достижения технического результата заявляемого изобретения – ускорения процесса получения аллергена листериозного жидкого – листерина и возможность промышленного получения его. Это достигнуто благодаря проведенным исследованиям по производству аллергенного препарата, изучению свойств препарата, постановке аллергической пробы на морских свинках. Бакмассу листериозного микроба наращивали, лиофильно высушивали, инактивировали с последующим обезжириванием эфиром и хлороформом, проводили гидролиз обезжиренной бакмассы 1,0%-ным раствором уксусной кислоты, причем гидролиз шел при 100^oС на водяной бане в течение 6 ч и продолжался в холодильнике в течение 181 ч на шуттель-аппарате. Полученную взвесь фильтровали и корректировали рН до 7,2-7,5 10%-ным NaOH на ионометре. После определения концентрации белка на спектрофотометре препарат разливали в ампулы и стерилизовали.

Пример. Аллерген изготовлен из бакмассы вакцинного листериозного штамма АУФ. Для этого брали культуру вакцинного штамма АУФ, наращивали ее в матрацах на глюкозо-глицериновом агаре. Культивирование культуры производили при 37^oС. Параллельно контролировали чистоту культуры просмотром мазков, окрашенных по Грамму. Культуру смывали физиологическим раствором. Инактивирование бакмассы производили путем автоклавирования бакмассы при 1,5 атм в течение 1 часа. После проверки стерильности бакмассу лиофильно высушивали на лиофильной установке ТГ-5. Обезжиривание бакмассы производили эфиром и хлороформом в аппарате Сокслета. Гидролиз проводили 1% раствором уксусной кислоты на водяной бане в течение 6 часов при температуре 1001^oС, а затем в холодильнике в течение 181 ч на шуттель-аппарате. Полученную смесь пропускали через фильтр, корректировали рН до 7,2-7,5 10% раствором NaOH. Концентрация белка, определяемая на спектрофотометре, равнялась 1,8 мг/мл. Аллерген запаивали в ампулы и автоклавировали при 1 атм 30 мин.

Препарат нетоксичен. Контроль токсичности определяли на трех белых мышах путем внутрибрюшинного введения смеси содержимого трех ампул по 0,50,05 мл.

Контроль препарата на специфическую активность проводилил на морских свинках породы “Arune” весом 300-350 г, в количестве 14 штук. Животных иммунизировали однократным введением 500 млн. м.к. подкожно в обе лапки по 250 млн. м. к. в каждую. Через 2,5 недели в депиллированную кожу боковой поверхности живота каждого животного, строго внутрикожно, асептически вводили аллерген листериозный в дозе 0,1 мл. Кожные реакции учитывались через 48 часов. На месте введения наблюдался отек и побледнение кожи, у некоторых свинок гиперемия. Отек и гиперемия равнялись 1010 мм. Отек исчезал через четверо суток.

Для проверки наглядности постановку пробы проводили также на белых мышах весом 18-20 г. Для этого иммунизированным мышкам в подушечки задних лапок вводили аллерген в дозе 0,1 мл. Опыт показал, что реакция более наглядна у морских свинок.

Для проверки специфичности параллельно проводили иммунизацию морских свинок Staphyllococcus aureus и Streptococcus faecalis в той же дозе. После постановки аллергической пробы аллергеном реакция была отрицательной.

Источники информации

Формула изобретения

Способ получения аллергена листериозного для внутрикожной пробы, отличающийся тем, что наращивают культуру вакцинного штамма АУФ, инактивируют автоклавированием при 1,5 атм в течение 1 ч, лиофильно высушивают, обезжиривают эфиром и хлороформом, проводят гидролиз 1% раствором уксусной кислоты на водяной бане в течение 6 ч при 1001^oС, затем в холодильнике в течение 181 ч, полученную смесь пропускают через фильтр и корректируют рН 10% раствором NaOH до 7,2-7,5.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 14.06.2003

Извещение опубликовано: 20.02.2005 БИ: 05/2005