Патент на изобретение №2205021

(54) ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вакцина содержит вируссодержащий материал из авирулентного крупно-бляшечного штамма “КБК” с биологической активностью 5,5-6,5 lg ЭИД₅₀/мл и стабилизатор. Вакцина обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна. 10 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве вакцины против инфекционной бурсальной болезни (ИББ).

Инфекционная бурсальная болезнь – широко распространенная высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят преимущественно в возрасте 15-80 дней, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. За последние 10 лет ИББ получила широкое распространение и зарегистрирована практически в большинстве крупных птицеводческих хозяйствах России.

Экономический ущерб от ИББ, обусловленный гибелью цыплят до 20-70% при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также вследствие возникновения вторичных инфекций, очень велик.

В настоящее время общепризнанно, что единственно правильным и надежным направлением профилактики данной инфекции является применение вакцинных препаратов. Для специфической профилактики ИББ применяют живые и инактивированные вакцины.

К преимуществам живых вакцин следует отнести низкую их себестоимость, высокие эксплуатационные свойства, способность формировать высокий уровень напряженности иммунитета на более длительный срок.

Известна вакцина против ИББ птиц, включающая авирулентный генетически однородный вирусный материал из штамма “ВНИВИП” вируса ИББ птиц. Для профилактики заболевания птицу иммунизируют с суточного возраста, так как вакцина безвредна для птиц любого возраста [1].

Недостаток данной вакцины состоит в том, что она предназначена для профилактики заболевания в благополучных хозяйствах, а в условиях неблагополучных хозяйств, а также при наличии высокого уровня материнских антител эффективность ее применения крайне низка.

Известна также вакцина против ИББ птиц на основе штамма “БГ”, адаптированного к СПФ-эмбрионам кур с биологической активностью 5,25-6,0 lg ЭИД₅₀/мл. Цыплят вакцинируют с 10-14-дневного возраста дважды с интервалом 10-14 дней в дозе 100-1000 ЭИД₅₀/мл методом выпаивания. Вакцина способна преодолеть материнские антитела против ИББ [2].

Опыт ее применения в практике выявил недостаточность аттенуации этого штамма. Вакцина из штамма “БГ” негативно влияет на общую резистентность организма, снижение иммунной реактивности птицы на вакцины против других инфекций, а также оказывает отрицательное влияние на прирост живой массы птицы. По данным Скутаря И.Г. с соавторами в хозяйствах, где профилактика ИББ проводится с применением вакцины из штамма “БГ”, на 5-6 сутки после иммунизации отмечаются выраженные клинические признаки заболевания и гибель до 5% птиц [3].

В исследованиях Reece R.L. et al. [4] установлено, что прямая корреляция между способностью вакцинного штамма преодолеть материнский иммунитет и вызвать атрофию фабрициевой сумки, т.е. проявление субклинического течения заболевания, сопровождающегося выраженной иммунодепрессией вакцинированной птицы.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц из штамма “Винтерфильд 84-ДЕП”, исходным вирусом для которой использован штамм “Винтерфильд – 2512”, выделенный от больной птицы в США в 1965 году. Штамм “Винтерфильд 84-ДЕП” репродуцируется как в культуре клеток ФЭК, так и на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 6,5-8 lg ТЦД₅₀/мл и 5,00-6,00 lg ЭИД₅₀/мл соответственно. Цыплят вакцинируют с 7-10-дневного возраста дважды с интервалом 10 дней методом выпаивания [5].

Недостаток данной вакцины состоит в ее низкой иммуногенной активности и нестабильности основных иммунобиологических свойств.

Haffer К. [6] провел сравнительное изучение основных свойств вакцинных штаммов вируса ИББ из группы “Винтерфильд”, используемых для производства вакцины ИББ в различных странах. Эти исследования показали, что все штаммы класса “Винтерфильд” за период их длительного применения в производстве прошли многократное (более 150) пассирование в разных условиях культивирования, что послужило причиной потери стабильности основных свойств этих штаммов (иммуногенность, антигенность, генетическая однородность). В итоге сама возможность производства вакцин из этих штаммов, отвечающих существующим стандартам, сомнительна.

Целью изобретения является получение высокоиммуногенной, эффективной, безопасной вакцины, а также уменьшение средств при вакцинопрофилактике ИББ.

Для достижения цели при производстве вакцины в качестве вакцинного штамма используют штамм “КБК”, авирулентный крупнобляшечный клон, адаптированный к СПФ-эмбрионам кур 10-суточной инкубации с титром биологической активности 5,5-6,5 lg ЭИД₅₀/мл.

Для профилактики ИББ птицу иммунизируют подкожно с суточного возраста в возрасте 2,5-2,7 ЭИД₅₀/мл.

Ранее вакцинный штамм “КБК” вируса ИББ культивировали в культуре клеток БГМ-70 и был выделен клон, образующий в культуре клеток бляшки 4-5 мм в диаметре [7] . В дальнейшем была проведена планомерная адаптация выделенного клона к СПФ-эмбрионам кур путем проведения 50 последовательных пассажей. Степень адаптации вируса к СПФ-эмбрионам кур оценивали путем определения биологической активности вируссодержащего материала через 5-, 10-, 20-, 30-, 40- и 50 пассажей (табл. 1).

Для получения вакцины готовили матровый материал из штамма “КБК” вируса ИББ птиц. Полученную вируссодержащую жидкость использовали для массового заражения 10-суточных СПФ-эмбрионов кур. Вирусный материал в объеме 0,2 мл вводили на хориоаллантоисную оболочку (ХАО) и зараженные СПФ-эмбрионы инкубировали при 37,7-38,0^oС в течение 48-125 часов. Павшие эмбрионы гомогенизировали, трехкратно замораживали и размораживали с добавлением фосфатно-солевого буфера с рН 7,4-7,5 и центрифугировали в течение 30 минут при 5000 об/мин. Вируссодержащую надосадочную жидкость с биологической активностью не ниже 5,5-6,5 lg ЭИД₅₀/мл осторожно сливали в стерильных условиях, а затем добавляли стабилизатор (обезжиренное молоко, пептон, лактозу, сахарозу) в соотношении 1:1 и подвергали лиофилизации. Лиофилизированная вакцина хранится при температуре 4-8^oС в течение от 1 года до 1,5 лет.

Пример 1. Определение оптимальной иммунизирующей дозы вакцины из штамма “КБК”
Опыты по изучению оптимальной иммунизирующей дозы вакцины из штамма “КБК” провели на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста с использованием вируса 40-го пассажа с активностью вируса 6,0 lg ЭИД₅₀/мл. Предварительно были приготовлены десятикратные разведения вируса и каждым его разведением были вакцинированы по 10 СПФ-цыплят. Вакцину выпаивали с водой.

В контроле были использованы 10 не вакцинированных СПФ-цыплят. Контрольное заражение цыплят во всех группах проводили вирулентным штаммом “52/70-М” вируса ИББ в дозе 100 ИД₅₀/мл через 21 сут после прививки. Опыты провели в трех повторностях. Протоколы опытов по проверке иммуногенной активности вакцинного штамма “КБК” приведены в табл.2.

Результаты опытов свидетельствуют о том, что вакцинация СПФ-цыплят вирусом КБК в дозе 2,5 lg ЭИД₅₀/мл методом выпаивания обеспечивает 100% иммунитет. Однако, учитывая, что для вакцинации цыплят с пассивным иммунитетом требуется некий “запас” вируса, в качестве иммунизирующей дозы была выбрана 2,5 lg ЭИД₅₀/мл.

Пример 2. Определение безвредности вакцины из штамма “КБК”
Безвредность вакцинного штамма “КБК” проверяли на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста. Для этого 15 цыплятам ввели перорально вирус в дозе 3,5 lg ЭИД₅₀/мл. По истечении срока наблюдения (15 дней) цыплята опытной и контрольной групп были убиты с целью выявления патологоанатомических изменений, свойственных ИББ. Во всех внутренних органах и фабрициевой сумке патологоанатомические изменения не выявлены. Сохранность структуры фабрициевой сумки была подтверждена и при гистологическом исследовании.

Пример 3. Иммуногенная активность вакцины из штамма “КБК” на уровне разных пассажей на СПФ-эмбрионах кур
Для оценки иммуногенной активности на СПФ-цыплятах 14-суточного возраста использовали вирус 10-го, 30-го, 40-го и 50-го пассажей. Установлено, что штамм “КБК” всех уровней пассажа при однократном применении с водой в дозе 2,0 lg ЭИД₅₀/мл обеспечивает 100% защиту от контрольного заражения вирулентным штаммом через 21 день после вакцинации, что свидетельствует о стабильности его иммуногенных свойств (табл.3).

Пример 4. Изучение сроков выработки и продолжительности иммунитета при подкожном введении штамма “КБК”
Срок выработки и продолжительность поствакцинального иммунитета изучали на цыплятах, выведенных из СПФ-яиц. Для этой цели цыплят вакцинировали однократно подкожно штаммом “КБК” вируса ИББ в возрасте 14 дней в дозе 2,5 lg ЭИД₅₀/мл. О состоянии иммунного статуса цыплят судили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом “52/70-М” вируса ИББ, а также данным серологических исследований сыворотки крови в РДП и РН через 7, 14, 21, 28 и 42 дня (срок наблюдения) после иммунизации (табл.4).

Установлено, что через 14 дней после вакцинации в РДП выявлены антитела в сыворотке крови 70% цыплят, а во все последующие сроки исследования – в 100% случаев. Индекс нейтрализации составил через 14 дней 2,8 lg, достигал максимального значения к 28 дням после иммунизации и сохранялся на этом уровне до конца опыта.

При контрольном заражении вирулентным штаммом вируса ИББ через 14, 21, 28, 42 дня сохранность цыплят составила 100%. Не были отмечены также клинические и патологоанатомические признаки, свойственные инфекционной бурсальной болезни, тогда как в контрольных группах в 100% случаев имело место клиническое проявление заболевания и гибель цыплят от ИББ. Полученные данные свидетельствуют о высокой иммуногенности вируса “КБК”.

Пример 5. Проверка штамма “КБК” на реверсибельность. Проверку вакцинного штамма вируса ИББ на реверсибельность проводили 8-ю последовательными пассажами на СПФ-цыплятах 21-суточного возраста (по 10 голов на каждый пассаж). Для этого СПФ-цыплятам перорально вводили 0,5 мл вакцинного штамма в дозе 4,5 lg ЭИД₅₀/мл. В опыте использовали вирус 40-го пассажа с активностью 5,5 lg ЭИД₅₀/мл.

На 4-е сутки после введения вакцинного штамма половину цыплят убивали и отбирали фабрициевы сумки, а за остальными вели клинические наблюдения в течение 15 сут, после чего патматериал от них исследовали гистологически, а сыворотки проверяли в РДП с антигеном вируса ИББ. Второй и последующие 6 пассажей проводили по той же схеме с той лишь разницей, что в качестве вируссодержащего материала брали гомогенат фабрициевых сумок цыплят предыдущего пассажа в разведении 1:10. Одновременно патматериал каждого пассажа исследовали гистологически. Результат этой серии опытов приведен в табл.5.

Проведенные исследования показали, что при 8-кратном пассировании на СПФ-цыплятах вакцинный штамм не вызывал клинику и паткартину заболевания у подопытной птицы, т.е. пассирование вируса не привело к усилению его вирулентности.

Пример 6. Проверка штамма “КБК” на иммунодепрессивную активность
Вакцинный штамм “КБК” с целью проверки на иммунодепрессивную активность вводили подкожно суточным СПФ-цыплятам в рекомендуемой для иммунизации дозе 2,5 lg ЭИД₅₀/мл. В качестве контроля служили не вакцинированные, а также СПФ-цыплята, зараженные вирулентным вирусом “52/70-М” (по 40 цыплят в группе).

В возрасте 14 дней цыплят опытной и контрольной групп (20 голов) вакцинировали против Ньюкаслской болезни вакциной из штамма “Ла-Сота” согласно инструкции по ее применению.

Вакцина была изготовлена 17.09.2000 г. на Курской биофабрике, серия 7, титр вируса 10¹⁰ ЭИД₅₀/мл. Срок годности 12 мес.

Аналогичные опыты с использованием вакцинного и вирулентного штаммов вируса ИББ были проведены на суточных цыплятах с пассивными антителами.

Результаты, полученные в ходе этих исследования, представлены в табл.6.

Из данных, приведенных в табл.6, следует, что средний титр антигемагглютининов в группе, где цыплятам ввели вакцинный штамм, составил 7,3 log2, что несколько ниже по сравнению с показателями интактных цыплят. Однако имеющаяся разница статистически недостоверна. Введение суточным СПФ-цыплятам вирулентного штамма вызывало значительное снижение иммунной реакции организма на последующее введение вакцины “Ла-Сота”. Так, титр антигемагглютининов в РЗГА у цыплят после переболевания ИББ составил – 2,4 log2 при 8,6 log2 у интактных цыплят.

Заражение цыплят с пассивным иммунитетом вирулентным штаммом ИББ, как и введение вакцинного штамма вируса, не оказывало существенного иммунодепрессивного влияния и это дает основание предположить, что пассивные антитела к вирусу ИББ предупреждают не только клиническое проявление заболевания, но и предохраняют птицу от иммунодепрессивного влияния вируса ИББ.

Пример 7. Сравнительная оценка иммуногенности вакцинного штамма “КБК” и вакцины производства фирмы “ТАД”
Следующим этапом нашей работы явилось изучение иммуногенности данного штамма в сравнении с вакциной фирмы “TAD” (Германия). В опытах использовали вакцинный штамм вируса ИББ, который прошел 50 пассажей на СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,75 lg ЭИД₅₀/мл.

Для контрольного заражения использовали вирулентный штамм “52/70-М” вируса ИББ в дозе 100 ИД₅₀/мл.

Вакцину фирмы “TAD” применяли согласно инструкции по ее применению. Было проведено два эксперимента (табл.7).

В первом эксперименте СПФ-цыплята в одной группе были иммунизированы аттенуированным штаммом этого вируса однократно подкожно в дозе 2,5 lg ЭИД₅₀/мл. Цыплята во второй группе были привиты зарубежной вакциной. Контролем служили не привитые цыплята, содержащиеся в изолированных боксах. Контрольное заражение опытных и контрольной групп цыплят проводили в 28-суточном возрасте. За цыплятами наблюдали в течение 10 сут после контрольного заражения. Как видно из табл. 13, однократная подкожная иммунизация аттенуированным штаммом “КБК” вируса ИББ, как и вакцинация вакциной фирмы “TAD”, обеспечили 100% сохранность при контрольном заражении СПФ-цыплят и предотвратили клиническое проявление заболевания. В контроле заболеваемость цыплят составила 100%, а летальность -13,3%.

Пример 8. Эффективность вакцины из штамма “КБК” при наличии материнского иммунитета
Для изучения влияния материнских антител на формирование поствакцинального иммунитета провели опыт на цыплятах в возрасте 14, 21 и 28 сут, имеющих материнский иммунитет. Одна группа цыплят была иммунизирована двукратно в дозе 2,5 lg ЭИД₅₀/мл в возрасте 14 и 35 сут. Контрольное заражение цыплят из всех групп проводили вирулентным штаммом “52/70-М” вируса ИББ в дозе 100 ИД₅₀/мл через 21 день после вакцинации. Опыт проводили в сравнении с коммерческой вакциной производства фирмы “TAD”. Результаты этих исследований приведены в табл.8.

Из данных таблицы следует, что иммунизация цыплят разного возраста вакцинным штаммом “КБК” в одинаковой дозе обеспечивает различный процент защиты. Наибольший иммунологический эффект (95%) вакцинный штамм обеспечивает при иммунизации цыплят в возрасте 28 сут. Введение этой же дозы вакцины цыплятам в возрасте 14 и 21 сут создает иммунитет у 75 и 80% птицы соответственно.

Эффективность двукратной вакцинации цыплят в возрасте 14 и 35 сут составила 100%.

Пример 9. Эффективность применения вакцины из штамма “КБК” в зависимости от способа введения
Оценку эффективности различных методов вакцинации против ИББ проводили на СПФ-цыплятах в возрасте 5-6 сут.

Цыплятам первой группы вакцину вводили интраназально, второй – перорально, третью иммунизировали окулярно, четвертую – подкожным методом в область верхней трети шеи, а пятую группу прививали внутримышечно. Контролем служили не вакцинированные цыплята. Напряженность иммунитета против ИББ определяли по уровню вируспреципитирующих антител в сыворотке крови через 21 сут после иммунизации, а также по устойчивости привитой птицы к заражению вирулентным вирусом. Данные этих опытов приведены в табл.9.

Приведенные в таблице данные свидетельствуют, что при всех способах введения вируса СПФ-цыплятам формируется достаточно высокий поствакцинальный иммунитет, что еще раз подтверждает эффективность предлагаемого штамма.

На основании положительных результатов опытов по оценке иммуногенной активности вакцины из штамма “КБК” в лабораторных условиях нами проведено испытание препарата в производственных условиях ЗАО ППЗ “Большевик”. Данные этого опыта приведены в табл. 10.

На основании результатов серологических исследований в РДП и ИФА сывороток крови цыплят, вакцинированных опытными сериями вакцины из штамма “КБК”, следует заключить: применение вакцины вызывает активную сероконверсию у привитой птицы. Об эффективности препарата также можно судить по результатам биопробы, где привитая птица имела 90-100% устойчивость при контрольном заражении.

В настоящее время эпизоотическая ситуация по болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни в большинстве птицеводческих хозяйств остается сложной в связи с циркуляцией высокопатогенных штаммов возбудителей этих инфекций. Эффективность мер специфической профилактики против БМ и ИББ в значительной мере зависит от уровня формирования активного иммунитета к моменту контакта птицы с полевым вирусом. Степень такого риска в неблагополучных хозяйствах достаточно высока из-за большой концентрации возбудителей данных инфекций и их устойчивости во внешней среде. При этом у привитых цыплят формируется напряженный иммунитет против обеих инфекций.

Нами проведен производственный опыт по изучению антигенной совместимости вакцинного штамма “КБК” вируса ИББ и полиштаммной вакцины болезни Марека на суточных цыплятах мясных пород.

Всего было вакцинировано 450 тыс. цыплят. Вакцинацию цыплят проводили методом выпаивания двукратно в возрасте 7 и 17 дней (150 тыс. голов) путем подкожного однократного введения 150 тыс. голов и одновременно с вакцинацией против болезни Марека 150 тыс. голов. При одновременном способе вакцинации вакцины разводились в разбавителе вакцины болезни Марека в одном флаконе перед прививкой.

Об эффективности вакцинации судили по результатам исследований сыворотки крови на наличие специфических антител к вирусу ИББ в РДП и ИФА, благополучию хозяйства по ИББ, продуктивности и сохранности молодняка, а также по уровню поствакцинального иммунитета после иммунизации цыплят вакциной из штамма “Ла-Сота”, а также по количеству выявленных случаев болезни Марека при патологоанатомическом вскрытии птиц до 180-дневного возраста.

Опыты показали, независимо от способа применения вакцины из штамма “КБК” признаков, характерных для инфекционной бурсальной болезни, выявлено не было. При двукратной вакцинации методом выпаивания положительная реакция на РДП по разным партиям птиц составляла от 80 до 95% в возрасте 35 дней.

При однократном подкожном применении вакцины цыплята в суточном возрасте имели положительные результаты РДП в 100% случаев уже в возрасте 25 дней.

При одновременной вакцинации против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни антитела к вирусу ИББ в РДП выявлялись в 100% случаев в возрасте 25 дней.

Титры антител в ИФА были одинаковы как при моновакцинации против ИББ, так и при одновременном методе иммунизации (среднегеометрический титр в ИФА – 2214, процент корреляции – 25-27).

Количество случаев болезни Марека патологоанатомически зарегистрировано от 200 до 220 на 100 тыс. птиц в течение 180 дней содержания, что на 20-35 случаев ниже, чем при вакцинации птицы только вакциной против болезни Марека.

Применение вакцины против ИББ не оказало негативного влияния на уровень напряженности иммунитета против болезни Ньюкасла. Титр антител в РЗГА к вирусу болезни Ньюкасла после однократной вакцинации через 15 дней составлял от 1: 16 до 1:64 и в единичных случаях 1:8 и 1:128 (при интраназальной вакцинации). Процент группового иммунитета от 92 до 98.

Одновременный способ иммунизации против ИББ и болезни Марека по нашему мнению наиболее перспективный (при наличии пассивного иммунитета не более 30% по нашим наблюдениям), так как обеспечивает надежную защиту против ИББ и позволяет снизить затраты на вакцинации минимум в 2 раза. Процент сохранности птицы подопытных группах за период наблюдения составил 96,7%, суточный прирост массы тела в течение 36 дней (до постановки птицы на ограниченное кормление) 38-39,5 г.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Авторское свидетельство СССР 1824443; МПК ⁵ С 12 N 7/00, А 61 К 39/12 30.06.93 г.

2. Патент РФ 2127602, МПК⁶ А 61 К 39/12, С 12 N 7/006 20.03.99 г.

5. Патент РФ 2127604, МПК⁶ 6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/00, 20.03.99 г.

7. Патент РФ 2054038, МПК⁶ С 12 N 7/00, С 12 R 1/92, 10.02.96 г.

Формула изобретения

Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, включающая вируссодержащий материал из авирулентного штамма, адаптированного к СПФ-эмбрионам кур 10-суточной инкубации, и стабилизатора, используемого в равном соотношении, отличающаяся тем, что в качестве вакцинного штамма используется крупнобляшечный штамм “КБК” с биологической активностью 5,5-6,5 lg ЭИД₅₀/мл.

РИСУНКИ