Патент на изобретение №2205013

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ИЗ ТИМУСА СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению препаратов, применяемых для лечения первичных и вторичных иммунодефицитов Т-системы иммунитета. Препарат готовят путем измельчения сырья, его гомогенизации в водно-солевом растворе, экстрагирования, нагревания экстракта, удаления термолабильной фракции, последовательного отделения вещества сначала на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 10,0 кД, а затем на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 1,0 кД, разбавления задерживаемой фракции, добавления в разбавленный раствор D-маннита, стерилизующей фильтрацией, розливом стерильного раствора во флаконы и его лиофилизацией. Техническим результатом является расширение арсенала иммуномодулирующих средств. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению препаратов, применяемых для лечения первичных и вторичных иммунодефицитов Т-системы иммунитета, вызванных вирусными и бактериальными инфекциями, неинфекционными заболеваниями, сопровождающимися снижением количества Т-лимфоцитов. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности для приготовления сухой инъекционной формы препарата, применяемого для лечения человека и животных.

Известен способ приготовления препарата, действующего на Т-систему иммунитета, отличающийся от предлагаемого тем, что его получают путем предварительной очистки и измельчения тимуса северного оленя, гомогенизации измельченного сырья в растворе натрия хлорида 1:3; автолиза при температуре 2-6^oС в течение 12-18 часов; удаления из автолизата остатков ткани центрифугированием или фильтрацией; прогрева супернатанта до 80^oС с последующим выдерживанием при заданной температуре в течение 15 минут; удаления денатурированных белков центрифугированием или фильтрацией; охлаждения фильтрата или супернатанта до температуры 0^oС; добавления к охлажденному фильтрату или супернатанту при перемешивании 5-кратного количества охлажденного до температуры минус 20^oС ацетона с последующим перемешиванием полученной смеси в течение 18-20 часов; сбора ацетонового осадка центрифугированием и его трехкратной промывки охлажденным ацетоном; сушки ацетонового осадка под тягой; растворения ацетонового осадка в трис-НСl буфере; ультрафильтрации раствора ацетонового осадка через мембраны типов РМ-10, УМ-10 (Амикон) или любую другую аналогичную по размеру пор мембрану или полные волокна с номинальными пределами удерживания по глобулярным белкам от 6,0 до 12,0 кД; трехкратной промывки образовавшегося осадка на фильтре трис-буфером; лиофилизации ультрафильтрата; растворения лиофилизата; гель-хроматографии полученного раствора на сефадексе G-50 или ультрагеле АсА 202, уравновешенном 0,05 мМ трис-НСl буфером; сбор пептидов с молекулярной массой 1,35-6,00 кД; лиофилизации собранных фракций; растворения лиофилизата; обессоливании раствора на сефадексе G-50; сбора пептидной фракции и ее лиофилизации [1].

Известны также способы приготовления препаратов, воздействующих на Т-систему иммунитета, такие как “Тимоптин” [2] и Т-активин [3], однако источником получения этих препаратов является тимус телят и молодняка крупного рогатого скота.

К недостаткам рассматриваемого способа получения иммуномодулирующего препарата-аналога следует отнести: трудоемкость из-за использования хроматографического оборудования; энергоемкость из-за использования для концентрации веществ, перед и после проведения разделения, лиофильного оборудования, что приводит к дополнительным затратам и использование для осаждения БАВ взрыво- и огнеопасного, летучего, токсичного агента ацетона, который необходимо регенерировать или подвергать специальной утилизации.

Задачей изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств путем разработки простого эффективного способа получения препарата из тимуса северного оленя.

Указанная задача решается созданием препарата из тимуса северного оленя посредством измельчения сырья, его гомогенизации в водно-солевом растворе, экстрагирования, нагревания экстракта, удаления термолабильной фракции, отделения веществ на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 10,0 кД, разделение веществ на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 1,0 кД, разбавления задерживаемой фракции, добавления в раствор D-маннита, стерилизующей фильтрацией раствора, с последующим розливом стерильного раствора во флаконы и его лиофилизацией. Полученный препарат содержит комплекс белков с молекулярной массой от 10,0 до 1,0 кД и обладает иммуномодулирующими свойствами в отношении Т-системы иммунитета.

Заявленный способ осуществляют следующим образом.

Размороженный до температуры не выше минус 5^oС тимус измельчают до состояния фарша и добавляют к нему 2 объема (от массы исходного сырья) водно-солевого раствора, содержащего 9,0 г/л натрия хлористого. Гомогенизацию фарша проводят в течение 3-5 минут, а затем к гомогенату прибавляют еще 3 объема (от массы исходного сырья) водно-солевого раствора, содержащего 9,0 г/л натрия хлористого, после чего проводят экстрагирование БАВ в течение 2-4 часов. По окончании экстракции путем центрифугирования или фильтрации отделяют остатки ткани, а супернатант при постоянном перемешивании подвергают прогреванию в течение 10-30 минут до температуры 50-90^oС, затем супернатант охлаждают до температуры 4-8^oС. Термолабильную часть супернатанта отделяют центрифугированием или фильтрацией. Супернатант, содержащий термостабильную часть белковых веществ, подвергают ультрафильтрации через мембраны, задерживающие вещества с молекулярной массой более 10,0 кД. Задерживаемую фракцию утилизируют, а ультрафильтрат подвергают разделению на ультрафильтрационной мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 1,0 кД. Ультрафильтрат утилизируют, а задерживаемую фракцию подвергают анализу и разбавлению до концентрации в ней белка 100-600 мкг/мл. В разбавленный раствор добавляют в D-маннит до концентрации 7,5-45 мг/мл, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации. Стерильный раствор разливают во флаконы и лиофилизируют.

Крупные мясокомбинаты, на которых до 1990 года осуществлялся централизованный собор тимуса, в настоящее время из-за отсутствия массового поступления скота, требуемого для их нормального функционирования, работают в основном как мясоперерабатывающие производства. Убой фермерского молодняка крупного рогатого скота и поступающего от скотоводческих хозяйств в настоящее время производится на мелких бойнях или бойнях, построенных непосредственно в скотоводческих хозяйствах. В таких бойнях, как правило, отсутствуют условия сбора сырья (нет доступных мест сбора, специального обученного персонала, оборудования для сбора и консервирования) и поэтому сбор сырья в них производится только по индивидуальному заказу в малых количествах. Поэтому оленеводство, как одна из основных отраслей животноводства Крайнего Севера, может стать ключевым резервом экологически чистого, доступного и дешевого сырья, которое в большинстве оленеводческих хозяйств в настоящее время является отходом, получаемым при производстве оленины. Простота и экономичность разработанного способа производства иммуномодулятора дает возможность производить предлагаемый препарат в условиях биоцехов, имеющихся при крупных оленеводческих хозяйствах Крайнего Севера.

Приготовленный по разработанной технологии препарат из тимуса северного оленя в возрасте до 4,5 лет был, подвергнут испытанию на мышах линии BALB/C в возрасте 12 месяцев с выраженным возрастным иммунодефицитом. Результаты проведенных испытаний показали, что введение препарата приводит к достоверному увеличению, в сравнении с контролем, общего количества лимфоцитов, лимфоцитов класса Т и В, а также субкласса Т-лимфоцитов, способных к образованию розеток с эритроцитами барана (Т_а-РОК) и субкласса В-лимфоцитов, способных к образованию розеток с эритроцитами барана (В_а-РОК). Фагоцитарное число после введения препарата мышам в сравнении с контролем возросло на 25,3%, а количество фагоцитировавших нейтрофилов на 16,3%. После введения препарата в сравнении с контролем достоверно увеличиваются количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в тимусе и площадь лимфатических фолликулов (ЛФ) в селезенке опытных мышей. В этой связи можно сказать, что полученный препарат увеличивает полиферацию и дифференцировку в зрелые иммунокомпетентные клетки Т-лимфоцитов, нормализует взаимодействие Т и В лимфоцитов и повышает их фагоцитарную активность (см. таблицу).

Разработанный способ приготовления иммуномодулирующего препарата позволяет исключить использование на отдельных стадиях энергоемкого (лиофильная сушилка) и трудоемкого (хромаографическая установка) оборудования, взрывопожароопасного агента, требующего регенерации, а следовательно, производить более дешевый препарат.

Заявленный способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 1 кг тимуса, измельченного на волчке с диаметром отверстий 4 мм, гомогенизируют в течение 5 минут в 2 л водно-солевого раствора, содержащего 9 г/л натрия хлористого. Гомогенат заливают 4 л водно-солевого раствора и при постоянном перемешивании проводят экстрагирование БАВ в течение 1 часа. Экстракт центрифугируют при температуре 10^oС в течение 60 минут при 2500 об/мин. Осадок (жмых) декантируют, а супернатант сливают в чистый экстрактор, который помещают на водяную баню. Подогрев супернатанта до температуры 90^oС проводят при постоянном перемешивании в течение 40 минут, после чего экстракт охлаждают до температуры 8^oС. Экстракт центрифугируют в течение 60 минут при 2500 об/мин. Жировую пленку, образовавшуюся на фугате, удаляют, коагулят декантируют, а супернатант фильтруют через бумажный фильтр. Осветленный фильтрат пропускают через мембранный фильтр, задерживающий вещества с молекулярной массой более 10,0 кД. Задерживаемую фракцию утилизируют, а ультрафильтрат подвергают разделению на ультрафильтрационной мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 1,0 кД. Повторный ультрафильтрат утилизируют, а задерживаемую фракцию подвергают разбавлению инъекционной водой до концентрации в ней белка 100 мкг/мл. В разбавленный раствор добавляют D-маннит до концентрации 7,5 мг/мл, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации. Стерильный раствор разливают во флаконы и лиофилизируют.

Пример 2. 1 кг тимуса, измельченного на волчке с диаметром отверстий 3 мм, гомогенизируют в течение 3 минут в 2 л водно-солевого раствора, содержащего 9 г/л натрия хлористого. Гомогенат заливают 4 л водно-солевого раствора и при постоянном перемешивании проводят экстрагирование БАВ в течение 2 часов. Экстракт центрифугируют при температуре ^oС в течение 60 минут при 2500 об/мин. Осадок (жмых) декантируют, а супернатант сливают в чистый экстрактор, который помещают на водяную баню. Подогрев супернатанта до температуры 50^oС проводят при постоянном перемешивании в течение 20 минут, после чего экстракт охлаждают до температуры 4^oС. Экстракт центрифугируют в течение 60 минут при 2500 об/мин. Жировую пленку, образовавшуюся на фугате, удаляют, коагулят декантируют, а супернатант фильтруют через бумажный фильтр. Осветленный фильтрат пропускают через мембранный фильтр, задерживающий вещества с молекулярной массой более 10,0 кД. Задерживаемую фракцию утилизируют, а ультрафильтрат подвергают разделению на ультрафильтрационной мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 1,0 кД. Повторный ультрафильтрат утилизируют, а задерживаемую фракцию подвергают разбавлению инъекционной водой до концентрации в ней белка 600 мкг/мл. В разбавленный раствор добавляют D-маннит до концентрации 45 мг/мл, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации. Стерильный раствор разливают во флаконы и лиофилизируют.

ЛИТЕРАТУРА
1. АС СССР 1737798, А 61 К 38/00, 1995.

2. АС СССР 1474923, А 61 К 35/26, 1986.

3. АС 997298, А 61 К 37/24, 1983.

Формула изобретения

Способ приготовления иммуномодулирующего препарата из тимуса северного оленя путем измельчения исходного сырья до гомогенной массы, выделения активных веществ и очистки от сопутствующих примесей, отличающийся тем, что при приготовлении препарата выделение активных веществ проводят путем экстрагирования, а для очистки от сопутствующих примесей используют фильтрацию вначале через мембраны, задерживающие вещества с молекулярной массой более 10,0 кД, затем фильтрат пропускают через мембраны, задерживающие вещества с молекулярной массой более 1,0 кД, с последующими разбавлением задерживаемой фракции, добавлением в раствор D-маннита, фильтрацией раствора через стерилизующий фильтр, розливом стерильного раствора во флаконы и его лиофилизацией.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.10.2003

Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006