Патент на изобретение №2204838

(54) СОСУДИСТЫЙ БЕЛОК – 1 АДГЕЗИИ, ОБЛАДАЮЩИЙ АМИНООКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и касается применения сосудистого белка-1 адгезии, обладающего аминооксидазной активностью. Сущность изобретения включает способ манипулирования процессом связывания эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованного сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), включающим ингибирование или потенцирование ферментной активности аминооксидазы в указанных эндотелиальных клетках. Преимущество изобретения заключается в разработке способа, опосредующего ранние взаимодействия в процессах связывания лимфоцитов с эндотелиальными клетками. 2 с.п.ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Область техники
Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей новый человеческий белок адгезии эндотелиальной клетки, обозначенный VAP-1, который обладает адгезивной функцией и аминоксидазной активностью. Изобретение также относится к применению нуклеиновой кислоты и полипептида VAP-1.

Предпосылки изобретения
Непрерывная циркуляция лимфоцитов между кровью и тканью является принципиально важной для функционирования иммунной системы. Этот процесс позволяет лимфоцитам контролировать все участки организма в поисках антигена, что позволяет им развивать и формировать свою реакцию на антигенную угрозу в конкретных условиях тканевого микроокружения. После этого лимфоциты могут специфически возвращаться в сайт с микроокружением, в котором они обнаружили антиген, что повышает селективность иммунного ответа. Адгезивные взаимодействия между множественными рецепторами на циркулирующих лимфоцитах и их лигандами, экспрессируемыми на поверхности эндотелиальных клеток в посткапиллярных венулах, представляют собой как средство осуществления миграции лейкоцитов, так и способ селективно контролировать его. Несмотря на то, что за последнее время был достигнут существенный прогресс в описании каскада процессов, необходимых для проникновения в ткань циркулирующих лейкоцитов из свободного кровотока, многое в данном процессе остается неясным. В частности, известных в настоящее время функций молекул адгезии недостаточно для того, чтобы объяснить все способы рециркуляции и специфичность связывания, наличие которых показано как в норме, так и в условиях воспаления.

Имеющиеся в настоящее время гипотезы исходят из многоступенчатой модели адгезии лейкоцитов с эндотелием, которая основана на каскаде последовательных, но перекрывающихся молекулярных взаимодействий между несколькими парами рецептор-лиганд (Butcher E.G. and Picker L., J. Science, 272:60-66 (1996); Springer Т. A., Cell, 76:301-314 (1994)). Первоначальные временные и ограниченные взаимодействия между лейкоцитом в кровотоке и сосудистой стенкой выполняют преимущественно селектины и их гликопротеиновые лиганды. На этой стадии могут принимать участие интегрины и другие молекулы. За стадиями качения и опробования может при наличии соответствующих сигналов наступить следующая стадия прочной адгезии, осуществляемая через связывание активированных интегринов со своими лигандами из суперсемейства Ig. Локально повышенные уровни иммобилизованных цитокинов и других хемоаттрактантов могут быть вовлечены в процесс инициации такой локальной активации, которая опосредована соответствующими рецепторами и последующей передачей сигналов внутри клетки. Заключительная стадия включает процесс миграции связанных клеток через эндотелиальную выстилку в ткань посредством очень неясного механизма. Тканеспецифичные пути циркуляции основаны на регуляции экспрессии определенных сочетаний рецептор-лиганд молекулы адгезии в соответствующем участке организма.

Ранее было описано моноклональное антитело (MAT) 1B2, которое распознает новую молекулу адгезии эндотелиальной клетки человека и может блокировать связывание лимфоцита с верхними эндотелиальными венулами миндалин (HEV) в анализе замороженных срезов (Salmi M. and Jalkanen S., Science, 257:1407-1409 (1992); Патенты США NoNo. 5512442 и 5580780 и заявки на Патент США No. 08/447799, которые приведены в настоящем описании в качестве ссылок). MAT 1B2 специфичен для указанного процесса и в этой связи может определять сосудистый белок-1 адгезии (VAP-1). При воспалении индуцируется экспрессия поверхностного VAP-1 и молекулы находятся на поверхности эндотелиальных клеток в просвете сосудов (Salmi M. et al., J. Exp. Med., 178: 2255-2260 (1993)). Методом иммунопреципитации ткани миндалин в присутствии MAT 1B2 могут быть обнаружены два вида VAP-1 с различной молекулярной массой: один из них имеет массу 90 кДа, а второй 170-180 кДа. Однако иммуноблоттинг в невосстановительных условиях приводит к преобладанию молекул массой 170-180 кДа (Salmi M. and Jalkanen S. , J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Иммунореактивные VAP-1 с незначительно различающимися молекулярными массами также могут быть обнаружены в других участках организма, в частности в клетках гладкой мускулатуры сосудистой сети, а также в других тканях, содержащих гладкомышечные клетки, хотя их функция в таких клетках остается невыясненной. МакНаб с соавторами сообщили, что VAP-1 экспрессируется на клетках эндотелия синусоидов печени и может опосредовать процесс связывания Т-лимфоцитов (McNab G. et al. , Gastroenterology, 110: 522-528 (1996)). Исследования VAP-1 из миндалин путем расщепления специфическими гликозидазами показали, что VAP-1 является сиалогликопротеином, содержащим, по всей видимости, и N-, и O-связанные сахара при наличии большого количества остатков сиаловой кислоты со связями двух типов – 2,36 и 2,6. Было также показано, что VAP-1 опосредует связывание лимфоцита с HEV в лимфатических тканях в условиях сдвига, причем в связи с сиаловой кислотой, поскольку десиалилированная молекула, как показано исследованиями замороженных срезов, уже не может участвовать в связывании лимфоцитов (Salmi M. and Jalkanen S. , J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Молекула подвергается позитивной регуляции при воспалительных состояниях при заболеваниях кожи, кишечника, миндалин и синовиальной оболочки, хотя медиаторы, вызывающие это явление, еще не определены (Arvilommi А. -М. et al., Eur. J. Immunol., 26: 825-833 (1996); Salmi M. et al., J. Exp. Med. , 178:2255-2260 (1993)). VAP-1 отличается от адрессина (PNAd) из периферического лимфатического узла (PLN), распознаваемого MAT MECA-79, хотя как VAP-1, так и PNAd могут опосредовать связывание лимфоцитов с PLN в условиях сдвига. Однако, в отличие от PNAd, VAP-1 может действовать независимо от L-селектина и способствовать связыванию L-селектин-негативных лимфоцитов (Salmi M. and Jalkanen S., J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Таким образом, VAP-1 представляет собой молекулу с важной адгезивной функцией в новом каскаде, которая действует независимо от известных селектинов и, по всей видимости, способна опосредовать ранние взаимодействия в процессах связывания лимфоцитов с PLN типа HEV.

Сущность изобретения
Изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей сосудистый белок-1 адгезии (VAP-1), выбранной из группы, состоящей из:
(а) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2);
(б) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую VAP-1, из нуклеотидной последовательности VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1);
(в) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид VAP-1, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую клоном кДНК VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536;
(г) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую VAP-1 последовательность нуклеотидной последовательности, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536;
(д) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидным последовательностям VAP-1, указанным в (а), (б), (в) или (г);
(е) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая отличается от кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (б) или (г), в связи с вырожденностью генетического кода, и
(ж) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с молекулой (д) и кодирует VAP-1, имеющий аминокислотную последовательность, демонстрирующую, по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностью VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:2).

Далее изобретение относится к способу создания рекомбинантного вектора, включающему введение молекулы, содержащей последовательность молекулы нуклеиновой кислоты для VAP-1, в последовательность ДНК, которая может функционировать в качестве вектора. Кроме того, изобретение относится к рекомбинантному вектору, включающему такую ДНК, кодирующую VAP-1. Изобретение относится к способу доставки VAP-1 в клетку-хозяина, включающему введение ДНК, кодирующей VAP-1, в клетку-хозяина. Изобретение относится, кроме того, к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей введенную таким образом ДНК. Изобретение также относится к способу получения полипептида сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), включающему культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей ДНК, кодирующую VAP-1 по настоящему изобретению, в условиях, допускающих экспрессию кодируемого полипептида VAP-1.

Далее изобретение относится к способу обеспечения аминоксидазной активности клетки-хозяина путем трансформации нуклеиновой кислотой, кодирующей VAP-1, клетки-хозяина.

Далее изобретение относится к методу изменения экспрессии сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), включающему: (а) введение в клетку-хозяина конструкции ДНК, содержащей: (i) целевую последовательность VAP-1 и (ii) регуляторную последовательность, связанную с целевой последовательностью VAP-1, и (б) содержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для проведения гомологичной рекомбинации между конструкцией ДНК и эндогенной последовательностью VAP-1. Изобретение также относится к такой клетке-хозяина, в которой экспрессия VAP-1 была изменена указанным выше способом.

Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяина, содержащей: (а) целевую последовательность VAP-1 и (б) регуляторную последовательность, связанную с целевой последовательностью VAP-1.

Изобретение относится к способу окисления амина, включающему взаимодействие амина с полипептидом VAP-1 по настоящему изобретению. Амин может представлять собой, например, бензиламин или метиламин. Полипептид VAP-1 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(а’) очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность VAP-1, приведенную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2);
(б’) очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность VAP-1, кодируемую нуклеотидной последовательностью VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:1):
(в’) очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую клоном кДНК VAP-1, хранящимся в депозитарии под No. DSM 11536;
(г’) очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность VAP-1, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с комплементом ДНК, кодирующей полипептид типа (а’)-(в’), и кодирует VAP-1, и имеет аминокислотную последовательность, которая демонстрирует, по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностью, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:2),
(д’) очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность эпитопсодержащей части полипептида по пункту (а’) или (б’).

Изобретение также относится к способу ингибирования аминоксидазной активности, включающему введение эффективного количества ингибитора в образец, обладающий аминоксидазной активностью. Указанный ингибитор может представлять собой, например, семикарбазид, гидроксиламин, пропаргиламин, изониазид, ниаламид, гидраллазин, прокарбазин, монометилгидразин, 3,5-этокси-4-аминометилпиридин или MDL72145 ((Е)-2-(3,4-диметоксифенил)-3-фтораллиламин).

Изобретение также относится к способу манипулирования процессом связывания эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованного сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), включающему изменение ферментной активности аминоксидазы в эндотелиальных клетках посредством ингибирования или потенциирования.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Последовательность кДНК VAP-1, выделенная из библиотеки кДНК, выделенной из легкого человека, и предсказанная последовательность белка VAP-1. N-концевой, триптический и V8 пептиды, которые были очищены и секвенированы из иммуноочищенного белка VAP-1, заключены в прямоугольник. Аминокислотные остатки, особо выделенные в участках, очерченных в прямоугольник, указывают на то, что к указанному циклу при секвенировании пептидов не может быть отнесен какой-то аминокислотный остаток. Потенциальные сайты N-гликозилирования указаны стрелками с кружками, тогда как аспарагины и предположительные сайты О-гликозилирования указаны стрелками с квадратами. Трансмембранный домен между остатками 5 и 27 отмечен затемнением. Масштаб диаграммы в нижней части фигур указывает положение трансмембранного домена (показан заполненным TMD регионом), а относительное расположение предположительных сайтов гликозилирования во внеклеточной части молекулы помечено N или О для того, чтобы обозначать соответственно N- и O-связанный сахар. Масштабная стрелка обозначает 50 аминокислот.

Фиг. 2. Анализ методом сортировки клеток по интенсивности флюоресценции (FACS анализ) COS-7 клеток, трансфицированных относительно VAP-1, для определения ориентации мембраны и расположения VAP-1 в клетке. Диаграмма, показывающая структуру двух плазмид экспрессии VAP-1, используемых для трансфекции COS-7 клеток, приведена в верхней части фигуры. VAP-1 представляет собой нативную конструкцию экспрессии VAP-1. FLAG VAP-1 представляет собой VAP-1 с эпитопом FLAG, введенным для маркировки. Негативный контроль на псевдотрансфекцию, назовем его для краткости “псевдоконтроль”, обеспечивается конструкцией, в которой VAP-1 имеет обратную ориентацию вектора экспрессии. Колонка 1: Экспрессия конструкции, используемой для трансфекции. Колонка 2: Отсутствие пермеабилизации (-) или наличие пермеабилизации (+) у трансфицированных клеток. Колонка 3: Негативный контроль при MAT окрашивании. Колонка 4: Окрашивание с использованием MAT 1B2 против VAP-1. Колонка 5: Окрашивание с использованием MAT M2 против FLAG. Ряды A-F указывают конструкцию экспрессии или тест на “псевдоконтроль”, используемый при трансфекции, и результаты окрашивания трансфицированных клеток. Стрелки указывают позитивно окрашиваемые популяции клеток. На непермеабилизованных клетках окрашивание отмечается при использовании MAT 1B2 против VAP-1 (ряды В и С картины сортировки клеток по интенсивности флюоресценции, колонка 4). Тест на “псевдоконтроль” трансфицированных клеток был негативным (ряд А картины сортировки клеток по интенсивности флюоресценции, колонка 4). Не отмечается окрашивания при использовании MAT против FLAG в VAP-1 FLAG-трансфицированных клетках (ряд С, колонка 5). Однако, в случае пермеабилизованных клеток, VAP-1-трансфицированные клетки все еще являются позитивными на окрашивание (ряд Е, колонка 4), при этом VAP-1 FLAG-трансфицированные клетки также окрашиваются позитивно с использованием MAT против FLAG (ряд F, колонка 5), что указывает на то, что пермеабилизация клеток в отношении MAT против FLAG позволяет указанным антителам осуществить доступ к FLAG эпитопу, и это свидетельствует в пользу того, что данный эпитоп лежит внутри клетки.

Фиг. 3. Выстраивание представителей семейства медьсодержащих аминоксидаз млекопитающих, для которых имеются данные по последовательности, включая VAP-1. Метки слева относятся к конкретному, расположенному правее белку. БСАО обозначает аминоксидазу из сыворотки быка; VAP-1 обозначает человеческий сосудистый белок адгезии; ПДАO1 обозначает плацентарную диаминоксидазу человека 1; ПДАO2 – плацентарную диаминоксидазу человека 2; ДАО крысы – крысиную диаминоксидазу. Цифры соответствуют первой аминокислоте в каждом ряду сгруппированных белков. Последовательности взяты из самой свежей доступной базы данных и сгруппированы с использованием программы GCG Pileup. Остатки, характеризующиеся идентичностью с VAP-1, выделены с использованием программы GCG Box-shade.

Фиг. 4. Обработка сиалидазой VAP-1, экспрессируемого в COS-7 клетках. Клеточные лизаты из VAP-1-трансфицированных и псевдотрансфицированных COS-7 клеток обрабатывают сиалидазой (+) или не обрабатывают (-) перед проведением ДСН-ПААГ, после чего проводят иммуноблоттинг и обработку зондом MAT 1B2 для VAP-1 (дорожки 1-4) или тест на негативный контроль с использованием MAT 3G6 (дорожки 5-8).

Фиг. 5. А. Нозерн-блоттинг мРНК VAP-1 с поли А⁺ РНК, выделенной из гладкой мускулатуры кишки человека и стромы миндалин, из которых лимфоциты были частично удалены промыванием и сжатием. Гибридизованная мРНК размером 4,2 килобайта видна на обоих треках. В. Нозерн-блоттинг мРНК VAP-1 из различных тканей человека. Нозерн-блотты получают от Clon-tech Laboratories и на каждую дорожку вводят равное количество мРНК. Все фильтры нагружают ³²Р-меченными зондами кДНК VAP-1, содержащими полную кодирующую последовательность, и промывают их под строгим контролем (условия промывания после гибридизации: 0,1 х SSC, 0,1% ДСН при 65^oС, дважды в течение 45 минут).

Фиг. 6. Ax клетки, трансфицированные кДНК VAP-1, опосредуют адгезию лимфоцитов. А. Экспрессия VAP-1 на поверхности Ах клеток, стабильно трансфицированных кДНК VAP-1 или в тесте на “псевдоконтроль”. На гистограммах интенсивность окрашивания на логарифмической шкале показана на оси Х и относительное количество клеток показано на оси Y. В. Увеличение уровня VAP-1-зависимого связывания лимфоцитов с VAP-1-трансфектантами. Значительное большее количество PBL (малые круглые сферы на верхней части монослоя, примеры которых указаны стрелками) связывается с VAP-1-трансфектантами (слева), чем с псевдотрансфектантами (справа). Фазовоконтрастные микрофотографии, увеличение х 100. С. Количественное определение связывания. Результаты пяти независимых экспериментов, представлены в виде среднего значения СКО.

Подробное описание изобретения
Взаимодействие между рецепторами на поверхности лейкоцитов и их лигандами на эндотелиальных клетках сосудов представляет собой решающий этап в механизме контроля перемещения лимфоцитов между кровью и различными лимфоидными органами, а также имеет отношение к транссудации лейкоцитов в места воспаления. Описан клон кДНК, кодирующей сосудистый белок-1 адгезии (VAP-1), который опосредует реакцию адгезии лейкоцит-эндотелиальная клетка. Оказалось, что кодируемый VAP-1 обладает аминоксидазной активностью. Считается, что в высших организмах аминоксидаза включается в метаболизм биогенных аминов (McIntire W. and С. Hartmann, in Principles and Applications of Quinoproteins, V. L. Davidson, ed. , Marcel Dekker, Inc., N. Y., Chap. 6 (1992)).

Настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), имеющий аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), которая было определена секвенированием клона кДНК, имеющего нуклеотидную последовательность, указанную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1). Клон, содержащий указанную нуклеотидную последовательность, был депонирован в соответствии с условиями Будапештского Договора в Международном депозитарии (International Depository Authority of DSMZ-Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zeilkulturen GmbH) по адресу Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Германия, 7 мая 1997 года под No. DSM 11536. Депонированный клон содержится в плазмиде pUC19.

На колонке с моноклональным антителом (MAT) для иммуноаффинного разделения были очищены мономерные и димерные формы VAP-1, размером 90 и 170-180 кДа соответственно, которые были выделены из обработанных детергентом лизатов гладких мышц в достаточном количестве для того, чтобы определить внутреннюю пептидную последовательность после расщепления трипсином и протеазой V8. Часть VAP-1 размером 90 кДа подвергнута процедуре N-концевого секвенирования и использована далее для конструирования частично вырожденных олигонуклеотидных праймеров для экспериментов в рамках полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой ОТ-ПЦР с использованием мРНК, полученной из гладких мышц кишки человека.

Один фрагмент кДНК размером примерно 700 нуклеотидных пар амплифицируют с использованием указанных праймеров и клонируют в pUC18 с целью определения его последовательности. Для обнаружения более длинных клонов кДНК методом ПЦР анализируют набор из четырех человеческих кДНК в библиотеке кДНК для определения тех из них, которые содержат кДНК VAP-1, и библиотеки, демонстрирующие наивысший сигнал, подвергают скринингу с использованием фрагмента кДНК VAP-1, полученного в результате ПЦР. Указанным способом выделяют из библиотек кДНК, выделенных из легкого и сердца человека, множество перекрывающихся клонов кДНК. Из указанных клонов была получена одна кДНК размером 2501 нуклеотидных пар, описанная на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), которая содержит непрерывную открытую рамку считывания размером в 2292 п.н., начинающуюся от АТГ-метионинового кодона, и далее субклонирована в pUC19. Определенная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК VAP-1, содержащаяся в этом клоне и показанная на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок из 763 аминокислотных остатков, представленный на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), с расположением инициирующего кодона на участке 80-82 нуклеотидной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), имеющей молекулярный вес около 84,6 кДа.

VAP-1 по настоящему изобретению обладает выраженной идентичностью к семейству ферментов, относящихся к медьсодержащим аминоксидазам (ЕС 1.4.3.6.). Белок VAP-1, показанный на фигуре 1 (SEQ ID NО:2), характеризуется примерно 24% идентичностью к Сu-моноаминоксидазе Escherichia coli и имеет 41-81% сходство с представителями этого семейства у млекопитающих. Наивысшая идентичность была показана с аминоксидазой из бычьей сыворотки (81%).

Если не указывается иное, то приведенный в описании термин “нуклеотидная последовательность” относится к последовательности дезоксирибонуклеотидов (сокращенно A, G, С и Т). При этом под “нуклеотидной последовательностью” молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотида подразумевается молекула ДНК или полинуклеотида, состоящая из последовательности дезоксирибонуклеотидов. В случае молекулы РНК или полинуклеотида соответствующая последовательность состоит из рибонуклеотидов (А, G, С и U), где каждый тимидиновый дезоксирибонуклеотид (Т) в специфической дезоксирибонуклеотидной последовательности замещен рибонуклеотидом уридином (U).

Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут представлять собой РНК, такой как мРНК или ДНК, включая кДНК и геномную ДНК, получаемые при клонировании или в ходе синтеза. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Одноцепочечные ДНК или РНК могут представлять собой кодирующую цепь, известную также как смысловая цепь, или некодирующую цепь, которую также называют антисмысловой цепью, или комплементом.

Под термином молекула(ы) “очищенной” нуклеиновой кислоты подразумевается молекула нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК, которую выделяют из нативного источника или получают синтетически. Очищенные молекулы РНК включают полученные in vitro транскрипты РНК или молекулы ДНК по настоящему изобретению.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекулам очищенной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид VAP-1, обладающий аминокислотной последовательностью, кодируемой клоном кДНК, содержащейся в плазмиде, депонированной в депозитарии 7 мая 1997 г. под No. DSM 11536. Изобретение также относится к молекуле очищенной нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO:1), или нуклеотидную последовательность кДНК VAP-1, содержащейся в описанном выше депонированном клоне, или к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, комплементарную к одной из вышеуказанных последовательностей. Такие изолированные молекулы, в особенности молекулы ДНК, используют в качестве зондов для генного картирования при гибридизации in situ с хромосомами и для обнаружения экспрессии гена VAP-1 в тканях человека, например, методом нозерн-блотт-анализа.

Далее настоящее изобретение относится к фрагментам молекул очищенной нуклеиновой кислоты, приведенным в настоящем описании. Под фрагментом молекулы очищенной нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеиновую последовательность VAP-1 депонированной кДНК или нуклеотидную последовательность VAP-1, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO:1), понимают фрагменты размером, по меньшей мере, около 15 нуклеотидов и более предпочтительно, по меньшей мере, около 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере, около 30 нуклеотидов и еще более предпочтительно, по меньшей мере, около 40 нуклеотидов в длину, которые используют в качестве диагностических зондов и праймеров в соответствии с приведенным описанием. Разумеется, более крупные фрагменты длиной 50-1500 нуклеотидов также могут применяться в рамках настоящего изобретения, если они являются фрагментами, соответствующими в основном или полностью, нуклеотидной последовательности депонированной кДНК или последовательности, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:1). Поскольку ген VAP-1 был депонирован, и известна нуклеотидная последовательность, показанная на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), создание таких фрагментов ДНК представляет собой рутинную процедуру для специалистов в данной области. Так, например, для создания фрагментов различной длины могут использоваться такие процедуры, как расщепление рестриктазами, разрушение озвучиванием или олигонуклеотидный синтез.

В другом своем аспекте изобретение относится к молекуле очищенной нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, которая гибридизуется под строгим контролем гибридизации с частью полинуклеотида в молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, описанной выше, например с клоном кДНК VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536. Под “строгим контролем гибридизации” понимают инкубацию в течение ночи при 42^oС в растворе, включающем 50% формамида, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитратной соли), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 х раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 г/мл денатурированной, разрушенной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 0,1 x SSC при температуре примерно 65^oС.

Под нуклеотидом, который гибридизуется с “частью” полинуклеотида понимают полинуклеотид (либо ДНК, либо РНК), гибридизующийся, по меньшей мере, на протяжении 15 нуклеотидов (нт) и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 20 нт, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 30 нт и еще предпочтительнее примерно на 30-70 нт со стандартным полинуклеотидом. Они могут использоваться как диагностические зонды и праймеры. Разумеется, полинуклеотиды, гибридизующиеся на большем протяжении со стандартным полинуклеотидом (например, с клоном депонированной кДНК), например на участке длиной 50-750 нт или еще большей протяженности со стандартным полинуклеотидом, также могут использоваться в качестве зондов по настоящему изобретению, если они представляют собой полинуклеотиды, соответствующие в основном или полностью нуклеотидной последовательности VAP-1 депонированной кДНК или нуклеотидной последовательности, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1). Такие части используются с диагностической целью либо как зонды в рамках традиционной техники гибридизации ДНК, либо как праймеры для амплификации целевой последовательности в полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в литературе (например, в Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis Т., eds.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Молекулы очищенной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают молекулы ДНК, содержащие открытую рамку считывания (ОРС) с положением инициирующего кодона на участке 80-82 на нуклеотидной последовательности VAP-1, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), а также молекулы ДНК, которые включают последовательность, принципиально отличную от описанной выше, но которая в связи с вырожденностью генетического кода может кодировать белок VAP-1. Несомненно, генетический код хорошо известен специалистам в данной области, и для специалистов со средним уровнем знаний в данной области получение выраженных вариантов представляет собой рутинную процедуру.

Далее настоящее изобретение относится к вариантам молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые кодируют части, аналоги или производные белка VAP-1. Варианты могут быть природными, такими как натуральные аллельные или сплайсинг-варианты. Под “аллельным вариантом” понимают одну из нескольких альтернативных форм гена, занимающего определенный локус на хромосоме организма (Genes II, Lewin В. , ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Варианты, не встречающиеся в естественном состоянии, могут быть получены с использованием техники мутагенеза, известной специалистам.

Такие варианты включают формы, получаемые при осуществлении замещения нуклеотидов, делеций или вставок. Замещения, делеции или вставки могут включать один или более нуклеотидов. Варианты могут содержать изменения в кодирующих регионах, некодирующих регионах или в обоих типах регионов. Изменения в кодирующих регионах могут приводить к получению консервативных или неконсервативных аминокислотных замещений, делеций или вставок. Особенно предпочтительными среди них являются молчащие замены, вставки и делеции, которые не изменяют свойств и активности белка VAP-1 или его частей. Также к числу особенно предпочтительных в этом отношении относятся консервативные замены.

Другие варианты реализации настоящего изобретения включают молекулы очищенной нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% и более предпочтительно, по меньшей мере, на 95, 96, 97, 98 или 99% (а) молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1 (SEQ ID NO:2); (б) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность VAP-1 из нуклеотидной последовательности VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1); (в) молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид VAP-1, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую клоном кЦНК VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536; (г) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность нуклеотидной последовательности VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536; (д) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидным последовательностям VAP-1, приведенным в пунктах (а), (б), (в) или (г); (е) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая отличается от кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по пунктам (б) или (г) в связи с вырожденностью генетического кода, и (ж) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с молекулой (д) и кодирует VAP-1, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90% демонстрирует идентичность последовательности VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2). Указанное свойство не зависит от того, имеет ли кодируемый ими полипептид VAP-1 активность. Поскольку если даже данная молекула нуклеиновой кислоты не кодирует полипептид, обладающий VAP-1 активностью, любой специалист со средним уровнем в данной области знает, как использовать молекулу нуклеиновой кислоты, например, в качестве гибридизационного зонда или в качестве праймера в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом предпочтительны молекулы нуклеиновой кислоты, которые имеют последовательности, идентичные, по меньшей мере, на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности нуклеиновой кислоты VAP-1, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), или последовательности нуклеиновой кислоты VAP-1 депонированной кДНК, которая фактически кодирует полипептид, обладающий активностью VAP-1 белка.

Под фразой “полинуклеотид, обладающий нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, например, на 90% “идентична” стандартной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид VAP-1″, подразумевают, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична стандартной последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать до десяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов стандартной нуклеотидной последовательности, кодирующей VAP-1 полипептид. В том случае, когда молекула любой конкретной нуклеиновой кислоты идентична, по меньшей мере, на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, например, нуклеотидной последовательности VAP-1, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), или нуклеотидной последовательности клона депонированной кДНК, она может быть определена традиционным способом с использованием известных компьютерных программ, таких как Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).

Векторы и клетки-хозяины
Настоящее изобретение также относится к векторам, которые включают молекулы очищенной ДНК по настоящему изобретению, клеткам-хозяинам, которые были сконструированы генетическими методами с помощью ДНК, кодирующей VAP-1, и к получению полипептидов VAP-1 или их фрагментов с помощью рекомбинантной техники.

Полинуклеотиды могут быть соединены с вектором, содержащим селектируемый маркер, для размножения в клетке-хозяине. В общем случае плазмидный вектор вводят в виде осадка, такого как осадок фосфата кальция или в комплексе с заряженным липидом. Если вектор представляет собой вирус, он может быть собран in vitro с использованием соответствующей сборочной клеточной линии и перенесен в клетки-хозяина методом трансдукции. Селектируемые маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину культур эукариотических клеток, или наличие генов устойчивости к тетрациклину или ампицилину в культурах Е. coli и других бактерий.

Предпочтительными являются векторы, включающие цис-активные контролирующие участки в отношении интересующих полинуклеотидов. Соответствующие транс-активные факторы также могут быть введены в клетку-хозяина с помощью комплементного вектора или самим рассматриваемым вектором при его интродукции в клетку-хозяина. В некоторых предпочтительных в этом отношении вариантах реализации изобретения векторы обеспечивают специфическую экспрессию, которая может быть индуцибельной и/или специфичной для того или иного типа клеток. Особенно предпочтительными среди них являются индуцибельные под действием факторов окружающей среды векторы, которыми можно легко манипулировать с помощью таких факторов, как температура и пищевые добавки.

Векторы экспрессии, применяемые по настоящему изобретению, включают векторы, производные из хромосом, эписом и вирусов, например векторы, полученные на основе бактериальных плазмид, бактериофага, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также векторы, полученные из их сочетаний, такие как космиды и фагемиды.

ДНК-вставка должна оперативно связываться с соответствующим промотором, таким как промотор фага лямбда _L, промоторы Е. coli lac, trp и tac, ранние и поздние промоторы SV40, а также промоторы ретровирусных длинных повторов на конце генома (LTR), которых можно назвать несколько. Специалистам в данной области известны другие подходящие промоторы. Экспрессируемые конструкции должны также содержать сайты для инициации транскрипции, ее терминации, а в транскрибируемых регионах – сайты связывания с рибосомами для осуществления трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых указанными конструкциями, предпочтительно включает участок инициации трансляции в ее начале и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), расположенный соответственно в конце кодирующей последовательности.

Технология, основанная на рекомбинантной ДНК, включает также методы рекомбинации, описанные в работе Треко с соавт. (Treco et al., WO 94/12650 и Treco et al. , WO 95/31560), которые приведены в настоящем описании в качестве ссылки, и эти методы могут применяться для изменения экспрессии VAP-1 и активности аминоксидазы в клетках. Специфически регуляторные участки (например, промоторы) могут быть введены в хозяйский геном с целью изменения экспрессии эндогенного VAP-1.

Таким образом, изобретение относится к методу получения рекомбинантой хозяйской клетки с измененной экспрессией сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), включающему: (а) введение в хозяйскую клетку конструкции ДНК, включающей: (i) целевую последовательность VAP-1 и (ii) регуляторную последовательность, связанную с целевой последовательностью VAP-1, и (б) помещение хозяйской клетки в условия, подходящие для осуществления гомологичной рекомбинации между конструкцией ДНК и эндогеннной последовательностью VAP-1. Изобретение также относится к рекомбинантной хозяйской клетке, в которой экспрессия VAP-1 изменена указанным выше методом.

Изобретение также относится к методу изменения экспрессии гена VAP-1 за счет, например, активации экспрессии VAP-1 в клетке, которая нормально не экспрессирует или не экспрессирует нормально в желательных условиях окружающей среды или гормональных условиях. Изменение экспрессии VAP-1 может также включать использование последовательности по настоящему изобретению для цели инактивации экспрессии нативного гена. Гомологичную рекомбинацию или сайт-направленное воздействие используют для замены или нарушения регуляторного участка, в нормальных условиях связанного с эндогенным геном VAP-1, с регуляторной последовательностью, которая приводит к экспрессии гена на более высоком уровне, чем это имеет место в соответствующих нетрансфицированных клетках, или создает такую картину проявления гена, которая отличается от таковой, наблюдаемой в соответствующих нетрансфицированных клетках с точки зрения регуляции и индукции. В этой связи изобретение относится к методу получения белков посредством активации эндогенного гена, который кодирует желательный продукт в клетках.

Если мишенью является конструкция ДНК, она должна включать, по меньшей мере, целевую последовательность и предпочтительно также регуляторную последовательность. Как было описано в работах Треко с соавт. (Treco et al., WO 94/12650, и Treco et al., WO 95/31560), зачастую к ним добавляются другие компоненты конструкции, такие как селектируемые маркеры, амплифицируемые маркеры или экзон и не связанные сплайсинг-донорные сайты. ДНК в такой конструкции может рассматриваться как экзогенная ДНК, которую вводят в хозяйскую клетку по методу настоящего изобретения. Экзогенная ДНК может содержать последовательности, идентичные или отличные от эндогенной ДНК, которая присутствовала в клетке до трансфекции.

Целевая последовательность или последовательности конструкции ДНК представляют собой последовательности ДНК, которые позволяют осуществлять разрешенную гомологичную рекомбинацию в геноме выбранной клетки, содержащей ген VAP-1 в локусе VAP-1. Целевые последовательности представляют собой, например, последовательности ДНК, гомологичные последовательностям ДНК VAP-1, которые в норме присутствуют в геноме полученных клеток и расположены в основном на обоих концах регуляторной последовательности. Используемую(ые) целевую(ые) последовательность(ти) выбирают с учетом сайта VAP-1, в который конструкцию ДНК предстоит вставить.

Регуляторная последовательность конструкции ДНК может состоять из одного или более промоторов, энхансеров, участков контакта с несущей структурой или сайтов присоединения матрицы, негативных регуляторных элементов, сайтов связывания с факторами транскрипции или их комбинации.

Сайт введения последовательности ДНК в основном находится внутри эндогенного гена VAP-1 или в направлении, обратном транскрипции, или в сайте, влияющем на функцию гена VAP-1. Последовательности ДНК, которые изменяют экспрессию эндогенного гена VAP-1, могут быть введены в хозяйскую клетку в виде единой конструкции ДНК или в виде отдельных последовательностей ДНК, которые в геноме трансфицированной клетки переходят в физически связанное состояние. При этом ДНК может быть введена в виде линейной, двойной двухцепочечной ДНК, при наличии одноцепочечных участков на одном или обоих концах или без них, или ДНК может быть введена в виде кольцевой ДНК. После введения регуляторной ДНК в хозяйскую клетку указанную клетку помещают в условия, подходящие для осуществления гомологичной рекомбинации между геномной ДНК и частью введенной ДНК. Гомологичная рекомбинация между геномной ДНК и введенной ДНК приводит к получению гомологичной рекомбинантной хозяйской клетки, в которой последовательности, изменяющие экспрессию эндогенного гена VAP-1, оперативно связаны с геном VAP-1. Получаемые по этому методу гомологичные рекомбинантные клетки-хозяина могут культивироваться в условиях, пригодных для экспрессии белка VAP-1, что приводит к продукции белка VAP-1 in vitro, или клетки могут использоваться для доставки in vivo белка VAP-1 (например, при генной терапии).

Целенаправленная процедура может представлять собой простое введение регуляторной последовательности, помещение эндогенного гена VAP-1 под контроль новой регуляторной последовательности (например, при инсерции промотора или энхансера или их обоих в направлении, обратном ходу транскрипции эндогенного гена). Целенаправленная процедура может представлять собой простую делецию регуляторного элемента, такую как делецию тканеспецифичного негативного регуляторного элемента. Целенаправленная процедура может приводить к замещению существующего элемента; например, тканеспецифичный энхансер может быть замещен другим энхансером с более широкой или иной специфичностью в отношении клеточного типа, чем натуральные элементы, или с другой картиной регуляции или индукции, отличной от имеющейся в соответствующей нетрасфицированной клетке.

Целенаправленное воздействие на ген может использоваться для замены существующего регуляторного участка VAP-1 регуляторной последовательностью, выделенной из другого гена, или новой регуляторной последовательностью, синтезированной генно-инженерными методами. В соответствии с настоящим методом, введение экзогенной ДНК приводит к нарушению эндогенных последовательностей, которые контролируют экспрессию эндогенного гена VAP-1 либо за счет замены всех или части эндогенной (геномной) последовательности, либо посредством другого вида воздействия, нарушающего функционирование эндогенной последовательности.

Конструкции ДНК, которые включают экзогенную ДНК и необязательно ДНК, кодирующую селектируемый маркер, вместе с дополнительными последовательностями, необходимыми для экспрессии экзогенной ДНК в реципиентных хозяйских клетках, используют для трансфекции клеток, в которых планируется изменить продукцию VAP-1. В работах Треко с соавт. описаны более детально методы гомологичной рекомбинации, применяемые для изменения экспрессии эндогенного гена (Treco et al. , WO 94/12650, и Treco et al., WO 95/31560), которые приведены в настоящем описании в качестве ссылок.

ДНК или рекомбинантные конструкции могут быть введены в клетки с помощью различных методов, включая трансформацию, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, трансдукцию, осаждение фосфатом кальция, а также трансфекцию, которая связана с участием липосомам, полибрена или ДЭАЭ-декстрана. Указанные методы описаны во многих лабораторных руководствах (таких как Davis et al. , Basic Methods In Molecular Biology (1986)). Альтернативно для введения конструкции ДНК могут использоваться инфицирующие векторы, такие как векторы на основе ретровирусов, герпеса, аденовируса, связанного с аденовирусом фактора, эпидемического паротита и полиовируса.

Примеры подходящих хозяйских клеток включают, не ограничиваясь ими, бактериальные клетки, такие как клетки E.coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium, грибные клетки, такие как клетки дрожжей, клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9, клетки животных, такие как клетки Ах и CRL 1998 (оба вида представляют собой эндотелиальные клетки), меланомные клетки СНО, COS и Bowes, а также растительные клетки. Соответствующие среды для культивирования и условия культивирования описанных выше хозяйских клеток известны в технике.

Подходящие прокариотические и эукариотические клетки хорошо известны специалистам в данной области.

Известные бактериальные промоторы, пригодные для использования по настоящему изобретению, включают промоторы Е. coli и lacZ, T3 и Т7 промоторы, промотор gpt, промоторы лямбда P_R и P_L, а также промотор trp. Подходящие эукариотические промоторы включают ранний промотор CMV, тимидинкиназный промотор HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы длинных повторов РНК на концах генома ретровирусов (LTR), такие как в вирусе саркомы Рауса (RSV), и металлотионеиновые промоторы, такие как металлотионеин-1 промотор мышей.

Транскрипция ДНК, кодирующей полипептид VAP-1 по
настоящему изобретению, высшими эукариотами может быть усилена за счет вставки энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры представляют собой цис-активные элементы ДНК, составляющие обычно от 10 до 300 нуклеотидных пар в длину, которые способны усиливать транскрипционную активность промотора в данном типе хозяйской клетки. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который расположен на поздней стороне сайта инициации репликации на участке от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы, расположенный на поздней стороне сайта инициации репликации, и энхансеры аденовируса.

Полипептид VAP-1 может экспрессироваться в модифицированном виде, таком как слитый белок, и может включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные участки. Так, например, может быть добавлен участок из дополнительных аминокислот, в особенности из заряженных аминокислот, к N-концу полипептида VAP-1 для улучшения стабильности и персистенции в хозяйской клетке в ходе очистки или при последующей работе и хранении. Кроме того, для облегчения очистки к полипетиду VAP-1 могут быть добавлены пептидные части. Такие участки могут быть удалены на финальной стадии перед получением полипептида. Добавление пептидных частей к полипептидам для придания способности к секреции или экскреции, для улучшения стабильности и для облегчения очистки представляет собой известную и рутинную процедуру в числе других, используемых для этой цели методов.

Белок VAP-1 может быть выделен и очищен из культур рекомбинантных клеток с помощью известных методов, включающих осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анион- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию, основанную на гидрофобном взаимодействии, афинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Полипептиды по настоящему изобретению включают природные очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные с использованием рекомбинантной техники из прокариотических или эукариотических хозяйских клеток, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от природы хозяйской клетки, применяемой в процедуре получения рекомбинанта, полипептиды по настоящему изобретению могут представлять собой гликозилированные или негликозилированные продукты.

Полипептиды VAP-1 и их фрагменты
Установленная и приведенная на фигуре 1 (SEQ ID NО:1) нуклеотидная последовательность кДНК VAP-1 содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок из 763 аминокислотных остатков, показанных на фигуре 1 (SEQ ID NО:2), с положением инициирующего кодона на участке 80-82 нуклеотидной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), которая характеризуется молекулярным весом 84,6 кДа. Белок имеет 6 потенциальных сайтов N-гликозилирования и 3 предположительных сайта O-гликозилирования в расчете на один мономер (фиг.1) (определение проведено с использованием для прогнозирования сайта O-гликозилирования сервера E-mail NetO-glic@cbs.dtu.dk (Hansen et al., Biochem. J., 308:801-813 (1995)).

Таким образом, настоящее изобретение относится также к очищенному полипептиду VAP-1, имеющему аминокислотную последовательность, кодируемую депонированной кДНК, или аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2), или к пептиду или полипептиду, включающему часть вышеуказанных полипептидов. Термины “пептид” и “олигопептид” рассматриваются как синонимы (как это обычно принято), и каждый из этих терминов может использоваться для любого из описываемых случаев в зависимости от контекста для указания цепи, содержащей, по меньшей мере, две аминокислоты, связанные пептидной связью.

В технике известно, что некоторые аминокислотные последовательности полипептида VAP-1 могут быть изменены без оказания серьезного воздействия на структуру или функцию белка. Таким образом, настоящее изобретение также включает вариации полипептида VAP-1, которые демонстрируют существенную активность VAP-1. Такие мутанты включают делеции, инсерции, инверсии, повторы и замены сходных остатков. Небольшие изменения таких “нейтральных” аминокислотных замещений в основном оказывают незначительный эффект на активность. Правила, позволяющие определить, какие аминокислотные изменения будут скорее всего фенотипически молчащими (например, не должны оказывать выраженного вредного воздействия на функцию), можно найти в работе Боуи с соавт. (Bowie J. U. et al. , Science, 247:1306-1310 (1990)). Изменения имеют предпочтительно минорную природу и относятся, например, к замещениям консервативных аминокислот, которые не влияют в значительной мере на складывание или активность белка VAP-1.

Аминокислоты в белке VAP-1 по настоящему изобретению, которые необходимы для его функционирования, могут быть определены известными в технике методами, такими как сайт-направленный мутагенез и делеционный анализ. Полученные мутантные молекулы затем тестируют на наличие биологической активности, такой как аминоксидазная активность или адгезивная функция.

Полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно представлены в очищенной форме. Полученная рекомбинантным методом версия полипептида VAP-1 может быть по существу очищена, например, с помощью одностадийной процедуры, описанной в работе Смита и Джонсона (Smith and Johnson, Gene, 67:31-40 (1988)).

Полипептиды по настоящему изобретению включают полипептиды, которые имеют, по меньшей мере, на 90% сходство, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% сходство и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 96, 97, 98 или 99% сходство с вышеописанными полипептидами. Другие полипептиды по настоящему изобретению включают полипептиды, идентичные, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, идентичные, по меньшей мере, на 90 или 95%, и еще более предпочтительно, идентичные, по меньшей мере, на 96, 97, 98 или 99% полипептиду VAP-1, кодируемому депонированной кДНК, или полипептиду VAP-1, приведенному на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), а также включают части таких полипептидов, содержащих, по меньшей мере, 30 аминокислот, и более предпочтительно, по меньшей мере, 50 аминокислот.

Под полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, по меньшей мере, например, на 90% “идентичную” стандартной аминокислотной последовательности VAP-1, подразумевают, что аминокислотная последовательность полипептида идентична стандартной последовательности, за тем исключением, что указанная полипептидная последовательность может включать до десяти аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот в стандартном аминокислотном наборе полипептида VAP-1.

Полипептиды по настоящему изобретению могут также использоваться с целью повышения продукции моноклональных антител, которые используются для обнаружения экспрессии белка VAP-1 или в качестве агонистов или антогонистов, способных усиливать или ингибировать функционирование белка VAP-1. Более подробно процедура повышения продукции моноклональных антител против VAP-1 описана в работе Салми и Джалканена (Salmi М. and Jalkanen S., Science, 257: 1407-1409 (1992), в патентах США NoNo. 5512442 и 5580780 и в заявке на Патент США No. 08/447799, которые приведены в настоящем описании в качестве ссылок. Далее, такие полипептиды могут использоваться в двугибридной системе дрожжей (Fields and Song, Nature, 340:245-246 (1989)) для “захвата” белков, связывающих белок VAP-1, которые также могут представлять собой агонисты и антагонисты по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения термин “антитело” (AT) или “моноклональное антитело” (MAT) включает интактные молекулы, а также фрагменты антител (такие, например, как Fab и F(ab’)₂ фрагменты), которые способны специфически связывать белок VAP-1. Фрагменты Fab и F(ab’)₂ не содержат Fc фрагмента интактного антитела, который быстрее выводится из циркуляции, и в этой связи они могут иметь меньшую способность связываться с неспецифичными тканями, чем интактное антитело (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)). Таким образом, указанные фрагменты являются предпочтительными.

Антитела по настоящему изобретению получают с помощью любого из имеющегося множества методов. Так, например, клетки, экспрессирующие белок VAP-1 или его антигенный фрагмент, могут быть введены в организм животного для индукции образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела. В рамках предпочтительного метода получают и очищают белок VAP-1 для получения по существу свободного от природного загрязнения препарата. Затем такой препарат вводят в организм животного для продукции поликлональной антисыворотки с большей удельной активностью.

В рамках наиболее предпочтительного метода антитела по настоящему изобретению представляют собой моноклональные антитела (или их фрагменты, связывающиеся с белком VAP-1). Такие моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомной техники (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. , 6:292 (1976); Hammerling et al., In:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. (1981), pp.563-681).

Следует иметь в виду, что Fab, F(ab’)₂ и другие фрагменты антител по настоящему изобретению могут также использоваться в соответствии с методами, раскрытыми в настоящем описании. Такие фрагменты в типичном случае получают при протеолитическом расщеплении с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab фрагментов) или пепсин (для получения F(ab’)₂ фрагментов). Альтернативно фрагменты для связывания с белком VAP-1 могут быть получены при использовании техники рекомбинантной ДНК или методов химического синтеза.

“Гуманизированные” химерные моноклональные антитела могут быть получены с использованием генетических конструкций, образованных на основе гибридомных клеток, продуцирующих описанные выше моноклональные антитела. Методы получения химерных антител известны в технике (см. обзор Morrison, Science, 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4:214 (1986); Cabilly et al. Патент США No. 4816567; Taniguchi et al., EP 171496.

Использование VAP-1
VAP-1 по настоящему изобретению обладает значительным уровнем идентичности с семейством ферментов, относящихся к медь-содержащим аминоксидазам (код по классификации ферментов ЕС 1.4.3.6). Белок VAP-1, приведенный на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), примерно на 24% идентичен Cu-аминоксидазе Escherichia coli и примерно на 41-81% сходен с представителями этого семейства у млекопитающих. Наивысший уровень идентичности показан при сравнении с аминоксидазой из сыворотки быка (81%). С использованием бензиламина – субстрата моноаминоксидазы (МАО) была обнаружена значительная энзиматическая активность аминоксидазы в экспрессирующих VAP-1 клетках СНО, но не в псевдотрансфицированных клетках. В присутствии ингибиторов медьсодержащих моноаминоксидаз – семикарбазида и гидроксиламина было показано, что VAP-1 не активен против бензиламина.

Таким образом, пептиды, кодируемые ДНК по настоящему изобретению, могут использоваться для энзиматического окисления амина в реакции амина с полипептидом VAP-1, обладающим аминоксидазной активностью. Амин может, например, относиться к ряду эндогенных и ксенобиотических ароматических аминов. Кроме того, амин может относиться к некоторым эндогенным и ксенобиотическим алифатическим аминам, таким как метиламин. Предпочтительно амин представляет собой бензиламин.

Условия определения аминоксидазной активности при использовании бензиламина в качестве субстрата аминоксидазы детально описаны ниже в разделе Материалы и методы. В конечный объем, равный 0,2-5 мл, предпочтительно в конечный объем, равный 0,5 мл, добавляют натрий-фосфатный буфер до конечной концентрации 0,05-0,2 мМ, предпочтительно 0,1 мМ. Затем добавляют немеченый бензиламин до концентрации 1-100 нмоль, предпочтительно 80 нмоль, и вводят ¹⁴С-бензиламин, так чтобы активность составляла 0,1-1,0 мкCi, предпочтительно 0,4 мкCi. Для проведения теста добавляют образец клеточного лизата объемом 0,05-0,5 мл, предпочтительно 0,1 мл. После инкубации при 37^oС в течение 1 часа альдегидный продукт аминоксидазной реакции экстрагируют толуолом, содержащим 0,1-05 г/л, предпочтительно 0,35 г/л, дифенилоксазола. Может быть проведена дополнительная экстракция с использованием толуол/дифенилоксазольной смеси. В первой экстракции (и второй экстракции) определяют уровень ¹⁴С радиоактивности в жидком сцинтилляционном счетчике.

Изобретение, кроме того, относится к методу ингибирования аминоксидазной активности VAP-1 при введении эффективного количества ингибитора аминоксидазы. Ингибитор может представлять собой, например, семикарбазид, гидроксиламин, пропаргиламин, изониазад, ниаламид, гидраллазин, прокарбазин, монометилгидразин, 3,5-этокси-4-аминометилпиридин или MDL72145 ((Е)-2-(3,4)диметоксифенил)-3-фтораллиламин), предпочтительно семикарбазид или гидроксиламин. Семикарбазид может вводиться в концентрации 10-1000 мкМ или в другом диапазоне концентраций, таком как 50-1000 или 80-500 мкМ, предпочтительно в концентрации 100 мкМ. Гидроксиламин может вводиться в концентрации 0,1-100 мкМ или в другом диапазоне концентраций, таком как 1-10 мкМ или 2-8 мкМ, предпочтительно в концентрации 5 мкМ.

В рамках настоящего изобретения связывание эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованное сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), может быть модифицировано при введении в хозяйскую клетку ингибитора или усилителя аминоксидазы. Хозяйская клетка может представлять собой клеточную линию млекопитающих – человека или животного. Изобретение может использоваться для лечения in vitro или in vivo.

Приведенное общее описание изобретения поясняется нижеследующими примерами, которые даны только с целью его иллюстрации и никоим образом не ограничивают настоящее описание.

Пример 1
Выделение кДНК VAP-1
Гладкие мышцы кишки человека, в которых VAP-1 высоко экспрессируется, получают из материала, отбираемого при хирургических процедурах, используя его как источник для дальнейшей очистки VAP-1 белка. На иммуноаффинной колонке с моноклональным антителом МАb из обработанных детергентом лизатов гладких мышц очищают формы VAP-1 размером 90 и 170-180 кДа в достаточных количествах для определения внутренней пептидной последовательности после расщепления их трипсином и протеазой V8. Кроме того, проводят прямое секвенирование N-конца участка VAP-1 размером 90 кДа. Профиль элюции пептида с ВЭЖХ колонки, используемой для очистки пептидов из обеих форм VAP-1, идентичен, как и пептидные последовательности в соответствующих пиках, показывающие, что белок представляет собой димер, состоящий из 2 субъединиц размером 90 кДа.

Некоторые из пептидных последовательностей VAP-1 используют для создания частично вырожденных олигонуклеотидных праймеров для экспериментов в рамках ОТ-ПЦР с использованием мРНК, получаемой из гладкой мышцы кишки человека. Единичный фрагмент кДНК размером примерно 700 п.н. амплифицируют с использованием праймеров и клонируют в pUC18 для определения его последовательности. Последовательность кДНК содержит непрерывную открытую рамку считывания, которая кодирует белок, содержащий некоторые из последовательностей пептидов из очищенного иммуным способом материала, обработанных трипсином и V8, и это подтверждает тот факт, что амплификация затронула нужные фрагменты кДНК. Для выделения более длинных клонов кДНК анализируют набор из 10 библиотек человеческой кДНК методом ПЦР для идентификации тех из них, которые содержат кДНК VAP-1, и библиотеки, демонстрирующие наивысший сигнал, подвергают скринингу с фрагментом кДНК VAP-1, полученным в результате ПЦР. Указанным способом выделяют множество перекрывающих клонов кДНК из библиотек кДНК легкого и сердца человека. Из указанных клонов отбирают кДНК размером 2501 п. н. , которая содержит непрерывную открытую рамку считывания размером 2292 п. н., начинающуюся на метиониновом кодоне АТГ, и субклонируют в pUC19. За стартовым кодоном следует пептидная последовательность, найденная на N-конце очищенного белка VAP-1 размером 90 кДа, и смежная открытая рамка считывания, кодирующая все VAP-1 пептиды после обработки их трипсином и V8, которые были идентифицированы при секвенировании белка (фиг.1). В этом клоне присутствуют нетранслируемый 5′-участок размером 80 п.н. и нетранслируемый 3′-участок размером 129 п. н., следующие за ТАГ стоп-кодоном. На 3′-конце ДНК не были обнаружены ни сигнал полиаденилирования, ни поли-А последовательность, что дает основание полагать, что нативная мРНК VAP-1 может быть длиннее, чем в ситуации с выделенной кДНК.

Временная экспрессия VAP-1 в COS-7 клетках, возникающая после трансфекции вектором экспрессии, содержащим кДНК, приводит к сильному окрашиванию клеточной поверхности в популяции клеток при использовании VAP-1 МАb, IB2 (фиг.2, картина сортировки клеток по интенсивности флюоресценции, ряд В, колонка 4). Контроль трансфицированных клеток был отрицательным (фиг.2, картина сортировки клеток по интенсивности флюоресценции, ряд А, колонка 4). Таким образом, был сделан вывод о том, что выделена кДНК, кодирующая иммунореактивный VAP-1, который экспрессируется на поверхности клеток, трансфицированных кДНК VAP-1.

VAP-1 белок
Открытая рамка считывания, содержащаяся в кДНК VAP-1, кодирует белок из 763 аминокислот размером 84,6 кДа. Поиск в базе данных приемлемых белковых последовательностей выявил, что VAP-1 обладает значительной идентичностью к семейству ферментов, относящихся к медьсодержащим аминоксидазам (номер по классификации ферментов ЕС 1.4.3.6). Степень идентичности варьирует от примерно 24% уровня, характерного для Сu-аминоксидазы в Escherichia coli, до 41-81% в случае представителей этого семейства у млекопитающих. Наивысшая идентичность обнаружена при сравнении с аминоксидазой из бычьей сыворотки (81%), которая демонстрирует значительную консервативность на протяжении всей длины белка, за исключением короткого участка на N-конце молекулы. На фиг. 3 приведены для сравнения VAP-1 и 4 других представителя медьсодержащих аминоксидаз млекопитающих, в отношении последовательностей которых имеется соответствующая информация.

VAP-1 не демонстрирует значительной идентичности с какими-либо из известных в настоящее время молекул адгезии и не содержит никаких белковых доменов из числа тех, что изредка встречаются внутри таких белков, хотя нами было отмечено наличие RGD мотивов на участке между остатками 726-728. Неизвестна, однако, функциональная значимость этого обычно встречающегося мотива с точки зрения связывания с интегрином, если этот процесс имеет место. Белок имеет 6 потенциальных сайтов N-гликозилирования и 3 предположительных сайта О-гликозилирования в расчете на один мономер (фиг.1) (определение проведено с использованием для прогнозирования сайта О-гликозилирования сервера E-mail NetОglic@cbs.dtu.dk (Hansen et al., Biochem. J., 308:801-813 (1995)).

Рассмотрение белковой последовательности не выявило наличия участков с характеристиками, свойственными мембранным доменам, за исключением участка 23 молекулы, состоящего преимущественно из гидрофобных аминокислот на самом дальнем N-конце (остатки 5-27), который показан на фиг.1 (SEQ ID NO:2). Указанный участок может быть интерпретирован либо как расщепляемый сигнал секреции, поскольку он содержит потенциальный сайт расщепления в положении 19, что было установлено по методу фон Хейне (von Hejine G., Nucl. Acids. Res., 14: 4683-4690 (1986)), либо как трансмембранный домен. N-концевая белковая последовательность белка VAP-1 размером 90 кДа указывает на то, что данный гидрофобный участок не был вырезан из материала, который мы очистили, и вряд ли он может функционировать как нормальная расщепляемая сигнальная последовательность для секреции. Кроме того, заряженность остатков, фланкирующих гидрофобный участок, дает основание полагать, что это может быть мембранный домен мембранного белка типа II (Hartmann E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5786-5790 (1989)), имеющего N-конец в цитоплазме и С-конец во внеклеточном домене.

Для определения того, может ли указанный гидрофобный участок функционировать в качестве трансмембранного домена и определять ориентацию VAP-1 в мембране, авторы создали конструкции для экспрессии кДНК VAP-1, в которых эпитоп FLAG, распознаваемый коммерчески доступным MAT M2, был помещен в рамку считывания после инициирующего метионинового кодона на предсказанную цитоплазматическую сторону предполагаемого трансмембранного домена. Указанную конструкцию и контрольную конструкцию, в которых кДНК VAP-1 помещена в вектор в обратной ориентации, используют для трансфекции COS-7 клеток и анализируют методом сортировки клеток по интенсивности флюоресценции неустойчивую экспрессию FLAG и VAP-1 эпитопов, распознаваемых соответственно MAT M2 и 1В2 (фиг. 2) с использованием для этого как пермеабилизованных, так и не пермеабилизованных клеток. Окрашивание под действием MAT против FLAG отмечалось только на пермеабилизованных клетках (фиг.2, ряд F, колонка 5), тогда как окрашивание VAP-1 отмечалось как на популяции пермеабилизованных, так и не пермеабилизованных клеток (фиг. 2, ряды С и F, колонка 4). Контрольные трансфицированные клетки были отрицательными на MAT и против FLAG, и против VAP-1 (фиг.2, ряды А и D, колонки 4 и 5). Эти данные позволяют предположить, что N-конец FLAG эпитопа расположен на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, гидрофобный регион захватывает липидный бислой и имеется крупный С-концевой внеклеточный домен, распознаваемый MAT 1В2, блокирующим адгезию. Все предположительные сайты гликозилирования расположены во внеклеточной части молекулы.

Для определения размера и уровня гликозилирования рекомбинантного VAP-1, временно экспрессируемого в COS-7 клетках, авторы провели в ДСН-ПААГ с использованием MAT 1B2 иммунноблоттинг разделенных клеточных экстрактов VAP-1 и псевдотрансфицированных клеток при обработке их перед этим сиалидазой и в ее отсутствие (фиг.4). Факт очевидного увеличения молекулярной массы VAP-1 от 170-180 кДа до примерно 180-190 кДа при сиалидазной обработке указывает на то, что рекомбинантный VAP-1, как и нативный VAP-1, представляют собой сиалогликопротеин, при этом снижение отрицательного заряда посредством удаления отрицательно заряженных сиаловых кислот уменьшает подвижность VAP-1 в ДСН-ПААГ. Сходный эффект при сиалидазной обработке наблюдался также в случае использования VAP-1 из миндалин (Salmi M. and Jalkanen S., J. Exp. Med., 183:569-570(1996)).

Экспрессия VAP-1
Нозерн-блот анализ мРНК, выделенной из гладких мышц кишки человека и истощенной по лимфоцитам строме миндалин, показывает, что клонированная кДНК VAP-1 гибридизуется в обеих тканях с мРНК размером 4,2 тыс. п.н. (фиг.5а). Дальнейший нозерн-блоттинг показал, что мРНК VAP-1 размером 4,2 тыс. п.н. экспрессируется в широком диапазоне тканей человека. При этом мессенджер не определяется в лейкоцитах периферической крови или мозге, но высоко экспрессируется в легких, тонком кишечнике и аппендиксе в сравнении с другими тканями. И лишь небольшие количества мРНК VAP-1 обнаруживаются в селезенке, вилочковой железе, яичке, печени, поджелудочной железе, почке, костном мозге и эмбриональной печени. Промежуточный уровень экспрессии отмечается в предстательной железе, яичнике, слизистой оболочке толстого кишечника, сердце, плаценте, скелетных мышцах и лимфатическом узле (фиг.5В). Никаких других видов мРНК не было обнаружено даже после продолжительной авторадиографии.

Материалы и методы
Антитела и реагенты. В литературе описаны мышиные моноклональные антитела MAT 1B2 против VAP-1 и 3G6 против Т-клеток цыплят (Salmi M. and Jalkanen S. , Science, 257:1407-1409 (1992)). MAT M2, распознающий FLAG пептид (DYKDDDDK), получен от КЕВО Lab, Espoo, Финляндия.

Очистка и секвенирование VAP-1. При брюшной хирургии вырезают нормальные образцы кишки, отделяя их от собственной пластинки lamina propria. Гладкомышечную стенку измельчают на мелкие кусочки и лизируют в течение ночи в лизирующем буфере (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-основания, рН 2,7, 1,5 мМ MgCl₂, 1% NP-40, 1% апротинина и 1 мМ ФМСФ). После осветления супернатант лизата последовательно наносят на колонки для иммуноаффинной хроматографии, содержащие 5 мл СnВr-активированных шариков Сефарозы, включающих нормальную крысиную сыворотку, не связывающуюся с моноклональными антителами и MAT против VAP-1 (3 мг/мл шариков). Специфические колонки промывают лизирующим буфером и VAP-1 антигены элюируют 50 мМ триэтиламином. Элюат сразу замораживают и затем лиофилизируют. После этого образец растворяют в невосстанавливающем буфере для образца Лэмли (Laemmli) и разделяют в 5-12,5% ДСН-ПААГ геле.

После переноса на поливинилидендифторидную мембрану (Applied Boisystems Inc. , Foster City, CA, США) методом электроблоттинга мембрану окрашивают кумасси блю и вырезают полосы размером 90 и 170-180 кДа. Полную полосу размером 170-180 кДа и часть материала размером 90 кДа расщепляют трипсином (чистота для секвенирования, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Германия), как описано в работе Фернандеса с соавт. (Fernandez J. et al., Anal. Biochem. , 201: 255-262 (1992)). Элюированные пептиды разделяют методом ВЭЖХ (150А; Applied Biosystems) на колонке Vydac C₁₈ (2,1 х 150 мм). Анализ N-концевой последовательности проводят на секвенаторе белков (477 A; Applied Biosystems), снабженном онлайновым анализатором аминокислот на основе фенилтиогидантоина (120 А; Applied Biosystems). Оставшуюся часть материала размером 90 кДа подвергают анализу для определения N-концевой последовательности перед расщеплением. После расщепления трипсином мембраны вновь расщепляют протеазой V8 (чистота для секвенирования, Boehringer Mannheim) и элюированные пептиды чистят и секвенируют, как описано выше. Данные по последовательности ряда пептидов подтверждают с использованием лазерного десорбционного метода масс-спектрометрии матрицы с целью подтверждения предсказанной массы (Lasermat, Finnigan).

Техника молекулярно-биологических исследований. Выделение из Е. coli малых и крупных плазмид, расщепление рестриктазами, гибридизацию бляшек, очистку фага лямбда и экстракцию фаговой ДНК, трансформацию Е. coli, синтез кДНК и конструирование плазмид осуществляют в соответствии со стандартной техникой исследования (Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей проводят с использованием набора QIAEX (QIAEGEN, Hilden, Германия) в соответствии с прилагаемыми рекомендациями производителя. Зонды ДНК готовят с использованием меченого набора ДНК Amersham Multiprime и [^32oС, 1 минута; 55^oС, 1 минута; 72^oС, 2 минуты в течение 30 циклов. Тотальную РНК получают из клеточных линий и тканей с использованием устройства Ultraspec (Biotecx, Houston, ТХ, США), в соответствиями с рекомендациями производителя. Множественные нозерн-блотты из тканей человека получают от Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, США) и гибридизуют с ³²Р-меченными пробами в соответствии с рекомендациями производителя. Набор библиотеки человеческой кДНК, а также библиотеки кДНК из легкого (каталожный No. HL3004a) и сердца (каталожный No. HL3026a) получают от Clontech Laboratories.

Клеточные культуры и экспрессия кДНК VAP-1 в клетках млекопитающих. COS-7 (фибробласты обезьяны), СНО (клетки яичников китайского хомячка) и CRL1998 (иммортализованные эндотелиальные клетки из пупочной вены человека), полученные от АТСС (Rockville, MD) используют в качестве хозяйских организмов для трансфекции и экспрессии VAP-1. COS-7 и CRL 1998 клетки выращивают в среде RPMI 1640 (Gibco BRL), содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (PAA-Linz, Австрия), 2 мМ глютамина (Biological Industries, Израиль) и 128 Ед/мл пенициллина и 128 мкг/мл стрептомицина. СНО клетки выращивают в среде альфа-МЕМ плюс СНО с нуклеозидами и теми же добавками. Плазмиды экспрессии, состоящие из кДНК VAP-1, субклонируют в векторе экспрессии pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) и используют для временной трансфекции COS-7 клеток с целью генерации стабильно трансфицированных СНО клеточных линий. Плазмиды экспрессии (20 мкг) используют для трансфекции клеток методом электропорации на приборе BIO-Rad Gene Pulser (0,3 kV, 960 мкФ, кювета 0,4 см в среде RPMI, включающей дополнительно 1 мМ Na-пируват, 2 мМ L-глютамин, без сыворотки). Временно трансфицированные клетки исследуют через 3 дня после проведения трансфекции. Стабильно трансфицированные клетки отбирают при культивировании в присутствии 0,5 мг/мл генетицина (Geneticin, Gibco BRL) в течение 4 недель.

Пример 2
Энзиматичеекая активность VAP-1
Установление того факта, что VAP-1 обладает выраженной идентичностью с семейством медьсодержащих аминоксидаз, в частности с секретируемой аминоксидазой бычьей сыворотки (БСАО), сделало логичным исследование наличия аминоксидазной активности у VAP-1. Медьсодержащие аминоксидазы характеризуются наличием необычного хинонового кофактора, связанностью фермента с медью и активностью против первичных полиаминов или моноаминов. Таким образом, они отличаются от ФАД-содержащих внутриклеточных (митохондриальных) моноаминоксидаз (McInture W. S. and Hartmann С., in Principles and Applications of Quinoproteins, p. 97 (V.L. Davidson. ed., Dekker, New York (1993)).

Для определения того, каким типом активности обладает VAP-1, авторы получают стабильные трансфектанты СНО клеток, экспрессирующие VAP-1 белок. Озвученные лизаты указанных клеток исследуют на наличие диаминоксидазной (ДАО) активности с использованием в качестве субстрата путресцина или на наличие моноаминоксидазной активности (МАО) с использованием в качестве субстрата бензиламина. В качестве позитивных контролей используют коммерчески доступные препараты ДАО и МАО, а в качестве негативных контролей используют лизаты СНО клеток, трансфицированные псевдоплазмидой. Полученные результаты показывают, что клетки, экспрессирующие VAP-1, обладают ничтожно малой активностью в отношении путресцина, однако при использовании бензиламина в качестве субстрата МАО обнаружена значительная активность (Таблица 1). При этом в случае использования бензиламина в качестве субстрата моноаминоксидазы (МАО) отмечается значительная активность в СНО клетках, экспрессирующих VAP-1, и в позитивном контроле, представляющем собой коммерчески доступный препарат МАО из бычьей плазмы (Таблица 1). Псевдолизаты СНО клеток демонстрируют незначительную энзиматическую активность. В присутствии 100 мкМ семикарбазида и 10 мкМ гидроксиламина в качестве специфических ингибиторов медьсодержащих моноаминоксидаз (Lyies, Intl. J. Biochem. Cell Biol., 28:254-274 (1996)) VAP-1 не проявляет активности с бензиламином (Таблица 1).

Кроме того, авторами было показано, что компетентный по адгезии VAP-1, экспрессируемый в Ах клетках, также обладает МАО активностью в отношении бензиламина, которая ингибируется семикарбазидом и гидроксиламином (Таблица 1). По всей видимости, Ах клетки сами обладают нативной активностью МАО с бензиламином, которая не ингибируется семикарбазидом или гидроксиламином, поскольку в “псевдоконтрольных” клетках отмечается низкий уровень активности (Таблица 1).

Для подтверждения того, что МАО активность присутствует в VAP-1 in vivo, авторами проведена очистка VAP-1 из миндалин иммуноаффинным методом и с тройным повтором проведен анализ полученного материала. VAP-1 из миндалин, как и VAP-1 из трансфицированных СНО клеток, демонстрирует активность с бензиламином с ежечасным повышением А₄₉₀ на 0,09 при 37^oС в имеющихся условиях тестирования, что в 4,5 раза превышает указанный параметр в случае кипяченого образца. Однако в связи с очень низким выходом полученного из миндалин белка VAP-1 не удалось определить удельную активность препарата.

Бензиламин, который обычно используют в качестве субстрата для определения аминоксидазной активности, не обнаружен in vivo. Так, было испытано множество биологически доступных эндогенных аминов с точки зрения установления их способности утилизироваться VAP-1 (Таблица 1). По всей видимости, метиламин в концентрации 1 мМ может легко утилизироваться VAP-1, однако, ни один другой из исследованных аминов не проявляет такой реакционной способности. В указанных клеточных лизатах наблюдается меньшая удельная активность с бензиламином, если ее сравнивать с данными по лизатам, приведенным в Таблице 1, что отражает вариации в экспрессии VAP-1, имеющиеся в различных сериях клеток.

Наличие хинонового фактора в VAP-1 показано при разделении в ДСН-ПААГ в восстановительных условиях части иммуно-очищенного материала VAP-1 из миндалин с последующим переносом материала на нитроцеллюлозу. Затем нитроцеллюлозный фильтр окрашивают нитроблю-тетразолием/глицинатом Na в окислительно-восстановительных условиях циклизации с целью специфического окрашивания хиноновых группировок белка (Paz М. A. et al., J. Biol. Chem., 266: 689-692 (1991)). Краска реагирует как с мономерным участком VAP-1 размером 90 кДа, так и с димерным участком размером 180 кДа, что указывает на то, что VAP-1 из миндалин имеет, по всей видимости, хиноновый кофактор в каждой субъединице.

Материалы и методы
Определение аминоксидазной активности. Сливающиеся клетки СНО или Ах (10-1510⁶ на колбу), стабильно трансфицированные плазмидной кДНК экспрессии VAP-1, соскребают с колбы в 10 мл 100 мМ фосфатного буфера, рН 7,2, центрифугируют и клеточный осадок промывают 10 мл буфера. Осадок клеток окончательно ресуспендируют в 1,5 мл фосфатного буфера и клетки лизируют путем озвучивания импульсами средней мощности 2 раза по 10 секунд на льду (ультразвуковой прибор Braun sonicator). Озвученные лизаты используют непосредственно в энзиматических тестах (50-100 мкл на тест) или после хранения при -20^oС. Общую концентрацию белка измеряют по методу Бредфорда с использованием в качестве стандарта бычьего гамма-глобулина и набора Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, США).

Аминоксидазную активность измеряют в соответствии с ранее описанными методиками при использовании в качестве субстратов ¹⁴С-меченного путресцина (Amersham), по методу Д’Агостино с соавт. (D’Agostino L. et al., Biochem. Pharmacol. , 38: 47-49 (1989), включен в описание в качестве ссылки), ³H гистамина (New England Nuclear) по методу Бэйлина и Марголиса (Baylin S.B. and Margolis S. , Biochem. Biophys. Acta, 397:294-396 (1975), включен в описание в качестве ссылки), и ¹⁴С- бензиламина (Amersham) и проводят определение аналогично способу с путресцином, за исключением того, что в качестве субстрата в реакции используют метку с радиоактивностью 0,4 мкCi, которая содержит 80 нмоль немеченого бензиламина. 0,5 мл реакционной смеси содержат 100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,2, 0,4 мкСi ¹⁴С-бензиламина (Amersham), 80 нмоль намеченого бензиламина и образец неочищенного клеточного лизата объемом максимум в 100 мкл в расчете на реакцию. После инкубации при 37^oС в течение 1 часа альдегидный продукт реакции экстрагируют добавлением 900 мкл толуола, содержащего 0,35 г/л дифенилоксазола, и энергично встряхивают смесь. После разделения фаз отбирают 700 мкл толуолового слоя и проводят дополнительную экстракцию с использованием для этого 700 мкл толуол/дифенилоксазола, отбирают 500 мкл указанного слоя, добавляют к первой экстрагированной порции и подсчитывают уровень ¹⁴С в счетчике для жидкостно-сцинтилляционного счета. Все энзиматические тесты проводят в присутствии слепых контролей, содержащих кипяченый образец (10 минут, 100^oС) или неэкспрессирующий образец, в двойном или тройном повторах и полученные результаты выражают в виде пмоль использованного субстрата мин^-1 мг белка^-1. Контроли неочищенной ДАО из почки свиньи и МАО из плазмы быка получают от компании Sigma Chemical Company (St. Louis, МО, США).

Обсуждение
Выраженное окрашивание с использованием MAT 1B2, распознающих VAP-1, показано в эндотелиальных клетках сосудов в нескольких позициях, в особенности в лимфоидных тканях PLN типа. Однако, поскольку общий уровень VAP-1, найденного в этих участках, относительно низкий, оказалось трудно выделить и очистить достаточные количества эндотелиального VAP-1, с тем чтобы получить нужную информацию о белковой последовательности. Если рассматривать другие ткани, в которых был обнаружен VAP-1, то наиболее богато он представлен в гладких мышцах сосудистой системы и в гладких мышцах, относящихся к кишке (Salmi M. et al. , J. Exp. Med., 178:2255-2260 (1993)). VAP-1 из этих источников характеризуется несколько различающимися молекулярными массами, что, вероятно, связано с различиями в гликозилировании, и тем не менее близок к форме, полученной ранее из миндалин и тканей PLN типа.

С использованием данных о белковой последовательности, полученных для VAP-1, выделенного и очищенного из гладкой мышцы кишки, выделена кДНК, кодирующая указанную молекулу адгезии. Доказательством этого служит следующее: во-первых, полученная для иммуноочищенного VAP-1 белковая последовательность обнаружена в предсказанной белковой последовательности впоследствии выделенного клона кДНК VAP-1. И во-вторых, трансфицированные клетки, экспрессирующие кДНК YAP-1, окрашиваются поверхностно с использованием MAT 1B2, который первоначально был использован для определения VAP-1 (Salmi M. and Jalkanen S. , Science, 257:1407-1409 (1992)) и VAP-1, выделенный иммуноосаждением из этих клеток, обладает близкой к найденному in vivo белку молекулярной массой (170-180 кДа).

VAP-1 представляет собой крупный димерный трансмембранный белок типа II, имеющий мембранный домен, расположенный на N-конце молекулы. Внутриклеточный домен является особенно малым и содержит только 4 аминокислоты в длину, тогда как крупный гликозилированный внеклеточный домен имеет в указанном димере размер около 163 кДа. Все потенциальные сайты гликозилирования, в расчете на димер, а именно 12 N-связанных и предположительно 6 O-связанных, расположены во внеклеточном домене. Хотя в настоящее время неизвестно, все ли они используются, полученные ранее данные позволяют предположить, что VAP-1 содержит и N-, и O-связанные сахара, а также много остатков сиаловой кислоты, которые могут присутствовать либо на терминальных остатках N-связанного углевода, либо в составе O-связанного сахара. Поскольку углеводы, в частности сиаловые кислоты, как полагают, играют важную роль в реализации адгезивной функции VAP-1 белка (Salmi М. and Jalkanen S., J. Exp. Med., 183: 569-579 (1996)), представляется необходимым определить, какие сайты гликозилирования используются и какого рода углеводы они содержат.

Поскольку анализ методом нозерн-блотгинга не выявил наличия в какой-либо из тканей видов мРНК VAP-1 со значительно различающимися размерами, и все клоны кДНК VAP-1, a также исследованные фрагменты ПЦР содержат сходные последовательности, нет серьезных оснований полагать, что имеются формы VAP-1, кодируемые разными вариантами мРНК. Таким образом, вполне возможно, что изобретатели клонируют кДНК, кодирующую преобладающую форму VAP-1, которая была исследована ранее методом иммунноблоттинга и методом иммуноосаждения. Однако, поскольку все исследованные ткани содержат гладкие мышцы, происходящие либо из сосудистых тканей, либо из других источников, а также сосудистый эндотелий, невозможно провести различие между мРНК VAP-1 из гладких мышц и из эндотелия, когда, как это имеет место в указанных тканях, в них присутствуют очень близкие типы мРНК. Таким образом, не исключено, что может(гут) быть другая(ие) форма(ы) VAP-1, кодируемая(ые) мРНК, несколько отличающейся от уже выделенного вида.

Представляется интересным, что N-концевой участок VAP-1 с трансмембранным регионом представляет собой часть молекулы, наиболее отличающуюся от таковой в гомологичной БСАО. Известно, что БСАО представляет собой секретируемый белок, обнаруживаемый в высоких количествах в сыворотке, который несет сигнальную последовательность секреции на своем N-конце, удаляемую при протеолитическом процессинге в ходе секреторного метаболизма (Mu D. et al., J. Biol. Chem., 269:9926-9932 (1994)). Таким образом, БСАО и VAP-1 могут не иметь сходных физиологических свойств. Предварительные данные позволяют предположить, что мышиный VAP-1 имеет трансмембранный домен, сходный с тем, который был найден в человеческом VAP-1 и, таким образом, может обладать теми же самыми функциями, что и человеческая молекула. Внеклеточный домен VAP-1 обладает активностью аминоксидазы, так что VAP-1 может функционировать как эктоэнзим. Медьсодержащие аминоксидазы представляют собой разнородный класс ферментов с весьма различающейся субстратной специфичностью, которые могут быть достаточно грубо разделены на два больших типа: на те, которые обладают активностью в отношении полиаминов, таких как путресцин и гистамин, и те, такие как VAP-1, которые имеют моноаминоксидазную активность. Физиологические субстраты аминоксидаз неизвестны, хотя есть предположение относительно нескольких таких возможных соединений.

Другой характерной чертой указанных ферментов является наличие необычного карбонилсодержащего кофактора, относительно химической природы которого были получены противоречивые данные, который был идентифицирован в БСАО и в аминоксидазе гороха как топахинон (6-гидрокси дофа), а в лизилоксидазе как поперечно сшитый лизинтирозилхинон. В некоторых видах млекопитающих, включая человека, медьсодержащая моноаминоксидаза обнаружена и в клеточной мембране, и в сыворотке в растворимой форме. Указанная активность чувствительна к ингибированию карбонилреактивными агентами, такими как семикарбазид и гидроксиламин (Lyies G. A., Intl. J. Biochem. Cell Biol., 28:259-274 (1996)), а такого рода ферменты относят к семикарбазидчувствительным аминоксидазам (СЧАО). Авторами показано, что VAP-1 содержит ковалентно-связанный хинон, который, с учетом имеющихся данных по другим медьсодержащим моноаминоксидазам, образуется, вероятно, при самопроцессинге в реакции, включающей связанный с медью фермент. Эти результаты, а также чувствительность ферментативной активности VAP-1 к карбонилреактивным агентам – семикарбазиду и гидроксиламину, – указывает на то, что VAP-1 представляет собой связанную с мембраной СЧАО.

Физиологическую роль СЧАО трудно определить, поскольку известно очень мало об их субстратах in vivo, а их субстратная специфичность в значительной степени варьирует у разных видов. Одной из таких функций может быть метаболизм эндогенных и ксенобиотических первичных моноаминов, и возможно, что именно к этому роду относится функция VAP-1, обнаруженная в позициях, отличных от эндотелиальных тканей, таких как гладкие мышцы.

В настоящее время неизвестно, имеет ли СЧАО активность VAP-1 какую-либо роль в реализации адгезивных свойств клеток. Предварительные эксперименты по адгезии in vitro, проведенные с CRL1998 клетками и PBL клетками (лимфоцитами периферической крови), трансфицированными VAP-1 в присутствии семикарбазида и гидроксиламина, позволяют предположить, что энзиматическая активность может оказывать негативное воздействие на адгезивные взаимодействия между указанными клетками, поскольку в присутствии указанных ингибиторов количество PBL, связанных с трансфицированными VAP-1 клетками, увеличивается. Неизвестно, однако, является ли этот эффект первичным, вызванным прямым и специфическим действием энзиматической активности на адгезивный механизм, применяемый клетками, или он является вторичным, в рамках которого на физиологическое состояние клеток неблагоприятно влияет продукт моноаминоксидазной активности, снижая, таким образом, их адгезивный потенциал.

Пример 3
Тест на адгезию
кДНК VAP-1 в pcDNA3 используют для трансфекции Ах клеток и эндотелиальной клеточной линии, производной от HEV
крыс, которые, как полагают, могут создавать более естественное функциональное окружение для VAP-1, чем другие потенциальные клетки-хозяина, такие как СНО. Получают стабильные трансфектанты, экспрессирующие на клеточной поверхности VAP-1, что было определено методом сортировки клеток по интенсивности флюоресценции (фиг.6 А), которые затем используют в тестах на адгезию с лимфоцитами. При исследовании в условиях вращения PBL связывается с VAP-1 трансфицированными Ах клетками в 25,6 раз лучше, чем с псевдотрансфицированными клетками (фиг. 6В и 6С). Повышенное связывание с VAP-1 трансфектантами статистически значимо ингибируется, хотя и не устраняется полностью, при обработке моноклональным антителом против VAP-1 (ингибирование на 29,6% 10,7%, Р=0,05). Указанные результаты по адгезии объединяют из пяти независимых экспериментов, в которых проанализированы 2-3 параллельных монослоя трансфектантов, каждый раз с использованием трех независимо трансфицированных клеточных линий и PBL из шести различных доноров. Полученные данные показывают, что кДНК VAP-1 кодирует функциональную молекулу адгезии, которая расположена на клеточной поверхности трансфицированных клеток и которая, при экспрессии в Ах клетках, может быть непосредственным медиатором связывания с PBL.

Материалы и методы
Ах-клетки, в которых VAP-1 стабильно экспрессируется, или “псевдоконтрольные” трансфектанты помещают на очерченные воском круги на покрытые желатином микроскопические пластинки (20000 клеток на круг диаметром 2 см). Клетки выращивают до слияния и после двух промываний в каждый очерченный воском круг при соблюдении равномерности покрытия липкого монослоя клеток добавляют 100 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка и 10 мМ HEPES (среды для тестирования). Тем временем из свежеполученной крови с помощью центрифугирования в фиколле выделяют PBL и доводят их концентрацию до величины 4010⁶ клеток/мл средой для тестирования. После этого пластинки переносят на угловой шейкер, работающий со скоростью 60 оборотов в минуту при 7^oС, и на каждый восковой круг наносят 5 мкл суспензии PBL. Тест продолжают в течение 30 минут при постоянном вращении. Пластинки тщательно декантируют и погружают на один раз в холодную среду RPMI для удаления неприлипших клеток. Прилипшие клетки фиксируют на срезах при инкубации пластинок в течение ночи в вертикальном положении в охлажденном на льду ФБР, содержащем 1% глутаральдегида. Подсчитывают количество прилипших клеток с использованием окулярной сетки (увеличение х 200). Сетка покрывает площадь размером 0,25 мм². На каждом стекле подсчитывают девять заданных областей размером 0,25 мм² в центре круга, где трансфектанты образовали слитый монослой. В каждом из пяти независимых экспериментов подсчитывают по две пластинки на образец (общая площадь равняется 4,5 мм²). В некоторых экспериментах тест на адгезию проводят в присутствии MAT, блокирующих функцию VAP-1 (комбинация 1В2 и ТК-14, оба применяют в концентрации 50 мкг/мл с разбавлением средой для теста) или негативных контрольных класс-специфичных MAT (сочетание 3G6 и 7С7, оба применяют в концентрации 50 мкт/мл). MAT инкубируют с монослоем трансфектантов на пластинках в течение 30 минут при 7^oС до добавления меченых лимфоцитов. Количество прилипших клеток подсчитывают в пяти независимых экспериментах, как было описано выше.

Обсуждение
Тесты на адгезию, проведенные с Ах клетками, экспрессирующими VAP-1, показывают, что кДНК кодирует функциональный VAP-1, который может поддерживать взаимодействие со своим лигандом на PBL и ведет к стабильному связыванию PBL с Ах клетками. Однако не наблюдается полного ингибирования такой повышенной адгезии с MAT против VAP-1 (1B2 и ТК8-14), что позволяет предположить, что молекула VAP-1 в Ах клетках крыс функционирует не совсем так, как в нативном окружении. Возможно, модификация углеводов в белках Ах клеток, локальное мембранное окружение или конформация VAP-1 отличаются в достаточной мере от таковых в человеческом HEV, так что MAT не могут больше блокировать все взаимодействия VAP-1 с его лигандом. Возможно также, что субпопуляция молекул VAP-1 может существовать в трансфектантах в виде, лишенном одного или другого из эпитопов, распознаваемых MAT 1B2 и ТК8-14. И наконец, авторы остановились на той возможности, что длительная суперэкспрессия VAP-1 в стабильных трансфектантах изменяет экспрессию других(ой) молекул(ы) адгезии на поверхности Ах клеток. Функция других предположительных молекул адгезии, разумеется, не будет ингибироваться MAT против VAP-1. В тестах по связыванию HEV показано, что VAP-1 функционирует независимо от лимфоцитарного L-селектина и опосредует связывание CD8⁺PBL намного лучше, чем CD4⁺PBL. Ах клетки, полученные трансфекцией кДНК VAP-1, воспроизводят указанные свойства, поскольку анализ иммунномагнетически очищенных негативных по L-селектину клеток, а также CD8⁺ и CD4⁺ клеток, показал, что L-селектин не обязателен для эффективного связывания с Ах трансфектантами и что подмножество CD8⁺ клеток в PBL характеризуется в несколько раз лучшей прилипаемостью к VAP-1 трансфектантам, чем CD4⁺ клетки (данные не показаны).

Несмотря на то, что изобретение описано относительно конкретных вариантов его реализации, очевидно, что оно может быть подвергнуто и другим модификациям, и настоящая заявка охватывает в целом все возможные варианты использования или адаптации приведенного описания, принципы изобретения и включает такие отклонения от настоящего раскрытия, которые уже известны или обычно практикуются в технике, к которым настоящее изобретение относится и которые могут быть применимы к существенным особенностям в указанном описании и которые охватываются рамками приведенной формулы изобретения.

Раскрытие всех ссылок, заявок на патент и цитирование патентов, если они есть, приведены полностью в настоящем описании в качестве ссылок.

Формула изобретения

1. Способ манипулирования процессом связывания эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованного сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), обладающим аминооксидазной активностью, имеющий аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1 (SEQ ID NO: 2), характеризующийся тем, что ингибирование ферментной активности аминооксидазы осуществляют введением в клетку-хозяина ингибитора аминооксидазы.

2. Способ манипулирования процессом связывания эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованного сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), обладающим аминооксидазной активностью, имеющим аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1 (SEQ ID NO: 2), характеризующийся тем, что потенциирование ферментной активности аминооксидазы осуществляют введением в клетку-хозяина потенциатора аминооксидазы.

РИСУНКИ