Патент на изобретение №2204832

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, гнойной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития инфекционных осложнений в послеоперационном периоде. Сущностью способа является исследование генома пациента методом полимеразной цепной реакции и при выявлении экспрессии эндогенной ретровирусной последовательности 4-1 env прогнозируют высокий риск развития гнойных осложнений в послеоперационном периоде. Техническим результатом является прогнозирование с высокой достоверностью возникновения гнойных осложнений, предупреждение их развития и улучшение результатов лечения.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, гнойной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития инфекционных осложнений в послеоперационном периоде.

Известные способы прогнозирования гнойных осложнений основаны:
1. На оценке тестов иммунологического статуса, поскольку иммунодепрессия используется в качестве критерия прогноза. В основном для оценки иммунного статуса используется унифицированный стандартный комплекс лабораторных тестов, рекомендованный Институтом иммунологии (1, 2, 8), который включает измерение следующих параметров: определение количества лейкоцитов в периферической крови; определение уровня Е-розеткообразующих клеток; определение Ем-розеток; содержание сывороточных иммуноглобулинов классов A, M, G методом простой радиальной иммунодиффузии в агаре, определение фагоцитарной активности нейтрофилов в реакции поглощения латекса (9,4). Точность прогноза, по данным разных авторов, составляет от 64,3% до 77,8% случаев.

2. На оценке показателей выраженности деструктивно-воспалительного процесса (С-реактивный белок, сиаловые кислоты, аминотрансферазы, фибриноген и белковые фракции сыворотки крови) и реакции на него организма (уровень сывороточных иммуноглобулинов, лизоцима сыворотки крови, внутрикожные пробы Кавецкого, Роттера на общую иммунологическую реактивность). Анализ полученных данных достоверно прогнозирует течение хирургической инфекции. Точность прогноза составляет 88,3% наблюдений (3).

3. На клеточно-генетическом анализе (5) культивированных клеток соединительной ткани, в том числе стромальных клеток костного мозга, их пролиферативном потенциале, на изучении взаимодействия клеток от больного in vitro с микроорганизмами, концентрации клеточного фибронектина в культуре кожных фибробластов, адгезии микроорганизмов на культивированных фибробластах кожи больного. Кроме того, используются цитохимические реакции: активность дегидрогеназ, кислой и щелочной фосфатазы как показатели, характеризующих энергетическое обеспечение клеток и тканей, активность фагоцитоза (5). Полученные при этих исследованиях данные позволяют выявить потенциал реактивности организма на биологические факторы, в том числе на микроорганизмы. Однако указанные методики предложены для изучения изменений при уже развившемся гнойно-септическом осложнении. При этом у данных авторов мы не нашли указания на достоверность и точность прогноза. Следует отметить, что предложенное в данном способе использование культуральных клеточных методик дает возможность получения результата лишь через 14 суток. Это является неблагоприятным для определения тактики лечения больных, а также требует особых условий культивирования и является весьма трудоемким.

Наиболее близким к заявленному является “Способ прогнозирования течения послеоперационного периода у больных с дегенеративно-дистрофическими процессами крупных суставов” (а.с. 1776635) (7). Сущность способа заключается в следующем: до проведения операции у больного исследуют бактерицидную активность сыворотки крови и дополнительно определяют уровень бета-лизинов. При уровне бета-лизинов свыше 75% либо ниже 10% предполагается высокая вероятность развития гнойно-воспалительных осложнений при реконструктивно-восстановительных операциях. Диагностическая ценность способа составила 94%. Однако оценка исходной функциональной активности лишь системы комплемента в предоперационном периоде у больных с ранее перенесенными гнойными артритами не позволяет предопределить развитие инфекционных осложнений, так как не отражает структурного и функционального состояния иммунокомпетентных клеток.

Задача изобретения: разработать способ прогнозирования риска развития гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде путем исследования экспрессии эндогенной ретровирусной последовательности в геноме пациента.

При решении поставленной задачи имеет место положительный лечебный эффект. Способ позволяет с высокой достоверностью прогнозировать возникновение гнойных осложнений, предупредить их развитие и тем самым снизить число инфекционных осложнений и улучшить результаты лечения.

При использовании способа имеет место экономический эффект, который заключается в сокращении пребывания больного в стационаре, уменьшается стоимость лечения за счет снижения использования дорогостоящих препаратов, сокращается пребывание больного на больничном листе.

При использовании способа имеет место социальный эффект – снижается риск инвалидизации пациентов.

Поставленная задача решается за счет того, что исследуют геном пациента методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и при выявлении экспрессии эндогенной ретровирусной последовательности 4-1 env прогнозируют высокий риск развития гнойных осложнений в послеоперационном периоде.

Технический результат достигается за счет использования метода ПЦР, отличающегося высокой чувствительностью, позволяющего достичь высокой точности полученных результатов (6). Последняя определяется сочетанием следующих трех факторов: эффективностью выделения РНК и ДНК, чувствительностью собственно ПЦР и чувствительностью метода индикации. Диагностическая специфичность ПЦР тест-систем, определяемая процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа, оценивается в 99-100%.

Технический результат достигается за счет того, что исследуют экспрессию эндогенной ретровирусной последовательности 4-1 env.

Эндогенные ретровирусные последовательности могут действовать на активацию или инактивацию клеточных генов либо могут быть вовлечены в хромосомные аберрации путем рекомбинации связанных элементов в различных участках хромосомы. Продукты ретровирусных генов сами по себе могут быть патогенными, например могут быть вовлечены в развитие опухолей и аутоиммунных заболеваний (10, 14, 15). С другой стороны, эндогенные ретровирусные элементы, как предполагается, играют важную роль в формировании генома позвоночных путем межклеточных транспозиционных событий и генерирования сайтов рекомбинаций (12, 13).

Некоторые эффекты ретровирусов реализуются через суперантигены. Суперантигены являются потенциальными иммуномодулирующими дериватами бактерий, вирусов и простейших. Они могут взаимодействовать как с молекулами главного комплекса гистосовместимости на антигенпрезентирующих клетках, так и с гипервариабельными структурами на антигенсвязывающих рецепторах Т-лимфоцитов (14).

Эндогенная ретровирусная последовательность 4-1 env имеет стабильную последовательность оснований:
5/ AGAGCCTACATTCGGGTTACC 3/ – sense,
5/ ACCGTATGATCCGATTGAGC 3/ – antisense (16).

Экспрессия (активация) эндогенного ретровирусного генома играет важную роль в механизмах регуляции функциональной активности клеток не только иммунной, но и кроветворной системы. Активация эндогенных ретровирусов происходит спонтанно либо под влиянием факторов микроокружения. Имеются единичные работы по исследованию влияния экспрессии эндогенных ретровирусных последовательностей при воспалительных сосудистых заболеваниях неизвестной этиологии, аутоиммунных и онкологических заболеваний (11, 17).

Способ осуществляется следующим образом:
Осуществляется забор периферической венозной крови в одноразовую пробирку. Клетки крови наслаиваются на градиент фиколла-верографина с плотностью 1,078 г/см³. Полученные в результате центрифугирования клетки интерфазы собираются. Клеточная суспензия трижды отмывается в физиологическом растворе, осаждается центрифугированием. Работа ведется в асептических условиях с использованием одноразовой посуды. РНК выделяют с использованием гуанидинтиоцианата (6). РНК экстрагируют, добавляя в пробирку 200 мкл фенол-хлороформовой смеси с изоамиловым спиртом. Смесь встряхивают, перемешивают, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Отбирают 200 мкл водной фазы, добавляют 1/10 объема тРНК (5 мкг/мл), 1/10 объема 3М натрия ацетата и 2 объема охлажденного этанола, выдерживают 15 мин при -70^oС, затем центрифугируют при 1200 об/мин 10 мин. Осадок растворяют в 25 мкл стерильной бидистиллированной воды и используют для проведения ревертирования РНК в ДНК. Ревертирование производят в соответствии со стандартным протоколом (18). Полученная с-ДНК подвергается реакции амплификации. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах:
1 этап:
Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95^oС в течение 30-60 сек.

2 этап:
Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для указанной выше пары праймеров температура отжига составляет 65^oС.

Время отжига -30-60 сек.

3 этап:
Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5′-конца к 3′-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров.

Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом – термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72^oС. Время протекания синтеза – 20-40 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2ⁿ, где n – число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Наличие специфического продукта ПЦР (ампликона) детектируют методом электрофореза в агарозном геле. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и положительному ДНК-контролю. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии экспрессии RGH в пробе, наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии экспрессии RGH в клинической пробе.

При положительном результате делается вывод либо о высоком риске развития гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде, либо о возможности существования гнойного очага, не проявляющегося клиническими и лабораторными признаками.

Пример конкретного выполнения.

Пример 1.

Больной М. 53 л., поступил 20.11.2000 г. в отделение эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов Новосибирского НИИТО. При поступлении жалобы: боли в области левого бедра, невозможность опоры на левую ногу.

Из анамнеза: В 1971 г. автодорожная травма – закрытый вывих левого бедра. Лечение консервативное. В 1981 г. по поводу посттравматического левостороннего коксартроза 3 ст. выполнено эндопротезирование левого тазобедренного сустава эндопротезом К. М. Сиваша. В 1997 г. по поводу асептической нестабильности эндопротеза К.М. Сиваша проведено ревизионное эндопротезирование левого тазобедренного сустава цементным эндопротезом W. Link. В 1999 г. возник абсцесс на оперированном бедре. По этому поводу неоднократно оперирован. Развился остеомиелит бедренной кости. Воспалительный процесс удалось купировать ценой удаления бедренного компонента эндопротеза. Сформировалась неопорная левая нижняя конечность.

На основании жалоб, клинической картины, лабораторного и рентгенологического обследования выставлен диагноз: Костный дефект проксимальной части бедренной кости после удаления бедренного компонента эндопротеза W. Link, имплантированного по поводу асептической нестабильности эндопротеза К.М. Сиваша. Хронический остеомиелит левой бедренной кости в стадии ремиссии.

По результатам предоперационного обследования (общий анализ крови – эр – 4,610¹²/л; гем – 146 г/л; л – 7,1 10⁹/л; э-5, п-6 с-40 л-43 м-6; ЛИИ 0,18; абсолютное число лимфоцитов 3, 0510⁹л; СОЭ 16 мм/час. Биохимия крови: общий белок 83 г/л; мочевина 5,6 ммоль/л; общий билирубин 6,54 мкмоль/л; К плазмы – 4,4 ммоль/л; глюкоза крови 4,6 ммоль/л; АКТ А – 47%; МА – 88%; ИИТ – 2,0; протромбиновый индекс 94%; фибриноген – 4,0 г/л.; общий анализ мочи: – цвет – желтый; уд. вес -1018; прозрачность – сл. мутная; белок – отр.; сахар – отр. ; реакция – кислая; лейкоциты – 1-3 в п/зр.; эп.плоский – 0-1 в п/зр) данных за воспалительный процесс не выявлено. Провокационное физиотерапевтическое воздействие УВЧ 7 на область левого бедра не привело к обострению воспалительного процесса. Однако критерий прогноза течения послеоперационного периода (положительная экспрессия RGH) свидетельствовал о большой вероятности послеоперационных инфекционных осложнений. Руководствуясь клиническими данными и стандартными лабораторными исследованиями, определены показания к оперативному лечению и 30.11.2000 г. была проведена операция – удаление ацетабулярного компонента эндопротеза W. Link, ревизионное бесцементное эндопротезирование левого тазобедренного сустава с использованием антипротрузионного ацетабулярного компонента и ревизионного бедренного компонента с дополнительной фиксацией компонентов шурупами и костной аллосоломкой. Учитывая данные прогнозирования в пред- и послеоперационном периодах, проводились лечебные мероприятия, направленные на профилактику возможных осложнений (прием виферона в свечах через день в течение 10 дней, бактисубтила по 2 дозы 3 раза в день с течение всего периода нахождения в стационаре). Несмотря на проводимые мероприятия, послеоперационное течение осложнилось инфицированием гематомы. Поэтому возникли показания к ревизии эндопротеза. На операции выявлены участки некроза мягких тканей по ходу предыдущего доступа. Они были иссечены, полость промыта растворами антисептиков, рана дренирована сквозными хлорвиниловыми дренажами. К шейке протеза подведен микроирригатор для введения левомеколя. Рана круглосуточно промывалась раствором бетадина. Дренажи удалены через две недели. В посевах раневого отделяемого определялись Ps. Aeruginosa и St. Epidermidis с чувствительностью к цефалоспоринам, клиндамицину. Проводилась патогенетическая антибактериальная и инфузионная терапия, переливание эритромассы и плазмы, курс виферона. Рана зажила первичным натяжением. Больной в удовлетворительном состоянии 12.01. 2001 г. (проведено 53 койко/дня) выписан на амбулаторное лечение. На момент выписки данных за воспалительный процесс нет. Общий анализ крови: эр – 3,710¹²/л; гем – 115 г/л; л – 5,5 10⁹/л, э-1, п-4 с-57 л-26 м-6; плазматические клетки – 1; ЛИИ 0,68; абсолютное число лимфоцитов 1,4310⁹/л; СОЭ 55 мм/час; Биохимия крови: общий белок 60 г/л; мочевина 5,8 ммоль/л; молекулы средней массы – 0,354 (норма – 300); общий билирубин 7,24 мкмоль/л; К плазмы – 5,1 ммоль/л; глюкоза крови 4,9 ммоль/л; АПТВ – 33с; протромбиновый индекс 87%; фибриноген – 4,0 г/л.; Общий анализ мочи: – цвет – желтый; уд. вес – 1018; прозрачность – сл. мутная; белок – отр.; сахар – отр.; реакция – кислая; лейкоциты – 1-3 в п/зр.; эп.плоский – 0-1 в п/зр.

Таким образом, целенаправленное применение профилактических и лечебных мероприятий позволило купировать инфекционное осложнение без удаления эндопротеза тазобедренного сустава, несмотря на высокий риск послеоперационного инфекционного осложнения.

Пример 2.

Больной 3. 45 л поступил 23.05.2000 г. в отделение эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов Новосибирского НИИТО. При поступлении жалобы на боли и ограничение движений в левом тазобедренном суставе, укорочение левой нижней конечности.

Из анамнеза: в 1971 г. спортивная травма: вывих левого бедра. Лечение консервативное. В дальнейшем развился левосторонний гнойный коксит, хронический остеомиелит левой бедренной кости. Больной многократно оперирован. Воспалительный процесс купирован с исходом в фиброзный анкилоз тазобедренного сустава.

На основании жалоб, клинической картины, лабораторного и рентгенологического обследования выставлен DS: Метаартритический коксартроз 3 ст. слева, сгибательно-приводящая контрактура левого тазобедренного сустава, коксалгия слева. Регионарный остеопороз.

Предоперационное обследование (общий анализ крови – эр – 4,010¹²/л; гем – 126 г/л; л – 5,3 10⁹/л, б-1, э-6, п-1 с-64 л-27 м-1; ЛИИ 0,348; абсолютное число лимфоцитов 1,4310⁹/л; СОЭ 18 мм/час. Биохимия крови: общий белок – 61 г/л; мочевина 5,2 ммоль/л; общий билирубин 8,16 мкмоль/л; К плазмы – 3,6 ммоль/л; глюкоза крови 5,4 ммоль/л; АКТ А – 20,5%; МА – 100%; ИИТ – 2,3; протромбиновый индекс 103%; фибриноген – 3,0 г/л.; общий анализ мочи: – цвет – желтый; уд. вес-1012; прозрачность – сл. мутная; белок – отр.; сахар – отр. ; реакция – кислая; лейкоциты – 1-3 в п/зр.; эп.плоский – 0-1 в п/зр.) не выявило данных за воспалительный процесс. Провокационное физиотерапевтическое воздействие – УВЧ 7 на область левого бедра и курс пирогенала не привело к его обострению. Критерий прогноза послеоперационного течения (экспрессия RGH отрицательная) свидетельствовал о малой вероятности развития послеоперационных осложнений.

Больному 01.06.2000 г. выполнена операция – первичное эндопротезирование левого тазобедренного сустава эндопротезом “Zweimuller”. Осложнений в послеоперационном периоде нет. Заживление первичным натяжением. Больной в удовлетворительном состоянии, 13.06.2000 г. (проведено 20 койко/дней) выписан на амбулаторное лечение. На момент выписки общий анализ крови: эр – 3,110¹²/л; гем – 92 г/л; л – 7,6 10⁹/л, б-1, э-2, п-4 с-65 л-24 м-4; ЛИИ 0,87; абсолютное число лимфоцитов 1,8210⁹л; СОЭ 57 мм/час. Биохимия крови: общий белок 69 г/л; мочевина 3,0 ммоль/л; молекулы средней массы – 0,231 (норма – 300) общий билирубин 8,61 мкмоль/л; К плазмы – 3,5 ммоль/л; глюкоза крови 4,3 ммоль/л; АКТ А – 79%; МА 93%; протромбиновый индекс 100%; фибриноген – 5,0 г/л.; Общий анализ мочи: – цвет – желтый; уд. вес – 1016; прозрачность – сл. мутная; белок – следы; сахар – отр.; реакция – кислая; лейкоциты – 4-2 в п/зр.; эп.плоский – 1-3 в п/зр.

Список литературы

2. Клиническая иммунология: Руководство для врачей / под ред. Соколова Е.И. – М.: Медицина, 1998. – С.76-78.

5. Меерсон Е. М., Ильина В.К, Говалло В.И., Меркурьева Р.В. Клеточно-генетические, иммунологические, биохимические методы в характеристике осложненного течения заживления костных ран: Пособие для врачей и научных работников. – М., 1997.

6. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – Мир, 1999. – С.314.

12. Katsumata K. , Yoshiki T. “Endogenous retroviruses in autoimmune diseases”. Nippon Rincho 55(6): 1475-1481, 1997.

13. Larsson E, Andersson G. Beneficial role of human endogenous retroviruses: facts and hypotheses. G Scand J Immunol 1998 Oct; 48(4): 329-338.

14. Nakagawa K., Harrison L.C. “The potential roles of endogenous retroviruses in autoimmunity”. Immunology Rev. 152: 193-236, 1996.

15. O’Neill H. C. “The diversity of retroviral diseases of the immune system”. Immunol. Cell. Biol. 70 (3): 193-199, 1992.

18. Rybicki. Molecular Biology Techniques Manual. 1996.

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития инфекционных осложенений путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что исследуют геном пациента методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и при выявлении экспрессии эндогенной ретровирусной последовательности 4 – 1 env прогнозируют высокий риск развития гнойных осложнений в послеоперационном периоде.