Патент на изобретение №2204399

(54) СПОСОБ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной гастроэнтерологии, и может быть использовано для патогенетического лечения хронических заболеваний печени в эксперименте. Используют суспензию фетальных клеток печени, и/или селезенки, и/или тимуса в количестве 1 мл с клеточным разведением (3-5)10⁵. Перед введением суспензию двукратно облучают гелий-неоновым лазером по 2 мин с перерывом 5 мин. Плотность мощности излучения 75 мВт/см². Донору фетальных органов за 16 ч до их извлечения подкожно вводят 50%-ный масляный раствор четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 г веса. Способ повышает функциональную активность фетальных клеток. Это ускоряет процессы регенерации в печени.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной гастроэнтерологии, и может использоваться для лечения хронических заболевании печени в эксперименте.

Известен способ исследования ферментативной деятельности цитохрома Р450 внутри пересаженных небольших кусочков печени эмбриона. Гепатоциты были собраны на 20 день беременности крыс и пересажены в селезенку взрослой особи реципиента (см. Kato K. и др. Ферментативная деятельность и выражение цитохрома Р450 внутри эмбриональных гепатоцитов, пересаженных в селезенку крыс”. /Internet/ /Yahoo. Отдел медицины и желудочно-кишечной хирургии, Центральная библиотека Нью-Йоркского медицинского колледжа, Valhalla, США, сентябрь 1999 г.).

Микроскопическая экспертиза селезенок реципиентов на 4-10 недели после трансплантации выявила множество гепатоцитов с шнуроподобными структурами в красном пульпе. Эти результаты продемонстрировали, что гепатоциты могут быть пересажены в селезенку донора и в дальнейшем расти в селезенке.

Однако недостатком данного способа является опасность возникновения некроза пересаженных тканей в связи с малой вероятностью прорастания сосудами, нарушение гемоциркуляции в селезенке, что может нарушить функции как печени, так и самой селезенки. Этот способ является не физиологичным, так как пересадка производится в селезенку, а не в печень.

Кроме того, возможно в более поздние сроки рассасывание основой части пересаженного материала.

У пересаженных кусочков ткани к тому же низкая функциональная и регенерирующая активность.

Известен способ трансплантации эмбриональных печеночных клеток в эксперименте, выбранный в качестве ближайшего аналога, предусматривающий инъекционное введение суспензии фетальных клеток (см. патент RU 2153344, М.кл. А 61 К 33/407, А 61 P 43/00, опубл. 27.07.2000 г.).

По мнению авторов способ позволяет расширить функциональные возможности эмбриональной ткани, увеличить реагирующую способность печеночном ткани и уменьшить реакцию отторжения.

Способ, по мнению авторов, может применяться при дегенеративно-дистрофических поражениях печени.

Однако, как отмечают и сами авторы, положительные результаты при использовании данного способа можно наблюдать только через 10-20 дней после проведения эксперимента.

Таким образом, задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является повышение функциональной активности трансплантируемых остальных клеток, достижение положительного результата в более короткие сроки и, как следствие, сокращение времени эксперимента.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе патогенетического лечения хронических заболеваний печени в эксперименте, предусматривающем инъекционное введение суспензии фетальных клеток, согласно изобретению для введения используют суспензию фетальных клеток печени, и/или селезенки, и/или тимуса, выделенных из фетальных органов донора, получившего за 16 часов до их извлечения подкожную инъекцию 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 г веса, дополнительно перед введением подвергнутую двукратному по две минуты с перерывом в 5 минут облучению гелий-неоновым лазеров при плотности мощности излучения 75 мВт/см², при этом количество вводимой суспензии составляет 1 мл с клеточным разведением (3-5)10⁵.

Заявителем экспериментально установлено что именно введение в организм реципиента именно суспензии фетальных клеток печени, и/или селезенки, и/или тимуса, причем выделенных из фетальных органов донора, получившего за 16 часов до их извлечения подкожную инъекции 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 г веса и дополнительное перед введением двукратное по две минуты с перерывом в 5 минут облучение данной суспензии гелий-неоновым лазером при плотности мощности излучения 75 мВт/см², при количестве введенной суспензии 1 мл с клеточным разведением (3-5)10⁵, способствует значительному по сравнению со всеми известными способами повышению функциональной активности трансплантируемых фетальных клеток, регенерирующей способности и, как следствие, значительному ускорению процесса регенерации поврежденной печени.

Это объясняется тем, что именно благодаря облучению лазером (гелий-неоновым) усиливаются иммуностимуляторные свойства фетальных клеток, что и позволяет ускорить процесс регенерации поврежденной печени, что в свою очередь ускоряет достижение положительного результата и сокращает время проведения эксперимента.

А дополнительное введение в организм донора 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода в заявляемых количествах и в заявляемые сроки резко активизирует выработку фетальными тканями донора биологически активных веществ, которые переходят в имплантируемые реципиенту фатальные клетки и тем самым еще больше увеличивают процесс регенерации поврежденной печени.

Совокупность существенных признаков заявляемого объекта “способ” имеет отличия от ближайшего аналога и не следует явным образом из изученного уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критерию “новизна” и “изобретательский уровень”.

Заявленное изобретение может найти широкое применение в экспериментальной медицине, что свидетельствует о его соответствии критерию “промышленная применимость”.

Способ в эксперименте осуществляется следующим образом.

Фетальные ткани печени берутся у плодов крыс-самок линии Вистар с 20-дневным сроком беременности. За 16 часов до извлечения фетальных тканей из организма крысы-донора ей вводится инъекционно 50%-ный масляный раствор четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 г веса крысы-донора. Данное количество гепатотропного яда не оказывает на организм животного токсического действия.

Извлеченные фетальные ткани помещают в физиологический раствор.

Далее с помощью гомогенизатора с люфтом, сохраняющим целостность клеток, готовится смесь (суспензия) фетальных клеток.

На основе полученных гомогенатов органов готовится суспензия остальных клеток с разведением (3-5)10⁵. Клеточность суспензии подсчитывается с помощью камеры Горяева. Жизнеспособность клеток оценивается с помощью окраски их смеси трипановым синим.

Затем суспензию помещают в стерильные пробирки. В пробирку вставляется световод, диаметр которого выбран таковым, чтобы он плотно входил в пробирку.

Световод устанавливается на некотором расстоянии от поверхности суспензии, не соприкасаясь с ней, и двукратно по две минуты с перерывом в 5 минут облучается гелий-неоновым лазером. Плотность мощность лазерного излучения 75 мВт/см².

Облученная суспензия инъекционно вводится внутрибрюшинно биологическому объекту в количестве 1 мл.

Положительные результаты (клинические, биохимические и гистологические) наблюдаются на 5-7 сутки.

Аналогичным образом готовится и суспензия фетальным клеток селезенки и тимуса и их смеси, а также смеси остальных клеток печени, селезенки и тимуса.

Эксперименты с использованием данной методики, проведенные на животных, показали, что скорость и качество регенеративных процессов в тканях печени достоверно увеличиваются за счет внутриклеточной и клеточной регенерации гепатоцитов, нарастания числа многоядерных и крупноядерных гепатоцитев, содержащих крупнодисперсные хроматин, 1-3 ядрышка, а также за счет нарастания пролиферации звездчатых ретикулоцитов.

Это подтверждено гистологически и гистохимически.

Пример 1. Биологический объект. Вес 200 г. Диагноз: экспериментальный цирроз печени. Стадия ремиссии.

Суспензию фетальных клеток печени разведением 310⁵ готовили из фетальных тканей животного-донора, получившего за 16 часов до извлечения фетальных органов 0,8 мл 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода.

После приготовления ее подвергали двукратному по 2 минуты с перерывом в 5 минут облучению гелий-неоновым лазером плотностью мощности излучения 75 мВт/см².

Приготовленную и облученную суспензию ввели биологическому объекту в количестве 1 мл внутрибрюшинно.

Клинически положительные результаты наблюдались спустя 6 дней после введения суспензии.

Животное забито через 3 недели. Гистологически и гистохимически подтверждена высокая регенерирующая способность трансплантированных фетальных клеток.

Пример 2. Биологический объект весом в 200 г. Диагноз – хронический гепатит. Стадия ремиссии.

Технология приготовления суспензии по примеру 1. Отличия: готовили суспензию из фетальных клеток печени, и селезенки, и тимуса.

Разведение: 510⁵. Количество введенной суспензии 1 мл. Плотность мощности лазерного излучения 75 мВт/см².

Положительные результаты наблюдались спустя 5 суток после введения суспензии фетальных клеток.

Результаты подтверждены клинически, гистологически и гистохимически.

Формула изобретения

Способ патогенетического лечения хронических заболеваний печени в эксперименте, предусматривающий инъекционное введение суспензии фетальных клеток, отличающийся тем, что для введения используют суспензию фетальных клеток печени, и/или селезенки, и/или тимуса, выделенных из фетальных органов донора, получившего за 16 ч до их извлечения подкожную инъекцию 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 г веса, дополнительно перед введением подвергнутую двукратному по две мин с перерывом в 5 мин облучению гелий-неоновым лазером при плотности мощности излучения 75 мВт/см², при этом количество вводимой суспензии составляет 1 мл с клеточным разведение 3-510⁵.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 30.12.2003

Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006