Патент на изобретение №2202820
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩЕГО УФ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ФОТОМАТЕРИАЛА
(57) Реферат: Изобретение относится к созданию светочувствительного материала на основе состава, включающего фермент, и использованию его в полутоновой регистрации УФ-излучения. Описывается способ получения ферментсодержащего УФ-чувствительного фотоматериала, состоящего из подложки и светочувствительного слоя, включающий нанесение светочувствительного раствора, содержащего акрилоилированное светочувствительное производное протеолитического фермента, акриламид, N,N’-метилен-бис-акриламид, персульфат аммония, N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин и воду, на подложку и его высушивание, причем полимеризацию светочувствительного раствора проводят в атмосфере инертного газа. В качестве подложки используют стекло, лавсан, триацетатную пленку или бумагу. Подложку можно покрыть капроновой сеткой. Получают высококачественное полутоновое позитивное или негативное изображение. Срок хранения светочувствительного материала не менее 2 лет. 4 з.п. ф-лы, 1 ил. Изобретение относится к области создания светочувствительных материалов на основе составов, содержащих ферменты, и может быть использовано для полутоновой регистрации УФ-излучения. В настоящее время не существует ферментсодержащих слоев, гарантирующих длительный срок хранения регистрирующей среды. Активирующее воздействие УФ-света на слои, содержащие модифицированные ферменты, описано в литературе. В основе таких материалов лежит использование неактивных светочувствительных производных ферментов. Так, например, исходно неактивный димер папаина под действием УФ-света распадается на две активные молекулы фермента. Иной принцип был описан для химотрипсина. Модификация активного центра производными цис-коричной кислоты приводит к получению относительно стабильных неактивных производных фермента. УФ-облучение таких производных вызывает цис-транс-изомеризацию остатка коричной кислоты и образование нестабильных транс-производных, способных к быстрой регенерации активного фермента. В работе (Никольская И.И. Создание светочувствительного материала с использованием ферментов, Дисс. Канд. Хим. Наук, Москва, МГУ, 1979, 147 с.) описаны слои, состоящие из желатины и неактивного светочувствительного производного фермента. В качестве светочувствительных производных фермента использовали синтетический димер папаина и цис-циннамоил-химотрипсин. При освещении такого слоя УФ-светом через шаблон на экспонированных участках исходно неактивный фермент переходит в активное состояние и гидролизует желатину при помещении отпечатка в буферный раствор. На неэкспонированных участках фермент остается неактивным и не способен гидролизовать желатину при проявлении. В результате фермент остается неактивным и не способен гидролизовать желатину при проявлении. Таким образом, получают рельефное позитивное изображение. Носитель светочувствительной компоненты (желатиновая матрица) является одновременно “проявителем” скрытого изображения. Конечное изображение, таким образом, получают по принципу “да-нет”. Полутоновое изображение может быть получено при использовании матриц, инертных по отношению к ферменту. В этом случает при проявлении используются субстраты, дающие в результате ферментативной реакции нерастворимые окрашенные продукты. В результате оптическая плотность конкретного участка слоя после его проявления прямо пропорциональна количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Эта величина, в свою очередь, прямо пропорциональна количеству активного фермента на данном участке, т. е. , в конечном итоге, дозе, полученной данным участком слоя при экспонировании. Простейшим вариантом реализации такого подхода явился материал на базе бумаги, высушенной после пропитки раствором цис-циннамоил-химотрипсина (Березин И.В., Варфолдомеев С.Д., Казанская Н.Ф., Мартинек К., Хлудова М.С. Способ получения фотографического изображения. Авт. Свид. СССР 439780, 1971). Данный способ, однако, ограничен подложкой – бумагой. Наиболее близким к заявленному способу получения ферментсодержащего УФ-чувствительного фотоматериала является способ, описанный в патенте (Audran R.G.L., Hilaire J.-C., Bourdon J.A.L., Lestienne A.F.P., Photographic Process and Elements, Pat. USA 3515551, 1970), в котором авторы предлагают добавлять к активному ферменту красители, которые катализируют окисление фермента под действием УФ-света, переводя его в неактивную форму. В этом случае светочувствительный слой состоит из желатины, активного фермента и сенсибилизатора фотоинактивации. В качестве фермента предлагались трипсин, химотрипсин, папаин, ренин, бромелаин и другие бактериальные и грибные протеиназы. В качестве сенсибилизаторов окисления белка использовали флюоресцеин и его производные, рибофлавин, производные акридина. Светочувствительный слой наносили на подложку и высушивали. При освещении такого слоя УФ-светом через шаблон на экспонированных участках фермент окисляется, т.е. переходит в неактивное состояние, и не способен гидролизовать желатину при помещении отпечатка в буферный раствор. На неэкспонированных участках фермент остается активным и при проявлении гидролизует желатину. В результате получают рельефное негативное изображение. Общим недостатком всех вышеперечисленных способов является низкая стабильность фермента как светочувствительной компоненты, что резко ограничивает срок хранения данных фотоматериалов. Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является повышение стабильности ферментсодержащего светочувствительного слоя и увеличение срока хранения УФ-светочувствительного материала на его основе. Это достигается при помощи ковалентной иммобилизации светочувствительного производного протеолитического фермента в полиакриламидную гелевую матрицу. Более конкретно, поставленная задача достигается способом получения ферментсодержащего УФ-чувствительного фотоматериала, состоящего из подложки и нанесенного не нее светочувствительного слоя, включающего в себя фермент и аминсодержащее соединение. Светочувствительный слой получают из раствора, содержащего, мас. %: акрилоированное светочувствительное производное протеолитического фермента – 0,5-1,0; акриламид – 15,0-30,0; N,N’-метилен-бис-акриламид – 0,01-0,05; персульфат аммония – 0,001-0,005; N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин – 0,007-0,015; вода – остальное. После нанесения светочувствительного раствора на подложку его высушивают и полимеризуют в атмосфере инертного газа. При этом получают светочувствительный слой с толщиной 80-150 мкм. В качестве подложки используют стекло, или лавсан, или триацетатную пленку. Эти подложки целесообразно покрывать капроновой сеткой для повышения механической прочности светочувствительного слоя. В качестве подложки можно также использовать бумагу. В этом случае покрытие подложки капроновой сеткой не требуется. Полимеризация светочувствительного раствора в атмосфере инертного газа необходима для того, чтобы исключить возможное окисление его компонентов кислородом воздуха. При уменьшении количества акрилоированного светочувствительного производного протеолитического фермента ниже 0,5 мас.%, акриламида – ниже 15,0 мас. %, N,N’-метилен-бис-акриламида – ниже 0,01 мас.%, персульфата аммония – ниже 0,001 мас. %, N,N,N’,N’ – тетраметилэтилендиамина – ниже 0,007 мас.% получается очень рыхлая структура пленки с низкой механической прочностью. Соответственно, увеличение количества указанных компонентов светочувствительного раствора выше заявленных приводит к получению жестких слоев, где практически невозможно вести ферментативное проявление скрытого изображения из-за возникающих стерических и диффузионных затруднений. При получении светочувствительного слоя толщиной менее 80 мкм он не обладает необходимой механической прочностью. При толщине более 150 мкм ухудшается его адгезия к подложке, появляются неровности, что ухудшает качество получаемого изображения. На чертеже схематично изображено получение белков, ковалентно иммобилизированных в полакрилатные гели. Белковую глобулу модифицируют, вводя на ее поверхность остатки, содержащие двойные связи (например, взаимодействием хлорангидрида акриловой кислоты с аминогруппами белка). Двойные связи на поверхности белка способны к сополимеризации в смеси, содержащей акрилатный мономер и бифункциональный сшивающий агент (например, N,N’-метилен-бис-акриламид). В результате образуется сетчатая структура полимерного геля, в которую белок ковалентно включен через предварительно введенные на его поверхность акриловые остатки. На примере фермента химотрипсина ранее было показано, что получаемые таким образом препараты демонстрируют уникальную стабильность иммобилизованного фермента во времени (Лукашева Е.В., Айсина Р.Б., Казанская Н. Ф., Еремеев Н.Л. Свойства  -химотрипсина, ковалентно включенного в сферические микрогранулы из полиакриламида. Биохимия, 1980, т.45, 3, с.с.449-454). Процессы акроилирования белка и модификации активного центра фермента с целью получения его светочувствительного производного не мешают друг другу. Было показано, что ковалентная иммобилизация светочувствительного производного фермента в полиакриламидную гелевую матрицу не влияет на его светочувствительные свойства (Айсина Р.Б., Еремеев Н.Л., Казанская Н.Ф., Лукашева Е. В. Микрогранулированная форма цис-циннамоилхимотрипсина для полутоновой ферментной фотографии, Биохимия, 1981, т.46, вып.6, с.с.979-985), однако не было сведений о том, что такие светочувствительные ферментсодержащие гелевые матрицы могут быть использованы для создания светочувствительного материала.
Могут быть использованы все светочувствительные модифицирующие группы (цис-циннамоил, цис-нитроциннамоил, п-диметиламино-цис-циннамоил, n-(N,N, N-триметиламино)-цис-циннамоил) в любых комбинациях с такими ферментами, как химотрипсин, трипсин, папаин, термитаза, субтилизин.
Изобретение поясняется следующими примерами. Все операции, кроме экспонирования, производили в красном свете.
Пример 1К 1 мл водного раствора, содержащего 1,0 мас.% акрилоил-цис-циннамоил-химотрипсина, 15,0 мас. % акриламида и 0,05 мас.% N,N’-метилен-бис-акриламида, добавляют инициаторы полимеризации – 20 мкл водного 0,78 М раствора персульфата аммония (0,002 мас.%) и 10 мкл N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамина (0,01 мас.%). Тщательно перемешивают. Полученный раствор наносят на стекло, покрытое капроновой сеткой, накрывают прижимным стеклом и инкубируют в атмосфере инертного газа в течение 40 мин при комнатной температуре до окончания процесса полимеризации. Материал высушивают на воздухе в течение 2-3 ч и хранят в темноте при температуре 4oС. Расход раствора – 1 мл/100 см2, толщина светочувствительного слоя 80 мкм. Полученный светочувствительный материал экспонируют через негатив УФ-светом с длиной волны облучения 254 нм. Экспонированный материал для проявления погружают на 5 мин в раствор 10-3 М 5-броминдоксилацетата (рН 7,8) при комнатной температуре. Изображение полутоновое позитивное, срок хранения полученного материала с момента изготовления – не менее 2-х лет. Пример 2 К 1 мл водного раствора, содержащего 0,5 мас.% акрилоил-п-диметиламино-цис-циннамоил-трипсина, 30,0 мас. % акриламида и 0,01 мас.% N,N’-метилен-бис-акриламида добавляют инициаторы полимеризации – 50 мкл водного 0,78 М раствора персульфата аммония (0,005 мас.%) и 15 мкл N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамина (0,015 мас.%). Полученный раствор наносят на бумагу и инкубируют в атмосфере инертного газа в течение 40 мин при комнатной температуре до окончания процесса полимеризации. Материал высушивают на воздухе в течение 2-3 ч и хранят в темноте при 4oС. Расход раствора – 1 мл/50 см2, толщина светочувствительного слоя 150 мкм. Высушенный материал экспонируют через негатив УФ-светом с длиной волны облучения 320 нм. Проявление осуществляют, как в примере 1. Изображение полутоновое позитивное, срок хранения материала с момента изготовления – не менее 2-х лет. Пример 3 Светочувствительный материал получен по примеру 1, но светочувствительный раствор наносят на лавсан, покрытый капроновой сеткой. Характеристики материала аналогичны для материала, полученного по примеру 1. Пример 4 К 1 мл водного раствора, содержащего 0,7 мас.% акрилоил-цис-п-нитроциннамоил-субтилизина, 20,0 мас. % акриламида и 0,02 мас.% N,N’-метилен-бис-акриламида, добавляют инициаторы полимеризации – 10 мкл водного 0,78 М раствора персульфата аммония (0,001 мас.%) и 7 мкл N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамина (0,007 мас.%). Полученный раствор наносят на триацетатную пленку, покрытую капроновой сеткой, накрывают прижимным стеклом и инкубируют в атмосфере инертного газа в течение 40 мин при комнатной температуре до окончания процесса полимеризации. Материал высушивают 2-3 ч на воздухе и хранят в темноте при 4oС. Расход раствора – 1 мл/80 см2, толщина светочувствительного слоя 120 мкм. Высушенный материал экспонируют через позитив УФ-светом с длиной волны облучения 290 нм. Экспонированный материал для проявления погружают на 5 мин в раствор 5  10-3 М индоксилового эфира N-ацетил-L-лейцина (рН 8,0) при комнатной температуре. Изображение полутоновое позитивное, срок хранения материала с момента изготовления – не менее 2-х лет.
Представленные примеры показывают, что изобретение позволяет получить ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал с длительным сроком хранения и обеспечивает высокое качество получаемого изображения.
Формула изобретения
Акрилоилированное светочувствительное производное протеолитического фермента – 0,5 – 1,0 Акриламид – 15,0 – 30,0 N,N’-метилен-бис-акриламид – 0,01 – 0,05 Персульфат аммония – 0,001 – 0,005 N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин – 0,007 – 0,015 Вода – Остальное 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают светочувствительный слой с толщиной 80-150 мкм. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве подложки используют бумагу. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве подложки используют стекло, или лавсан, или триацетатную пленку. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что подложку покрывают капроновой сеткой. РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 14.06.2004
Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006
|
||||||||||||||||||||||||||
