Патент на изобретение №2202798
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ МЕТОДОМ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА
(57) Реферат: Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ осуществляется путем приготовления золя серебра и добавления полученного золя к водному раствору белковополисахаридного антигена бруцелл. Далее полученную смесь стабилизируют внесением фосфатного буфера, содержащего сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия. Способ приготовления диагностикума дешев, технологичен, доступен, позволяет отказаться от дорогостоящего оснащения, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность результатов дот-иммуноанализа. Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для приготовления диагностикума, с помощью которого в дот-иммуноанализе исследуются сыворотки крови на наличие противобруцеллезных антител. В настоящее время в клинической лабораторной практике для обнаружения противобруцеллезных антител традиционно используют реакции Хеддльсона (РХ), Райта (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА), связывания комплемента (РСК), Кумбса (Пинигин А.Ф., Петухова О.С. Методические рекомендации по бруцеллезу. – Иркутск, 1978. – 49 с.). Однако эти реакции недостаточно чувствительны и специфичны, с их помощью выявляется приблизительно 2/3 больных животных или людей. В связи с этим актуальными остаются вопросы совершенствования существующих и разработка новых, более информативных диагностических тест-систем. Цель изобретения – удешевление, повышение технологичности и доступности способа приготовления диагностикума. Поставленная цель достигается тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят обработкой раствора азотнокислого серебра равным объемом раствора боргидрида натрия. Созревший золь дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, добавляют к водному раствору белковополисахаридного антигена бруцелл. Через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия. Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят, восстанавливая серебро из 0,02%-ного водного раствора азотнокислого серебра равным объемом 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия при комнатной температуре и легком встряхивании, через 10-15 мин созревший золь добавляют к раствору белковополисахаридного антигена бруцелл в соотношении по объему 10:1 соответственно, дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения “новизна”. Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторы не нашли способ приготовления диагностикума для дот-иммуноанализа на основе бруцеллезного белковополисахаридного антигена, меченного коллоидным серебром, который бы использовался для обнаружения специфических антител. Предлагаемые режимы конструирования диагностикума позволяют достичь поставленной цели – удешевление, повышение доступности и технологичности способа приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа. При этом не используются дорогостоящие реактивы и оборудование (ультрацентрифуга). Данный диагностикум может производиться и применяться в клинических, ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся диагностикой бруцеллеза. Таким образом, предлагаемый способ приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа соответствует критериям “изобретательский уровень” и “промышленная применимость”. Предлагаемый способ приготовления диагностикума для обнаружения противобруцеллезных антител выполняется следующим образом: к 0,0001 г азотнокислого серебра, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия. Смесь перемешивают 15 мин при комнатной температуре для созревания золя серебра. К 1 мл водного раствора белковополисахаридного антигена (БПА) концентрацией 4 мг добавляют дробно, в три приема, приготовленный золь серебра с интервалами по 10 мин и постоянном легком перемешивании в количестве 5 мл, 3 мл и 2 мл соответственно. Через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 2% БСА, 20% телячьей фетальной сыворотки и 0,04% азида натрия. Пример. К 0,0001 г азотнокислого серебра, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия. Смесь перемешивают 15 мин при комнатной температуре для созревания золя серебра. К 1 мл водного раствора БПА концентрацией 4 мг добавляют дробно, в три приема, приготовленный золь серебра с интервалами по 10 мин и постоянном легком перемешивании в количестве 5 мл, 3 мл и 2 мл соответственно. Через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют в течение 30 мин внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 2% БСА, 20% телячьей фетальной сыворотки и 0,04% азида натрия. Полученный диагностикум использован в дот-иммуноанализе для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови больных людей и животных. Отмечена высокая чувствительность и специфичность диагностикума, приготовленного по предлагаемой методике. Сыворотки считаются положительными, если специфические антитела в них выявляются в разведении  1:400.
Предлагаемая методика получения диагностикума легко воспроизводима, экономична, технологически проста, не требует специального дорогостоящего оснащения, доступна. Использование диагностикума в дот-иммуноанализе позволяет быстро и качественно осуществлять детекцию противобруцеллезных антител в сыворотках крови.
Диагностикум, приготовленный данным способом, апробирован в дот-иммуноанализе при исследовании 200 сывороток крови людей и животных. Во всех случаях у больных людей и животных с установленным диагнозом острого, хронического или резидуального бруцеллеза обнаружены специфические антитела. При исследовании сывороток крови здоровых людей или животных, а также гетерологичных сывороток противобруцеллезные антитела обнаружены не были, что указывает на высокую специфичность приготовленного диагностикума. Аналогичные результаты получены при параллельном исследовании указанных сывороток в дот-иммуноанализе с БПА, меченным коллоидным золотом. Однако диагностикум на основе серебра дешевле, технологичнее, доступнее, позволяет отказаться от использования дорогостоящих импортных реактивов и оборудования (ультрацентрифуги).
Формула изобретения
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 06.07.2002
Номер и год публикации бюллетеня: 18-2004
Извещение опубликовано: 27.06.2004
|
||||||||||||||||||||||||||
