Патент на изобретение №2202776

(54) СПОСОБ ОКРАСКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, может быть использовано при морфологических исследованиях в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине. Способ включает проводку материала по гистологической батарее и заливку в парафин, затем пересадку на блоки. На микротоме изготовлены серийные гистологические срезы, нанесены на предметные стекла. После депарафинизации в ксилоле препараты перенесены сначала в 95^o, затем в 70^o спирт, после чего споласкивали в 2 порциях дистиллированной воды. На срезы нанесены по 2 капли 2%-ного раствора соли прочного синего ББ. Через 5 мин раствор сливали и наносили по 2 капли того же раствора и по 2 капли красителя (состав красителя: 0,6 г метилового зеленого и 0,4 г пиронина G смешивали в 20 мл аптечного глицерина и 80 мл дистиллированной воды). Срез красили в течение 5 мин, после чего ополаскивали в 2 порциях дистиллированной воды и сушили фильтровальной бумагой. Для дифференциации ядер использовали 2 смены 96^o этилового спирта. Заключали препараты в канадский бальзам, предварительно просветляя по 5 мин в бюксах с мета-ксилолом. Способ обеспечивает стабильное окрашивание клеток и клеточных структур, позволяет корректировать интенсивность окрашивания различных структур без ущерба для качества гистологических препаратов.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, может быть использовано при морфологических исследованиях в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине.

Существует несколько способов выявления ДНК и РНК в клетках с помощью окраски гистологических препаратов метиловым зеленым и пиронином (Паппенгейм, 1899; Унна-Паппенгейм, 1903; Браше, 1942; Треван и Шаррок, 1951; Лилли, 1954; Курник, 1952, 1955 и др.).

Указанные методы требуют применения значительного количества различных реактивов (ацетатного буфера, бутилового спирта, ацетона, фенола и т.д.), что удорожает процедуру окрашивания, достаточно продолжительны по времени и не обеспечивают стабильное качество окраски.

В частности, метод Унна-Паппенгейма, который может быть с полным основанием рекомендован для чисто гистологических целей (Меркулов Г.А., Л., 1969, с. 275-279), имеет ряд недостатков:
1) фиксация тканей требует применения специальных фиксирующих смесей (жидкость Карнуа, смесь абсолютного спирта с ледяной уксусной кислотой (1:1) и т.д.);
2) относительно большая и неопределенная продолжительность времени окрашивания в смеси – от 15-20 мин до 1-2 ч;
3) недостаточно элективная окраска ядер и отсутствие стандартности окрашивания пиронином;
4) нежелательная экстракция метилового зеленого или пиронина при ополаскивании и обезвоживании;
5) использование растворов карболовой кислоты (фенола) для приготовления смеси красителя.

Аналогом предлагаемого способа является метод Браше (1942), описанный в “Гистохимии” Э. Пирса (М., 1962, с.745).

Этот метод имеет также ряд недостатков:
1) смесь красителя хранится относительно недолго (около 1 недели);
2) неопределенно время окрашивания – от 10 мин до 24 ч, что требует конкретного выбора времени для каждого случая окраски;
3) при ополаскивании в дистиллированной воде вымывается пиронин (поэтому нужно проводить процедуру осторожно и очень быстро, что требует большого опыта);
4) обезвоживание в абсолютном ацетоне, затем в 2-х порциях смеси абсолютного ацетона и ксилола (опять-таки нужно проводить процедуру кратковременно и осторожно, т.к. происходит быстрая экстракция красителей из препарата);
5) заключение в дистрен-дибутилфталат-ксилол (препараты плохо сохраняются при заключении в канадский бальзам);
6) возможна формалиновая фиксация, но кратковременная (4-16 ч). Поэтому при необходимости невозможно сохранять фиксированные препараты, ибо после длительной формалиновой фиксации окраска по методу Браше дает плохие результаты;
7) необходимость использования М/5 ацетатного буфера с рН 4,8.

Доктор Дьердъ Кисели (“Практическая микротехника и гистохимия”, Будапешт, 1962, с. 199) предлагает метод окрашивания метиловым зеленым и пиронином раствором Тафта, состоящим из 0,5 г метилового зеленого и 0,2 г пиронина в 100 мл 0,1 М ацетатного буфера с рН 4,4. Время окрашивания 10 мин. Однако промывка и обезвоживание проводится сначала в смеси абсолютного спирта и терциерного бутилового спирта, затем двукратно в сменяемом терциерном бутиловом спирте.

Недостатками данного метода мы считаем необходимость применения в смеси красителя ацетатного буфера с определенным рН и терциерного бутилового спирта. Последний, как указывает автор, довольно часто нужно сменять и при низкой температуре воздуха в лаборатории он приобретает плотную консистенцию, вследствие чего возникает необходимость расплавить его в термостате. Помимо того, окраску нужно проводить при строгом соблюдении сроков и в контролируемых условиях (раствор Тафта сохраняется недолго).

МЕТОД КУРНИКА (1952, 1955) имеет некоторые преимущества перед вышеописанными. В “Патогистологической технике и практической гистохимии” Р. Лилли (М. , 1969, с. 146) описан первоначальный вариант, предложенный Курником в 1952 г. (Kurnick, Stain Techn., 25, 233, (1952)). В этом варианте окрашивание 0,2%-ным раствором метилового зеленого в 0,01 М ацетатном буфере с рН 4,2 проводится раздельно, затем, после обезвоживания, в двух сменах н-бутилового спирта красится насыщенным или разбавленным свежеприготовленным раствором пиронина В ацетоне во избежании экстракции пиронина при обезвоживании и обработке дифференцирующими метиловый зеленый агентами.

Недостатки:
1) метод требует использования специальных фиксаторов (смесь Карнуа, холодный ацетон и др.);
2) использование ацетатного буфера;
3) необходимость обезвоживания только в н-бутиловом (или трет-бутиловом) спирте;
4) раздельное окрашивание метиловым зеленым и пиронином;
5) пригодны только определенные виды пиронина и свежеприготовленные его растворы в ацетоне;
6) обязательно просветление в кедровом масле перед заключением в смолу.

ПРОТОТИПОМ предлагаемого способа является метод Курника (1955) с применением метилового зеленого – пиронина Y для выявления ДНК и РНК (Э. Пирс, “Гистохимия”, М., 1962, с.74б).

МЕТОД С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТИЛОВОГО ЗЕЛЕНОГО – ПИРОНИНА Y ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК
(Курник, 1955)
(Карнуа, Уолман, 22^o; парафиновые срезы или срезы, изготовленные в криостате)
Приготовление красителя
Приготовить 2-процентный водный раствор пиронина Y. Провести экстракцию СНСl₃, встряхивая в делительной воронке, пока слой хлороформа не перестанет окрашиваться. Приготовить 2%-ный водный раствор метилового зеленого и провести экстракцию СНСl₃, как и с пиронином, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет. Для использования взять смесь, состоящую из 12,5 мл пиронина Y, 7,5 мл метилового зеленого и 30 мл дистиллированной воды.

Метод
1. Довести парафиновые срезы до воды; срезы, изготовленные в криостате, можно сразу поместить в красящий раствор.

2. Окрашивать метиловым зеленым – пиронином в течение 6 мин.

3. Промокнуть фильтровальной бумагой.

4. Погрузить в две порции н-бутанола, на 5 мин в каждую.

5. Погрузить в ксилол на 5 мин.

6. Погрузить в кедровое масло на 5 мин.

7. Заключить в пермаунт.

Результат
Хроматин окрашивается в светло-зеленый цвет, ядрышки – в ярко-красный, РНК цитоплазмы – в ярко-красный, эозинофильные гранулы и остеоид – также в ярко-красный.

Недостатки:
1) метод требует использования специальных фиксаторов;
2) для обезвоживания и дифференцировки подходит только н-бутанол;
3) обязательно просветление в кедровом масле;
4) пригоден лишь пиронин Y 05564 фирмы “Gurr”;
5) необходимо экстрагировать СНС1₃ не только из метилового зеленого, но и из пиронина Y, что является довольно трудоемкой процедурой;
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью изобретения является обеспечение высокого качества окраски гистологических препаратов, упрощение, сокращение продолжительности и удешевление процедуры при сохранении стабильного выявления в клетках РНК и ДНК.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для фиксации материала вполне подходит 10%-ный нейтральный формалин (или любой другой фиксатор).

1. После депарафинизации срезы доводят до воды,
2. На срез наносят 2-3 капли 2%-ного водного раствора соли прочного синего ББ.

3. Через 5 мин сливают раствор и на срез наносят по 2 капли того же раствора и смеси метилового зеленого и пиронина G (состав: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина G смешивают в 20 мл глицерина и доливают 80 мл дистиллированной воды. Реактивы растворяют взбалтыванием). Препарат красится в течение 5 мин.

4. Сливают краску и ополаскивают в 2-х порциях дистиллированной воды.

5. Сушат фильтровальной бумагой досуха и дифференцируют ядра клеток в 2-х сменах 96^o этилового спирта.

6. Просветляют в 2-х сменах ксилола по 5 мин и заключают в канадский бальзам.

Результат окрашивания. Хроматин ядер окрашивается в различные оттенки зеленого цвета, РНК цитоплазмы, эозинофильные гранулы – в ярко-красный цвет. Гранулы тучных клеток – в различные оттенки красного цвета (от светло-красного до темного) в зависимости от степени грануляции и зрелости.

Реактив сохраняет способность к окрашиванию более 3-х недель независимо от способа хранения. Препараты, окрашенные по этой методике, хорошо выдерживают длительное хранение.

СОПОСТАВИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРИЗНАКОВ ПРОТОТИПА И ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Предлагаемый способ в отличие от прототипа не требует применения специальных фиксаторов.

2. Нет необходимости очищения пиронина хлороформом, что является обязательным в прототипе.

3. В предлагаемом способе можно применить любой пиронин, независимо от фирмы (в методе Курника используется пиронин Y 05564 фирмы “Gurr”).

4. Вполне пригоден для обезвоживания и дифференцировки ядер 96^o этиловый спирт.

5. Споласкивание в дистиллированной воде после окраски не приводит к вымыванию красителей независимо от времени процедуры.

6. Нет необходимости применения специальных просветляющих веществ (в прототипе обязательно погружение в кедровое масло).

7. Предлагаемый способ обеспечивает стабильное окрашивание клеточных структур, возможность коррекции окраски гистологических препаратов с увеличением или снижением интенсивности окрашивания различных структур без ущерба для качества препарата, что исключено в прототипе.

8. Необязательно использование для заключения специальных смол, вполне подходит канадский бальзам.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Выписка из лабораторного журнала кафедры анатомии человека.

22.03.2000 г. Проведена проводка материала по гистологической батарее и заливка в парафин, затем пересадка на блоки.

23.03.2000 г. На микротоме изготовлены серийные гистологические срезы, нанесены на предметные стекла.

24.03.2000 г. После депарафинизации в ксилоле препараты перенесены сперва в 96^o, затем в 70^o спирт, после чего споласкивали в 2 порциях дистиллированной воды. На срезы нанесены по 2 капли 2%-ного раствора соли прочного синего ББ. Через 5 мин раствор сливали и наносили по 2 капли того же раствора и по 2 капли красителя (состав красителя: 0,6 г метилового зеленого и 0,4 г пиронина G смешивали в 20 мл аптечного глицерина и 80 мл дистиллированной воды). Срез красили в течение 5 мин, после чего ополаскивали в 2 порциях дистиллированной воды и сушили фильтровальной бумагой. Для дифференциации ядер использовали 2 смены 96^o этилового спирта. Заключали препараты в канадский бальзам, предварительно просветляя по 5 мин в 2 бюксах с мета-ксилолом.

ПОЛЕЗНОСТЬ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
По этой методике приготовлено более 300 гистологических препаратов лимфатических узлов, тонкой кишки и селезенки интактных и подопытных белых крыс на кафедрах анатомии человека и патологической анатомии Дагестанской государственной медицинской академии с октября 1999 г.

Предлагаемым способом изучены клеточные реакции и изменения содержания ДНК и РНК клеток брыжеечных лимфатических узлов, тонкой кишки и селезенки при экспериментальном каловом перитоните, на фоне введения перфторана и в условиях нормы.

Разработанный способ исключает использование и уменьшает расход ряда реактивов, обеспечивает стабильное окрашивание клеток и клеточных структур, позволяет корректировать интенсивность окрашивания различных структур без ущерба для качества гистологических препаратов.

Литература
1. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. – Будапешт, 1962, с. 199.

2. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., 1969, с.146.

3. Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники. Л., 1969, с. 275-279.

4. Пирс Э. Гистохимия. М., 1962, с. 744-746 (прототип).

Формула изобретения

Способ окраски гистологических препаратов, заключающийся в окраске гистологических срезов метиловым зеленым и пиронином, отличающийся тем, что дополнительно используют 2%-ный водный раствор соли прочного синего ББ, которым предварительно протравливают препарат до нанесения смеси красителя, через 5 мин сливают раствор и на срез наносят по 2 капли 2%-ного водного раствора соли прочного синего ББ и смеси красителя следующего состава: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина, 20 мл глицерина и 80 мл дистиллированной воды; для дифференцировки ядер используют 96^o этиловый спирт.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.09.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 5-2004

Извещение опубликовано: 20.02.2004