Патент на изобретение №2202369
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНЫХ КОНЪЮГАТОВ
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии. Выделение иммуноглобулинов класса G проводят пятикратным переосаждением полиэтиленгликолем-6000. Иммунизируют животных выделенными иммуноглобулинами класса G для получения антивидовой сыворотки. Выделяют специфические антитела из антивидовой сыворотки и определяют их активность и специфичность путем титрования в иммуноферментном анализе с гомологичными антигенами. Способ позволяет повысить активность и специфичность целевого продукта. 3 табл. Изобретение относится к биотехнологии и может широко применяться в медицине и ветеринарии при проведении иммуноферментного анализа для индикации и идентификации в сыворотке крови кур антител различного происхождения. Известен способ (прототип) изготовления антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов, одной из стадий которого является выделение желточных антител с помощью двукратного переосаждения полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000) (12% вес/объем) при центрифугировании в течение 10 мин при 14000 об/мин на центрифуге К-24 с последующей доочисткой препарата IgG гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-200 [Ярыгина Е.И., Быкова Н.Н. “Применение аффинной хроматографии для получения иммунопероксидазного конъюгата анти-IgG кур” – Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня основания Курской биофабрики, положившей начало развитию агробиологической промышленности в России (1986-1996), Курск, 1996, стр. 369-370]. Однако этот способ имеет следующие недостатки: стадия доочистки очень трудоемка и дорогостояща, к тому же требуется проводить концентрирование IgG, сошедшего с колонки. Другим недостатком прототипа является то, что определение количества анти-IgG антител в гипериммунной антисыворотке проводится по результатам титрования в реакции диффузионной преципитации (РДП), что не гарантирует получение высокоактивного и специфичного конъюгата, так как сыворотки, полученные на IgG желтка яиц кур, обладая преципитирующей активностью, не обязательно высокоспецифичны в иммуноферментном анализе (ИФА) при взаимодействии с гомологичными антигенами. Целью заявляемого изобретения является повышение активности и специфичности целевого продукта, а также снижение себестоимости препарата. Указанная цель достигается тем, что иммунохимически чистые IgG желтка яиц кур получают пятикратной преципитацией полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 Д (ПЭГ-6000), а анти-IgG кур антитела в гипериммунной сыворотке определяют титрованием в иммуноферментном анализе с гомологичными антигенами. Способ осуществляют следующим образом. По заявляемому способу  -глобулиновую фракцию, состоящую в основном из IgG желтка, отделяют от липидов и пигментов путем осаждения их ПЭГ-6000 в концентрации 3,5% (вес/объем). Затем -глобулиновую фракцию, содержащуюся в супернатанте, подвергают пятикратному переосаждению ПЭГ-6000 с концентрацией 12% (вес/объем) без последующей доочистки на колонке с сефадексом G-200. Полученный таким образом препарат IgG не содержит примесей, а по активности не уступает препарату, полученному по способу-прототипу, одной из стадий которого является обязательная доочистка препарата после двукратного переосаждения ПЭГ-6000 на колонке с сефадексом G-200. Сравнительные данные активности и чистоты препарата IgG представлены в табл. 1.
Пример 2. Препарат IgG используют при гипериммунизации животных, например кроликов, баранов, морских свинок и др. для получения сыворотки, содержащей анти-IgG кур антитела.
При использовании препарата IgG, полученного по заявляемому способу, достаточно одной ревакцинации для получения высокоактивных и специфичных сывороток, в то время как при использовании препаратов IgG, содержащих примесные белки (полученные известным способом) требуется не менее 3-5 ревакцинаций.
Из таблицы 2 следует, что гипериммунные антисыворотки, одинаково активные в РДЦ, обладают не одинаковой активностью в ИФА.
Пример 3. Для конъюгации перйодатным методом аффинно очищенных антивидовых антител с пероксидазой хрена (RZ=3) используют анти-IgG кур антитела по результатам титрования в ИФА. Сравнительные данные активности и специфичности конъюгатов, изготовленных по способу-прототипу и заявляемому способу, приведены в таблице 3.
Таким образом, заявляемый способ изготовления иммунопероксидазных конъюгатов позволяет повысить активность и специфичность препарата и значительно снизить его себестоимость.
Формула изобретения
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
