Патент на изобретение №2202112
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ МЕТОДОМ ДВУХФАЗНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
(57) Реферат: Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и коз. Способ предусматривает на первом этапе взаимодействие исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса оспы овец. На втором этапе не вступивший в реакцию антиген взаимодействует с моноклональными антителами клона 08.3. Образовавшийся комплекс моноклональное антитело – антиген выявляется специфическим пероксидазным конъюгатом поликлональных антител. Предлагаемый способ более чувствителен и специфичен, а также позволяет экспрессно проводить исследование сывороток крови животных. 1 табл. Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз путем выявления вирусспецифических антител методом двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) на основе моноклональных антител, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях. Реакция нейтрализации наряду с высокой чувствительностью требует специальных условий проведения и не обладает экспрессностью. Окончательный учет результатов реакции проводят на 9 сутки с момента ее постановки. Использование реакции диффузионной преципитации для диагностики оспы овец и оспы коз ограничивается недостаточной ее специфичностью из-за возможности перекрестной реакции с антителами к вирусу контагиозного пустулезного дерматита. Применение реакции непрямой иммунной флюоресценции с использованием поликлональных сывороток затруднено ввиду наличия неспецифического фонового окрашивания при учете результатов. Наиболее приемлемыми являются методы ИФА. Разработанный Sharma S. et al. (1988 г.) метод ингибирования ТФ ИФА, сочетая в себе чувствительность и производительность, не позволял дифференцировать каприпоксвирусные антитела от антител к вирусу контагиозного пустулезного дерматита. Эту проблему удалось решить Cam V. М. et al. (1994 г.), которые разработали непрямой ИФА для обнаружения антител к вирусу бугорчатки КРС с использованием рекомбинантного белка Р 32 каприпоксвирусов в качестве специфического антигена и антивидового конъюгата. Суть метода заключается в следующем. Полистирол, используемый в качестве твердой фазы, сенсибилизируют очищенным рекомбинантным белком Р 32, экспрессированным в плазмидном векторе. Продукт экспрессии является структурным полипептидом, характерным для всех каприпоксвирусов. На следующем этапе реакции антитела исследуемых сывороток крови взаимодействуют с иммобилизированным на твердой фазе антигеном. Выявление образовавшихся комплексов антиген-антитело осуществляют антивидовым (антиовечьим, антикозьим или антибычьим) пероксидазным конъюгатом. Недостатком описанного метода, являющегося прототипом предлагаемого изобретения, можно считать то, что технология получения иммунореагентов трудоемка, дорогостояща. Методология получения рекомбинантного антигена сложна в исполнении, а возможная замена нескольких нуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность данного белка, может приводить к потере его функциональной активности. Целью настоящего изобретения является разработка метода двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител, пригодного для обнаружения специфических антител к вирусам оспы овец и оспы коз в сыворотках крови больных и переболевших животных и дифференцирования их от антител к гетерологичным возбудителям болезней мелких жвачных. Указанная цель достигается тем, что на первом этапе реакции, проходящем в отдельной панели, антитела исследуемых сывороток крови взаимодействуют со специфическим культуральным антигеном вируса оспы овец. Обнаружение не вступившего в реакцию антигена происходит на втором этапе, где в качестве “захватывающей” основы используются иммобилизированные на твердой фазе моноклональные антитела клона 08.3, обладающие специфичностью к антигенным детерминантам полипептида молекулярной массы 36-40 кД вируса оспы овец штамма “НИСХИ”. Выявление комплекса моноклональное антитело – специфический антиген осуществляется пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных – реконвалесцентов. Пример конкретного выполнения При постановке метода двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) использовали 96-луночные панели для микрокультивирования. а) Приготовление тест-панелей Перед началом постановки метода готовили тест-панели 1 и 2. Для блокирования свободных сайтов сорбции полистирола в лунки панели 1 вносили по 0,4 см3 блокирующего буфера (забуференный фосфатный раствор pH 7,2-7,4 (ЗФР); 0,05% Твин 20; 1% бычий сывороточный альбумин) и инкубировали в течение 30 мин при 37( ![]() ![]() В лунки нижнего ряда панели 1 вносили по 0,15 см3 контрольных (нормальная и специфическая) и исследуемых образцов сыворотки крови и готовили двукратные разведения на блокирующем буфере. После чего в лунки всех рядов вносили специфический антиген вируса оспы овец штамма “НИСХИ” в рабочем разведении на блокирующем буфере в объеме 0,15 см3 и инкубировали 1,5 ч при 37( ![]() ![]() ![]() ![]() При фотометрическом учете измеряют оптическую плотность хромогенного субстратного раствора при длине волны 405 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальную контрольную сыворотку, в 2 и более раз выше оптической плотности хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфическую контрольную сыворотки. В работе по определению чувствительности и специфичности данного метода использовали гомологичные (нормальные и специфические) и гетерологичные специфические сыворотки к вирусам катаральной лихорадки овец, контагиозного пустулезного дерматита, чумы мелких жвачных, лихорадки долины Рифт, болезни Акабане, болезни Найроби. Результаты по определению чувствительности и специфичности данного метода представлены в таблице. Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что предлагаемый способ ТФ ИФА на основе моноклональных антител позволяет обнаруживать в сыворотке крови антитела, специфичные к антигенам вирусов оспы овец и оспы коз, и дифференцировать таковые от антител, образующихся к возбудителям болезней мелких жвачных, протекающих с клинически сходной картиной. Способ прост в использовании и может быть применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 27.07.2003
Извещение опубликовано: 27.09.2004 БИ: 27/2004
|
||||||||||||||||||||||||||