Патент на изобретение №2202112

Published by on




РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ



ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(19) RU (11) 2202112 (13) C1
(51) МПК 7
G01N33/577, G01N33/569, C12P21/08, A61K39/275
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 07.04.2011 – прекратил действие

(21), (22) Заявка: 2001120821/13, 26.07.2001

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

26.07.2001

(45) Опубликовано: 10.04.2003

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
CARN V.M. An antigen trapping ELISA for the detection of capripoxvirus in tissue culture supernatant and biopsy samples, J. Virol Methods, 1995 Jan; 51(1): 95-102. RAO T.V. et al. Evaluation of immunocapture ELISA for diagnosis of goat pox, Acta Virol, 1997 Dec; 41(6): 345-8. SARMA B.J. et al. Detection of sheep pox virus multiplication in sheep thyroid cells by acridine orange staining, Indian J. Exp. Biol., 1977 Mar; 15(3): 239-40. RU 2121366 10.11.1998. RU 1614201, 20.03.1995.

Адрес для переписки:

601120, Владимирская обл., г. Покров, ВНИИВВ и М

(71) Заявитель(и):

ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии

(72) Автор(ы):

Машнин А.В.,
Стрижаков А.А.,
Вишняков И.Ф.,
Стрижакова О.М.,
Новикова М.Б.,
Горшкова Т.Ф.,
Куриннов В.В.

(73) Патентообладатель(и):

ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии

(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ МЕТОДОМ ДВУХФАЗНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ


(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и коз. Способ предусматривает на первом этапе взаимодействие исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса оспы овец. На втором этапе не вступивший в реакцию антиген взаимодействует с моноклональными антителами клона 08.3. Образовавшийся комплекс моноклональное антитело – антиген выявляется специфическим пероксидазным конъюгатом поликлональных антител. Предлагаемый способ более чувствителен и специфичен, а также позволяет экспрессно проводить исследование сывороток крови животных. 1 табл.


Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз путем выявления вирусспецифических антител методом двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) на основе моноклональных антител, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Реакция нейтрализации наряду с высокой чувствительностью требует специальных условий проведения и не обладает экспрессностью. Окончательный учет результатов реакции проводят на 9 сутки с момента ее постановки.

Использование реакции диффузионной преципитации для диагностики оспы овец и оспы коз ограничивается недостаточной ее специфичностью из-за возможности перекрестной реакции с антителами к вирусу контагиозного пустулезного дерматита.

Применение реакции непрямой иммунной флюоресценции с использованием поликлональных сывороток затруднено ввиду наличия неспецифического фонового окрашивания при учете результатов.

Наиболее приемлемыми являются методы ИФА. Разработанный Sharma S. et al. (1988 г.) метод ингибирования ТФ ИФА, сочетая в себе чувствительность и производительность, не позволял дифференцировать каприпоксвирусные антитела от антител к вирусу контагиозного пустулезного дерматита.

Эту проблему удалось решить Cam V. М. et al. (1994 г.), которые разработали непрямой ИФА для обнаружения антител к вирусу бугорчатки КРС с использованием рекомбинантного белка Р 32 каприпоксвирусов в качестве специфического антигена и антивидового конъюгата.

Суть метода заключается в следующем. Полистирол, используемый в качестве твердой фазы, сенсибилизируют очищенным рекомбинантным белком Р 32, экспрессированным в плазмидном векторе. Продукт экспрессии является структурным полипептидом, характерным для всех каприпоксвирусов. На следующем этапе реакции антитела исследуемых сывороток крови взаимодействуют с иммобилизированным на твердой фазе антигеном. Выявление образовавшихся комплексов антиген-антитело осуществляют антивидовым (антиовечьим, антикозьим или антибычьим) пероксидазным конъюгатом.

Недостатком описанного метода, являющегося прототипом предлагаемого изобретения, можно считать то, что технология получения иммунореагентов трудоемка, дорогостояща. Методология получения рекомбинантного антигена сложна в исполнении, а возможная замена нескольких нуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность данного белка, может приводить к потере его функциональной активности.

Целью настоящего изобретения является разработка метода двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител, пригодного для обнаружения специфических антител к вирусам оспы овец и оспы коз в сыворотках крови больных и переболевших животных и дифференцирования их от антител к гетерологичным возбудителям болезней мелких жвачных.

Указанная цель достигается тем, что на первом этапе реакции, проходящем в отдельной панели, антитела исследуемых сывороток крови взаимодействуют со специфическим культуральным антигеном вируса оспы овец.

Обнаружение не вступившего в реакцию антигена происходит на втором этапе, где в качестве “захватывающей” основы используются иммобилизированные на твердой фазе моноклональные антитела клона 08.3, обладающие специфичностью к антигенным детерминантам полипептида молекулярной массы 36-40 кД вируса оспы овец штамма “НИСХИ”. Выявление комплекса моноклональное антитело – специфический антиген осуществляется пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных – реконвалесцентов.

Пример конкретного выполнения
При постановке метода двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) использовали 96-луночные панели для микрокультивирования.

а) Приготовление тест-панелей
Перед началом постановки метода готовили тест-панели 1 и 2. Для блокирования свободных сайтов сорбции полистирола в лунки панели 1 вносили по 0,4 см3 блокирующего буфера (забуференный фосфатный раствор pH 7,2-7,4 (ЗФР); 0,05% Твин 20; 1% бычий сывороточный альбумин) и инкубировали в течение 30 мин при 37(0,5)oС. Содержимое лунок удаляли, лунки двукратно промывали отмывочным буфером (ЗФР; 0,05% Твин 20).

Лунки панели 2 сенсибилизировали моноклональными антителами в рабочем разведении на 0,01М карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,5) в течение 18 часов при 4 (0,5)oС.

б) Постановка реакции
В лунки нижнего ряда панели 1 вносили по 0,15 см3 контрольных (нормальная и специфическая) и исследуемых образцов сыворотки крови и готовили двукратные разведения на блокирующем буфере. После чего в лунки всех рядов вносили специфический антиген вируса оспы овец штамма “НИСХИ” в рабочем разведении на блокирующем буфере в объеме 0,15 см3 и инкубировали 1,5 ч при 37(0,5)oС.

После часового инкубирования панели 1 содержимое лунок панели 2 удаляли, лунки трехкратно промывали отмывочным буфером и блокировали свободные сайты сорбции полистирола путем инкубирования в лунках блокирующего буфера в объеме 0,2 см3 при 37(0,5)oС. Спустя 30 мин, содержимое лунок удаляли и промывали их двукратно отмывочным буфером. Затем смесь сыворотка-антиген из лунок панели 1 в объеме 0,15 см3 переносили в одноименные лунки панели 2. Через 1 час инкубирования при 37(0,5)oС и последующей трехкратной отмывке отмывочным буфером в лунки панели вносили по 0,15 см3 специфического поликлонального пероксидазного конъюгата в рабочем разведении на блокирующем буфере. Содержимое лунок инкубировали в течение 1 ч при 37(0,5)oС. Лунки семикратно отмывали отмывочным буфером, однократно ЗФР и вносили по 0,15 см3/лунку хромогенного субстратного раствора ABTS. После 30 мин инкубировния при комнатной температуре проводили учет и оценку результатов реакции.

Фотометрический учет реакции
При фотометрическом учете измеряют оптическую плотность хромогенного субстратного раствора при длине волны 405 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальную контрольную сыворотку, в 2 и более раз выше оптической плотности хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфическую контрольную сыворотки.

В работе по определению чувствительности и специфичности данного метода использовали гомологичные (нормальные и специфические) и гетерологичные специфические сыворотки к вирусам катаральной лихорадки овец, контагиозного пустулезного дерматита, чумы мелких жвачных, лихорадки долины Рифт, болезни Акабане, болезни Найроби. Результаты по определению чувствительности и специфичности данного метода представлены в таблице.

Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что предлагаемый способ ТФ ИФА на основе моноклональных антител позволяет обнаруживать в сыворотке крови антитела, специфичные к антигенам вирусов оспы овец и оспы коз, и дифференцировать таковые от антител, образующихся к возбудителям болезней мелких жвачных, протекающих с клинически сходной картиной. Способ прост в использовании и может быть применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Формула изобретения


Способ обнаружения специфических антител к вирусам оспы овец и оспы коз методом ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа, предусматривающий взаимодействие исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса оспы овец и последующую детекцию иммобилизированного на твердой фазе комплекса антитело – специфический антиген поликлональным пероксидазным конъюгатом, отличающийся тем, что на первом этапе реакции происходит взаимодействие исследуемой сыворотки с культуральным антигеном вируса оспы овец, на втором этапе не вступивший в реакцию антиген взаимодействует с иммобилизированными на твердой фазе моноклональными антителами клона 08.3, обладающими специфичностью к антигенной детерминанте полипептида молекулярной массы 36-40 кД вируса оспы овец штамма “НИСХИ”, а образовавшийся комплекс моноклональное антитело – антиген выявляют специфическим пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных-реконвалесцентов.

РИСУНКИ

Рисунок 1


MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.07.2003

Извещение опубликовано: 27.09.2004 БИ: 27/2004


Categories: BD_2202000-2202999