Патент на изобретение №2201964

(54) СОЕДИНЕНИЕ WK-5344А И СОЕДИНЕНИЕ WK-5344B, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ИХ ШТАММ STREPTOMYCES SP. WK-5344 FERM BP-6668

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и биологии. Соединения WK-5344А и WK-5344В обладают ингибирующим действием в отношении белка, переносящего сложный эфир холестерина. Способ предусматривает выращивание штамма Streptomyces sp. WK-5344 FERM ВР-6668, при этом соединение WK-5344А и соединение WK-5344В аккумулируются в среде, затем соединение WK-5344А и соединение WK-5344В выделяют. Изобретение позволяет получить вещества, эффективные для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых накапливанием холестерина в организме человека. 4 с.п.ф-лы, 8 ил.

Изобретение относится к соединению WK-5344A и к соединению WK-5344B, а также к способу получения данных соединений. В частности, настоящее изобретение относится к новым соединениям WK-5344A и WK-5344B, обладающим ингибирующим действием в отношении белка, переносящего сложный эфир холестерина, а также к способу получения данных соединений.

Описание уровня техники
Известны различные профилактические лекарственные препараты для предупреждения инфаркта миокарда и инсульта, возникающих вследствие отложения холестерина на стенках сосудов, такого как артериосклероз, вызванный артериальной гипертензией у взрослых. Такие лекарственные препараты включают, например, правастатин, мевинолин и флувастатин (Endo A. Journal of Medicinal Chemistry 28, 401-405, 1985 and Endo A. Journal of Lipid Research 33, 1569-1582, 1992).

Возникновение инфаркта миокарда и инсульта и течение этих заболеваний являются очень сложными и многогранными процессами. Следовательно, для лечения данных заболеваний требуются соединения, обладающие различными механизмами действия.

В последнее время в результате введения западных норм повседневного питания возрастает смертность вследствие инфаркта миокарда и инсульта в результате отложения холестерина на стенках сосудов и существует проблема заболеваний, связанных с образом жизни. Большая часть холестерина этерифицируется главным образом в печени и кишечнике длинноцепочечными жирными кислотами с образованием сложных эфиров холестерина, которые выделяются в кровь в качестве компонентов хиломикрона и липопротеинов очень низкой плотности и циркулируют в крови главным образом как компоненты липопротеинов низкой плотности и липопротеинов высокой плотности.

Липопротеины низкой плотности, которые переносят холестерин, поставляемый из печени в периферические ткани, представляют собой фактор риска, способствующий возникновению артериосклероза. Наоборот, липопротеины высокой плотности аккумулируют холестерин из периферических тканей и, как полагают, являются фактором, подавляющим развитие артериосклероза. Именно белок, переносящий сложный эфир холестерина, принимает участие в обменной реакции сложного эфира холестерина между обоими видами липопротеинов, и это связано с формированием липопротеинов низкой плотности.

Следовательно, соединение, которое ингибирует функционирование белка, переносящего сложный эфир холестерина, приводит к снижению количества липопротеинов низкой плотности, фактора риска развития артериосклероза, в крови и в противоположность этому проявляет антиартериосклеротическое действие вследствие повышения количества липопротеинов высокой плотности, которые подавляют артериосклероз, и, таким образом, является эффективным в случае указанных заболеваний.

Краткое описание и цель изобретения
Авторы настоящего изобретения исследовали продукт метаболизма микроорганизмов, выделенных из почв, для того, чтобы выявить новые биологически активные вещества, и обнаружили, что культивируемая масса свежевыделенного из почвы микробного штамма WK-5344 продуцирует соединения, обладающие ингибирующей активностью в отношении белка, переносящего сложный эфир холестерина. В результате выделения из указанной культивируемой массы и очистки указанного ингибитора белка, переносящего сложный эфир холестерина, и так как эти соединения обладали такой химической структурой, которая ранее не была известна, авторы настоящего изобретения обозначили указанные вещества как соединение WK-5344A и соединение WK-5344B.

Настоящее изобретение выполнено в соответствии с результатами этих исследований.

Целью настоящего изобретения является соединение WK-5344A, имеющее следующую структурную формулу:

Другой целью настоящего изобретения является соединение WK-5344B, имеющее следующую структурную формулу:

Кроме того, целью настоящего изобретения является способ получения соединения WK-5344A или его соли и соединения WK-5344B или его соли, который включает культивирование микроорганизма, относящегося к роду Streptomyces и обладающего способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, аккумулирование соединения WK-5344A и соединения WK-5344B в культивируемой массе и выделение соединения WK-5344A и соединения WK-5344B из указанной культивируемой массы.

Описание предпочтительного выполнения изобретения
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к способу получения новых соединений – соединения WK-5344A и соединения WK-5344B или солей этих соединений, согласно которому микроорганизм, относящийся к роду Streptomyces и обладающий способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, представляет собой Streptomyces sp. WK-5344. Настоящее изобретение также относится к микроорганизму, относящемуся к роду Streptomyces и обладающему способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, причем указанный микроорганизм представляет собой Streptomyces sp. WK-5344 (FERM BP-6668).

Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B (здесь и далее обозначен как микроорганизм, продуцирующий соединение WK-5344), относится к роду Streptomyces и обладает достаточной способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B без ограничений. Примером предпочтительного микробного штамма, используемого для продуцирования соединения WK-5344A и соединения WK-5344B, являющихся предметом настоящего изобретения, является Streptomyces sp. WK-5344, который выделен из свежесобранной почвы авторами настоящего изобретения.

Таксономические свойства указанного штамма являются следующими.

Морфологические свойства
Вегетативный мицелий хорошо растет на различных агаровых средах и не наблюдается никакой фрагментации. Воздушный мицелий обильно растет на агаре, содержащем неорганические соли и крахмал, и на агаре, содержащем глицерин и аспарагин, проявляя окраску от белой до серой. Согласно микроскопическим исследованиям, воздушный мицелий образует спирали и цепи из более чем 20 спор. Форма спор является овальной, и споры имеют размер 1,0×0,5 мкм. Поверхность спор покрыта шипиками. Ни склероций, ни спорангий, ни зооспора не наблюдаются.

Культуральные свойства на различных агаровых средах
Культуральные свойства продуцирующего штамма, являющегося предметом настоящего изобретения, выявленные согласно методу Ширлинга и Готтлиба (Е.В. Shirling and D. Gottlieb, Internationale Journal of Systematic Bacteriology, 16, 313, 1966), приведены ниже. Оттенки окраски определяли в соответствии с руководством Color Harmony Manual, 4^th ED. (Container Corporation of America, Chicago, 1958), используемым в качестве стандарта для определения окраски, и указывали наименование оттенка окраски и ее код (в круглых скобках). Ниже приведены, если не оговаривается особо, результаты визуальных наблюдений за состоянием культуры указанного штамма, полученные на различных культуральных средах при 27^oС в течение 2 недель.

Агар, содержащий сахарозу и нитрат
Рост – хороший, оттенок светло-горчичный, желтовато-коричневый (2ie)
Реверсия – светло-горчичный, желтовато-коричневый – зеленый мшистый (2ie-24lg)
Воздушный мицелий – обильный, пепельный (5fe)
Растворимый пигмент – не продуцируется
Агар, содержащий глюкозу и аспарагин (ISP)
Рост – хороший, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – хороший, оттенок “бамбук” (2gс)
Воздушный мицелий – обильный, светло-алебастровый – пепельный (13ba-5fe)
Растворимый пигмент – пастельно-желтый (1db)
Агар, содержащий глицерин и аспарагин (ISP)
Рост – хороший, оттенок светло-коричневый (2ес)
Реверсия – оттенок “бамбук” (2gс)
Воздушный мицелий – обильный, светло-алебастровый – пепельный (13ba-5fe)
Растворимый пигмент – пастельно-желтый (1db)
Агар, содержащий неорганические соли и крахмал (ISP)
Рост – хороший, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – оттенок “верблюд” (3ie)
Воздушный мицелий – обильный, пепельный (5fe)
Растворимый пигмент – не продуцируется
Агар, содержащий тирозин (ISP)
Рост – хороший, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – светло-горчичный, желтовато-коричневый – зеленый мшистый (2ie-24lg)
Воздушный мицелий – обильный, светло-алебастровый (13bа)
Растворимый пигмент – не продуцируется
Агар, содержащий овсяную муку (ISP)
Рост – умеренный, оттенок “бамбук” – золотисто-желтый (2fb-2kb)
Реверсия – оттенок “бамбук” – приглушенный коричневый (2fb-2li)
Воздушный мицелий – умеренный, пепельный (5fe)
Растворимый пигмент – лимонного цвета (lgc)
Агар, содержащий дрожжевой экстракт и солодовый экстракт (ISP)
Рост – хороший, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – горчичный (2lе)
Воздушный мицелий – обильный, жемчужно-серый (13сb)
Растворимый пигмент – оливково-желтый (1lе)
Питательный агар
Рост – умеренный, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – оттенок “золотой самородок” (2nс)
Воздушный мицелий – умеренный, пепельный (5fe)
Растворимый пигмент – не продуцируется
Агар, содержащий пептон, дрожжевой экстракт и железо (ISP)
Рост – умеренный, оттенок тускло-золотистый (2ng)
Реверсия – светло-горчичный, желтовато-коричневый (2ie)
Воздушный мицелий – скудный, белый (а)
Растворимый пигмент – не продуцируется
Глюкозно-нитратный агар (ISP)
Рост – умеренный, оттенок светло-горчичный, желтовато-коричневый (2ie)
Реверсия – горчичный (2le)
Воздушный мицелий – умеренный, белый (а)
Растворимый пигмент – золотистый (1 1/21c)
Агар, содержащий глицерин и кальциевую соль яблочной кислоты
Рост – умеренный, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – светло-пшеничный – оттенок “бамбук” (2еа-2gс)
Воздушный мицелий – обильный, жемчужный (3bа)
Растворимый пигмент – лимонного цвета (lgс)
Агар, содержащий глюкозу и пептон
Рост – умеренный, оттенок “бамбук” (2gс)
Реверсия – светло-пшеничный – золотисто-желтый (2ea-2kb)
Воздушный мицелий – скудный, белый (а)
Растворимый пигмент – не продуцируется
Физиологические свойства
(1) Меланиновый пигмент
(а) Агар, одержащий тирозин, – отсутствует
(b) Агар, содержащий пептон, дрожжевой экстракт и железо, – отсутствует
(c) Среда, содержащая глюкозу, пептон и желатину, – отсутствует
(d) Бульон, содержащий триптон и дрожжевой экстракт, – отсутствует
(2) Тирозиназная реакция – отрицательная
(3) Продуцирование сероводорода – отсутствует
(4) Восстановление нитратов – положительно
(5) Разжижение желатины (21-23^oС) (желатиновая среда, содержащая глюкозу и пептон) – отсутствует
(6) Гидролиз крахмала – положительно
(7) Коагуляция снятого молока (37^oС) – отрицательно
(8) Пептонизация снятого молока (37^oС) – положительно
(9) Температура роста – 9-37^oС
(10) Утилизация источников углерода (среда Придхэма и Готтлиба). Утилизирует: глюкозу, арабинозу, ксилозу, мелибиозу, маннит, рамнозу, фруктозу и инозит. Незначительно утилизирует: рафинозу и сахарозу.

(11) Разложение целлюлозы – отрицательно
Состав клеточных стенок
Диаминопимелиновая кислота клеточных стенок относится к LL-типу.

Таксономические свойства штамма, являющегося предметом настоящего изобретения, можно суммировать следующим образом.

Диаминопимелиновая кислота клеточных стенок относится к LL-типу. Вегетативный мицелий хорошо растет на различных агаровых средах, фрагментация не наблюдается. Форма воздушного мицелия является спиральной с длинной цепочкой спор. Поверхность споры покрыта шипиками. Различные свойства культуры проявляются в коричневатых оттенках окраски вегетативного мицелия и от белого до серого оттенка окраски воздушного мицелия. Образования растворимого пигмента представляют собой зеленовато-желтый пигмент на агаровой среде, содержащей дрожжевой и солодовый экстракты, на агаровой среде, содержащей овсяную муку, на агаровой среде, содержащей глюкозу и аспарагин, на агаровой среде, содержащей глицерин и аспарагин, на агаровой среде, содержащей глюкозу и нитрат, на агаровой среде, содержащей глицерин и малеат кальция.

Согласно результатам этих наблюдений, штамм, являющийся предметом настоящего изобретения, был идентифицирован как штамм, принадлежащий к роду Streptomyces, и был отнесен к Streptomyces sp. WK-5344.

Указанный штамм был депонирован в международном депозитарии International Patent Organism Depositary в Национальном институте National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, расположенном по адресу AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan, под наименованием FERM BP-6668 1 марта 1999 года.

Несмотря на то, что микробный штамм, продуцирующий соединение WK-5344, был указан в качестве предпочтительного штамма настоящего изобретения, таксономические свойства очень легко видоизменяются вследствие того, что основные свойства микроорганизмов не являются стабильными. Он, как хорошо известно, способен к мутации как вследствие природных видоизменений, так и к мутации, обычно происходящей при искусственных воздействиях, таких как ультрафиолетовое излучение, радиоактивное излучение, или при воздействии мутагенных агентов, таких как N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин и этилметансульфонат. Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы штаммы, обладающие способностью продуцировать соединение WK-5344 и принадлежащие к роду Streptomyces, включая искусственные и природные мутанты. Штаммы, видоизмененные методами клеточной инженерии, такими как слияние клеток и генная инженерия, также включены в штамм, продуцирующий соединение WK-5344.

При продуцировании соединения WK-5344A и соединения WK-5344B, которые являются предметом настоящего изобретения, микроорганизм, продуцирующий соединение WK-5344 и относящийся к роду Streptomyces, выращивается на предпочтительной среде. При культивировании указанного микроорганизма обычно используют метод культивирования для обычных микроорганизмов. Примерами среды служат такие питательные среды, которые содержат усвояемые микроорганизмами источники углерода, легко усваиваемые микроорганизмами источники азота и, если необходимо, добавки неорганических солей.

Примерами вышеуказанных усвояемых микроорганизмами источников углерода являются глюкоза, сахароза, меласса, крахмал, декстрин, целлюлоза, глицерин и органические кислоты, которые используются в отдельности или в сочетании. Примерами легко усваиваемых микроорганизмами источников азота являются органические источники азота, такие как пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, порошок соевых бобов, жидкий кукурузный экстракт, масло хлопковых семян, казеин, гидролизат соевого белка, аминокислоты и мочевина, а также неорганические источники азота, такие как нитрат и аммонийная соль, которые используются в отдельности или в сочетании.

Кроме того, если необходимо, добавляют неорганическую соль, такую как соль натрия, соль калия, соль кальция, соль магния и фосфат, а также соль тяжелого металла. В среду может быть добавлено незначительное количество азотсодержащего компонента, вещества, стимулирующего рост, или предшественника для стимулирования роста настоящего штамма и продуцирования соединения WK-5344A и соединения WK-5344B.

Культивирование может быть осуществлено в аэробных условиях, например при встряхивании культуры или при аэрационном перемешивании культуры. Значение рН среды, как правило, поддерживают таким, чтобы оно соответствовало нейтральным условиям. Для промышленного продуцирования предпочтительным является использование погружного аэратора. Культивирование можно осуществлять в интервале температуры 20-37^oС, как правило, при 24-30^oС, предпочтительно при 27^oС. Продолжительность культивирования, как правило, составляет 2-6 дней для жидкой культуры, чтобы аккумулировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, и культивирование может быть закончено, когда достигнут максимум продуцирования соединения WK-5344A и соединения WK-5344B.

Условия культивирования, такие как состав среды, температура культивирования, скорость перемешивания, объем аэрации, могут регулироваться и выбираться таким образом, чтобы получить наиболее предпочтительные условия в зависимости от используемого типа штамма и внешних условий. В случае жидкой культуры, если происходит вспенивание, могут быть использованы антивспенивающие средства, такие как силиконовое масло, растительное масло и поверхностно-активные агенты.

Поскольку соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, которые накапливаются в культивируемой массе, содержаться в культуральной жидкости или в культуральном мицелии, культивируемую массу отфильтровывают, используя фильтрующее средство, такое как Целит (Celite) или Хайфлосуперселл (Hyflosupercell), или центрифугируют для того, чтобы разделить культуральную жидкость и мицелий, которые экстрагируют органическим растворителем, после чего экстракты преимущественно концентрируют и выделяют соединение WK-5344A и соединение WK-5344B.

Выделение соединения WK-5344A и соединения WK-5344B из культуральной жидкости осуществляют экстрагированием культурального фильтрата несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, бутилацетат или бензол, и концентрированием экстракта в вакууме для того, чтобы получить соединение WK-5344A и соединение WK-5344B. Указанное неочищенное вещество может быть очищено известными методами, применяемыми для очистки липофильных соединений, например методом колоночной хроматографии с использованием носителя, такого как силикагель или оксид алюминия, для получения очищенного соединения WK-5344A и очищенного соединения WK-5344B.

Для того, чтобы выделить соединение WK-5344A и соединение WK-5344B из мицелия, мицелий экстрагируют водным смешивающимся с водой органическим растворителем, таким как водный метанол, концентрируют экстракт в вакууме, экстрагируют концентрат несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, бутилацетат или бензол, затем очищают экстракт с последующим объединением или без объединения с вышеуказанным экстрактом, полученным из культуральной жидкости, получая при этом соединение WK-5344A и соединение WK-5344B.

Физико-химические свойства соединения WK-5344A и соединения WK-5344B, которые являются предметом настоящего изобретения, приведены ниже.

Соединение WK-5344A
Молекулярная формула: С₄₅Н₃₀N₃O₁₃Fе [по данным FAB масс-спектроскопии высокого разрешения, бомбардировка быстрыми атомами (положительный заряд), m/z, (M+H), измерено: 877, 1203; вычислено: 877, 1206].

Молекулярный вес: 876 [m/z, 877 (M+H)⁺ и 899 (N+Na)⁺ по данным FAB масс-спектроскопии, бомбардировка быстрыми атомами (положительный заряд)].

Удельное вращение: []²⁵_D – 3000^o (с=0,01, метанол).

УФ-спектр: УФ-спектр, полученный в метаноле, приведен на фиг.1. Характеристические максимумы наблюдаются при 280, 305 (плечо), 440 и 690 нм.

ИК-спектр: ИК-спектр (таблетки с КВr) приведен на фиг.2. ^КВr_max/ , см^-1: 3400, 1728, 1701, 1597, 1493, 1385, 1284, 1207 и 1105.

Растворимость: соединение растворимо в метаноле, этаноле, ацетонитриле, этилацетате, хлороформе и диметилсульфоксиде. Нерастворимо в воде.

Характеристика вещества: нейтральное.

Окраска и внешний вид вещества: зеленоватый порошок.

Протонный ядерный магнитный резонанс (ПМР): фиг.3 (Varian-спектрометр, в дейтерированном метаноле, 400 МГц).

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) углеродных атомов: фиг.4 (Varian-спектрометр, в дейтерированном метаноле, 100 МГц).

Структура соединения WK-5344A, определенная путем анализа приведенных выше физико-химических характеристик и спектральных данных, является следующей:

Соединение WK-5344B
Молекулярная формула: C₄₆H₃₀N₃O₁₄Fe [по данным FAB масс-спектроскопии высокого разрешения, бомбардировка быстрыми атомами (положительный заряд), m/z, (M+H), измерено: 905, 1151; вычислено: 905, 1155].

Молекулярный вес: 904 [m/z, 905 (М+Н)⁺ по данным FAB масс-спектроскопии, бомбардировка быстрыми атомами, (положительный заряд)].

Удельное вращение: []²⁵_D -1000^o (с=0,01, метанол).

УФ-спектр: УФ-спектр, полученный в метаноле, приведен на фиг.5. Характеристические максимумы наблюдаются при 285, 303 (плечо), 445 и 698 нм.

ИК-спектр: ИК-спектр (таблетки с КВг) приведен на фиг.6. ^KBr_max, см^-1: 3400, 1718, 1701, 1597, 1508, 1385, 1281, 1196 и 1105.

Растворимость: соединение растворимо в метаноле, этаноле, ацетонитриле, этилацетате, хлороформе и диметилсульфоксиде. Нерастворимо в воде.

Характеристика вещества: нейтральное.

Окраска и внешний вид вещества: зеленоватый порошок.

Протонный ядерный магнитный резонанс (ПМР): фиг.7 (Varian-спектрометр, в дейтерированном метаноле, 400 МГц).

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) углеродных атомов: фиг.8 (Varian-спектрометр, в дейтерированном метаноле, 100 МГц).

Структура соединения WK-5344B, определенная путем анализа приведенных выше физико-химических характеристик и спектральных данных, является следующей:

Как описано выше, физико-химические характеристики соединения WK-5344A и соединения WK-5344B раскрыты детально, ни о каких соединениях, которые обладали такими же свойствами, ранее не сообщалось, вследствие чего установлено, что соединение WK-5344A и соединение WK-5344B являются новыми соединениями.

Биологические свойства и ингибирующая активность соединения WK-5344A и соединения WK-5344B, являющихся предметом настоящего изобретения, приведены ниже.

Ингибирующая активность в отношении белка человека, переносящего сложный эфир холестерина.

Воздействие на белок, переносящий сложные эфиры холестерина, определено с использованием неочищенного белка, полученного из плазмы человека, согласно методу, описанному Като и др. Journal of Biological Chemistry, 264, 4082-4087, 1989.

Смешивали реконструированный липопротеин высокой плотности (здесь и далее сокращенно HDL), содержащий 25 мкл [1-¹⁴C] сложного эфира холестерина, 10 мкл липопротеина низкой плотности человека (здесь и далее сокращенно LDL), 30 мкл 7 мМ 5,5-дитио-бис-нитробензойной кислоты и 5 мкл частично очищенного белка, переносящего сложный эфир холестерина. Суммарное количество реакционной смеси, составлявшее 150 мкл, подвергали взаимодействию при 37^oС в течение 30 минут.

После завершения реакции к реакционной смеси добавляют 5 мкл 0,1% декстрансульфата, 5 мкл 6 мМ MgCl₂ и 20 мкл фосфатного буфера, доведенного до ионной силы, равной 0,16, смесь помещают на лед на 20 минут. Полученную смесь центрифугируют при 4^oС со скоростью 13000 об/мин в течение 15 минут. Собирают выпавшую в осадок LDL-фракцию. LDL-фракцию растворяют в 180 мкл 0,1 н. NaOH и определяют в LDL количество перенесенного сложного эфира холестерина с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Согласно полученным результатам, 50% ингибирование активности белка, переносящего сложный эфир холестерина, составляет 0,54 мкг/мл для соединения WK-5344A и 2,0 мкг/мл для соединения WK-5344B.

Как описано выше, соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, которые являются предметом настоящего изобретения, проявляют значительную ингибирующую активность в отношении белка, переносящего сложный эфир холестерина, и, как полагают, являются полезными для профилактики лечения заболеваний, вызванных накоплением холестерина в организме человека.

На фиг. 1 приведен УФ-спектр соединения WK-5344A, являющегося предметом настоящего изобретения (в СН₃ОН).

На фиг. 2 приведен ИК-спектр соединения WK-5344A, являющегося предметом настоящего изобретения (таблетки с KBr).

На фиг.3 приведен спектр протонного ядерного магнитного резонанса соединения WK-5344A, являющегося предметом настоящего изобретения (CD₃OD).

На фиг.4 приведен спектр ядерного магнитного резонанса углеродных атомов соединения WK-5344A, являющегося предметом настоящего изобретения (CD₃OD).

На фиг. 5 приведен УФ-спектр соединения WK-5344B, являющегося предметом настоящего изобретения (в СН₃ОН).

На фиг. 6 приведен ИК-спектр соединения WK-5344B, являющегося предметом настоящего изобретения (таблетки с KBr).

На фиг.7 приведен спектр протонного ядерного магнитного резонанса соединения WK-5344B, являющегося предметом настоящего изобретения (CD₃OD).

На фиг.8 приведен спектр ядерного магнитного резонанса углеродных атомов соединения WK-5344B, являющегося предметом настоящего изобретения (СD₃OD).

Подробное описание выполнения изобретения
Приведенный ниже пример иллюстрирует настоящее изобретение, но не ограничивает его объем.

100 мл среды (доведенной до рН 7,0), содержащей 2,4% крахмала, 0,5% экстракта дрожжей, 0,1% глюкозы, 0,3% пептона, 0,3% мясного экстракта и 0,4% СаСО₃ в 500 мл колбе Эрленмейера, закупоренной хлопчатобумажным материалом, стерилизуют паром. После охлаждения платиновую петлю Streptomyces sp. WK-5344 FERM BP-6668, выращенного на агаровой среде, асептически высевают на указанную выше среду и при встряхивании культивируют при 27^oС в течение 72 часов, получая при этом семенную культуральную жидкость.

Стерилизуют паром среду (значение рН доведено до 6,5), содержащую 4,0% растворимого крахмала, 2,0% экстрагированной растворителем подсушенной соевой муки, 32 мкл/л 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, 0,05% FeSO₄7H₂O, 0,05% КН₂РO₄ и 0,03% KCl в 30-литровом встряхиваемом реакторе-ферментере. После охлаждения асептически инокулируют 200 мл семенной культуральной жидкости и культивируют при встряхивании со скоростью 20 об/мин и аэрировании 10 литров в минуту при 27^oС в течение 96 часов.

После завершения культивирования мицелий, полученный центрифугированием культуральной жидкости, экстрагируют 6 л ацетона. Экстракт концентрируют в вакууме для того, чтобы удалить ацетон, доводят значение рН до 5,0, экстрагируют 10 л этилацетата, концентрируют экстракт в вакууме, получая при этом 9,20 г неочищенного соединения. Неочищенное соединение распределяют между гексаном, метанолом и водой (40:19:1), собирают вещество WK-5344, которое распределилось в нижний слой, и концентрируют в вакууме, получая при этом 1,29 г неочищенного соединения. Неочищенное соединение суспендируют в 10 мл ацетонитрила, помещают на колонку с ODS (20 мл, Senshu Co., SSC-ODS-7515-12) и хроматографируют, элюируя ацетонитрилом, содержащим 0,05% фосфорной кислоты. Отбирают 12 мл фракцию элюата и собирают фракции, содержащие активный ингредиент. После удаления ацетонитрила фракцию – водный слой – экстрагируют этилацетатом и высушивают в вакууме, получая при этом 157 мг неочищенного активного вещества.

157 мг неочищенного активного вещества растворяют в 1,57 мл метанола, помещают на колонку с ODS (147 мл, Senshu Co., SSC-ODS-7515-12) и хроматографируют при ступенчатом элюировании ацетонитрилом, содержащим 0,05% фосфорной кислоты. Отбирают 12 мл фракцию элюата и собирают фракции, содержащие активный ингредиент. После удаления ацетонитрила фракцию – водный слой – экстрагируют этилацетатом и высушивают в вакууме, получая при этом 19,5 мг неочищенного активного вещества.

19,5 мг неочищенного активного вещества растворяют в 0,5 мл хлороформа, помещают на колонку с силикагелем (126 мл, Kiesel gel 60) и хроматографируют, элюируя хлороформом и метанолом. Каждую фракцию фракционируют с 12 мл. В результате выделяют 1,69 мг соединения WK-5344A и 1,12 мг соединения WK-5344B.

Эффект изобретения
Как описано выше, микроорганизм, относящийся к роду Streptomyces и обладающий способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B, выращивали в среде для аккумулирования соединения WK-5344A и соединения WK-5344B в культивируемой массе. Соединение WK-5344A и соединение WK-5344B выделяют из указанной культивируемой массы, получая при этом вещества, обладающие ингибирующим действием на белок, переносящий сложный эфир холестерина. Указанные соединения, как ожидается, оказывают профилактическое и терапевтическое действие в отношении заболеваний взрослых, таких как инфаркт миокарда и инсульт, вызываемых артериальным склерозом.

Формула изобретения

1. Соединение WK-5344A, представленное следующей формулой: (см. графическую часть)
или его соль.

2. Соединение WK-5344В, представленное следующей формулой: (см. графическую часть)
или его соль.

3. Способ получения соединения WK-5344A и соединения WK-5344В или их фармацевтически приемлемой соли, включающий культивирование микроорганизма, относящегося к штамму Streptomyces sp. WK-5344 FERM BP-6668, обладающего способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344B в среде, аккумулирование соединения WK-5344A и соединения WK-5344B в культуральной среде и выделение соединения WK-5344A и соединения WK-5344 из указанной культуральной среды, и, при необходимости, превращение указанных соединений в их фармацевтически приемлемые соли.

4. Штамм Streptomyces sp. WK-5344 FERM BP-6668, обладающий способностью продуцировать соединение WK-5344A и соединение WK-5344В.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.03.2007

Извещение опубликовано: 10.08.2010 БИ: 22/2010