Патент на изобретение №2201960
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ПОРОСЕНКА SUS SCROFA РК-15/А11, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
(57) Реферат: Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Штамм клеток РК-15/А11 получают путем клонирования линии клеток почки поросенка РК-15 методом предельных разведений и пассирования в среде Игла МЕМ с 5% фетальной сыворотки крови телят или новорожденных телят и дальнейшей трофической адаптацией в течение 5 пассажей к культивированию в среде Игла МЕМ с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ. Кариотип стабилен на протяжении 50 пассажей. Модальный класс представлен клетками, содержащими 31 хромосому (58%). Культура клеток РК-15/А11 чувствительна к различным штаммам вируса классической чумы свиней и является производственным штаммом для изготовления вакцины против классической чумы свиней. Изобретение позволяет получить штамм перевиваемых клеток почки поросенка, стабильный по биологическим характеристикам, в производстве вакцин против КЧС. 1 табл. Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов. Известна перевиваемая линия клеток почки поросенка РК-15, изолированная в 1957 году М. Harris из культуры клеток РК-2а почки взрослой свиньи Sus scrofa (АТСС, CCL 33) [1, 2]. Штамм перевиваемых клеток РК-15 из-за того, что его культивировали в лабораториях мира при нестандартных режимах и в различных по составу питательных средах, стал нестабильным по культуральным, морфологическим, цитогенетическим характеристикам и чувствительности к вирусу классической чумы свиней. Биотехнологическое использование линии клеток РК-15 лимитирует необходимость включения в состав ростовой среды фетальной сыворотки крови или сыворотки крови новорожденных телят, что неприемлемо по экономическим соображениям в биотехнологии производства вакцинных препаратов. Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток почки поросенка РК-15/А11, стабильного по биотехнологическим характеристикам, обеспечивающего высокий уровень репродукции вируса классической чумы свиней, пригодного для научно-исследовательской работы и производства вакцин против КЧС. Штамм клеток РК-15/А11 получен из перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15, клонированной методом предельных разведений в питательной среде Игла MEM, содержащей 20% фетальной сыворотки крови телят с отбором и селекцией высокочувствительного к вирусу классической чумы свиней и генетически однородного клона клеток, и дальнейшей трофической адаптацией клеток в течение 5 пассажей к культивированию в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем. Штамм РК-15/А11 характеризуется следующими признаками. Культуральные свойства. Жизненный цикл штамма, при котором сохраняются основные биологические показатели клеток, составляет 50  5 пассажей. При посевной дозе 80-110 тыс. клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 10-12 дней. В литровом матрасе накапливается 75-80 млн. клеток. Коэффициент пересева -1:3-1:5Штамм РК-15/А11 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000, в конечной концентрации 7-10% от объема сыворотки. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 3:1 при температуре 37oС. Для криоконсервирования при -196oС применяют смесь, состоящую из 85% среды Игла MEM, 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 8-12  106 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановой синью после хранения в жидком азоте составляет 80-90%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.
Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 300 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 11, 15, и 16 пассажах во ВНИИВВиМ (регистрационный 2.11).
Морфологические признаки. Культура клеток представлена мелкими эпителиоподобными клетками с умеренно зернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-2 ядрышками.
Кариологическая характеристика. Популяция гетероплоидная. Варьирование хромосомных наборов от 28 до 50. Модальный класс (58%) составляют клетки, содержащие 31 хромосому.
Гистохимическим методом азосочетания (с использованием в качестве субстрата  -нафтилацетата) установлена высокая активность неспецифических эстераз.
Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.
Прививаемость изогенным животным отсутствует.
Контроль штамма РК-15/А11 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма РК-15/А11 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.
Чувствительность к вирусам. Клетки штамма РК-15/А11 чувствительны к различным штаммам вируса классической чумы свиней (таблица)Штамм перевиваемых клеток РК-15/A11 предназначен для использования в производстве вакцинных препаратов против классической чумы свиней. Штамм перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa PK-15/A11 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под 54. Источники информации Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 20.06.2003
Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
