Патент на изобретение №2201959
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ПОРОСЕНКА SUS SCROFA PK-15/B5, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
(57) Реферат: Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Штамм клеток РК-15/В5 получают путем клонирования линии клеток почки поросенка РК-15 методом предельных разведений и пассирования в среде Игла МЕМ с 5% фетальной сыворотки крови телят или сыворотки крови новорожденных телят. Кариотип стабилен на протяжении 50 пассажей. Модальный класс представлен клетками, содержащими 31 хромосому (61%). Культура клеток РК-15/В5 чувствительна к различным штаммам вируса классической чумы свиней и является тест-системой, используемой в диагностике и титровании вируса КЧС. Изобретение позволяет получить штамм перевиваемых клеток почки поросенка РК-15/В5, стабильный по биологическим характеристикам, пригодный для научно-исследовательской и диагностической работы. 1 табл. Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов. Известна перевиваемая линия клеток почки поросенка РК-15, изолированная в 1957 году М. Harris из культуры клеток РК-2а почки взрослой свиньи Sus scrofa (АТСС, CCL 33) (1, 2). Штамм перевиваемых клеток РК-15 из-за того, что его культивировали в лабораториях мира при нестандартных режимах и в различных по составу питательных средах, стал нестабильным по культуральным, морфологическим, цитогенетическим характеристикам и чувствительности к вирусу классической чумы свиней. Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток почки поросенка РК-15/В5, стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для научно-исследовательской и диагностической работы, обладающего высокой чувствительностью к вирусу классической чумы свиней. Штамм клеток РК-15/В5 получен из перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15 клонированием методом предельных разведении в питательной среде Игла MEM, содержащей 20% фетальной сыворотки крови телят, с отбором и селекцией высокочувствительного к вирусу классической чумы свиней и генетически однородного клона. Штамм РК-15/В5 характеризуется следующими признаками. Культуральные свойства. Жизненный цикл штамма, при котором сохраняются основные биологические показатели, составляет 50  5 пассажей. При посевной дозе – 100-120 103 клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 10-12 дней. Коэффициент пересева – 1:2-1:3.
Штамм РК-15/В5 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови новорожденных телят. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 3:1 при температуре 37oС. Урожай клеток с литрового матраса составляет 50-55 млн. клеток.
Для криоконсервирования при температуре -196oС применяют смесь, состоящую из 70% среды Игла MEM, 20% сыворотки крови новорожденных телят и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 6-8106 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановой синью после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.
Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 250 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 5, 8, 11 и 18 пассажа во ВНИИВВиМ (регистрационный 2.10).
Морфологические признаки. Культура клеток представлена эпителиоподобными клетками средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.
Кариологическая характеристика. Популяция гипоплоидная. Варьирование хромосомных наборов от 27 до 33. Модальный класс (61%) составляют клетки, содержащие 31 хромосому. Маркерной хромосомой является большой метацентрик с разрывом.
Гистохимическим методом азосочетания (с использованием в качестве субстрата  -нафтилацетата) установлена высокая активность неспецифических эстераз.
Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.
Прививаемость изогенным животным отсутствует.
Контроль штамма PK-15/B5 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма РК-15/В5 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.
Чувствительность к вирусам. Клетки штамма РК-15/В5 чувствительны к различным штаммам вируса классической чумы свиней (см. таблицу).
Штамм перевиваемых клеток РК-15/В5 может быть использован в вирусологических исследованиях для наработки и изучения вируса классической чумы свиней, а также в диагностических целях.
Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa РК-15/В5 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под 55.
Список литературы
Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 20.06.2003
Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
