Патент на изобретение №2201766

(54) МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИЛИ БИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ МОЛЕКУЛА (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ УНИЧТОЖЕНИЯ ИЛИ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ В ОРГАНИЗМЕ СУБЪЕКТА, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СУБЪЕКТА, ИНФИЦИРОВАННОГО ПАТОГЕНОМ И СПОСОБ ВАКЦИНАЦИИ СУБЪЕКТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине. Сущность составляют мультиспецифические соединения, содержащие по меньшей мере одну связывающую детерминанту, которая связывает Fc-рецептор на эффекторной клетке. Другая связывающая детерминанта связывает один или более антигенов на клетке-мишени, например продукт протоонкогена Neu/Her-2, или рецептор эпидермального ростового фактора на раковых клетках, или антигены Candida на инфицированных клетках. Примерами являются биспецифические и триспецифические антитела. Предложено терапевтическое и профилактическое применение указанных соединений. Технический результат – множественная специфичность препарата для лечения рака и патогенных инфекций. 5 с. и 14 з.п.ф-лы, 28 ил.

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к иммунологии, в частности к терапевтическим соединениям с множественной специфичностью (мультиспецифическим соединениям), в частности, содержащим антитела к Fc-рецептору, которые могут быть использованы для лечения рака или патогенных инфекций.

Уровень техники
Рецепторы Fc-фрагментов иммуноглобулинов являются важными при запуске многих защитных функций моноцитов, макрофагов и полиморфонуклеарных клеток. Были широко исследованы IgG-рецепторы (Fc-рецепторы или FcR) на данных клетках и были сконструированы биспецифические молекулы, направленные на данные рецепторы (см., например, Европейский патент No 0255249 под названием “Моноклональные антитела к Fc-рецептору иммуноглобулина G на человеческих мононуклеарных фагоцитах”, совладельцами которого являются Заявители). Кроме того, клинические свойства биспецифических молекул (BsAb), которые обладают специфичностью в отношении FcR и антигена HER-2/neu, которые обнаружены на клетках рака молочной железы или яичников, указывают на то, что данные молекулы являются как безопасными, так и эффективными (см. статью Valone Frank H. и соавт., 1995, J. of Clin. Oncol., 13(9):2281-2292).

Рс-рецепторы IgA-рецепторов (FcR или CD89) способны также стимулировать функции эффекторных клеток. Связывание лиганда с Fс-рецепторами запускает фагоцитоз и обусловленную антителами цитотоксичность клеток у лейкоцитов и FcR-несущих клеточных линий. Fc-рецепторы могут также действовать совместно с IgG-рецепторами на эффекторных клетках для усиления фагоцитоза клеток-мишеней. Получены моноклональные антитела классов IgM (см. статью Shen L. и соавт., 1989, J. Immunol., 143:4117) и IgG (см. статью Monteiro R. C. и соавт.,1992, J. Immunol., 148:1764) против FcR.

IgA имеется в большом количестве в организме человека (см. статью Кеrr М.А., 1990, Biochem. J., 271:285-296). Был идентифицирован и охарактеризован единственный класс Fc-рецепторов IgA, FcRI или CD89, который связывает мономерный IgA (см. статьи Albrechtsen M. и соавт., 1988, J. Immunol., 64:201; Monteiro R. C. и соавт., 1990, J. Exp. Med., 171:597). FcRI первично конститутивно экспрессируется в цитотоксических иммунных эффекторных клетках, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы (см. статью Morton H.C. и соавт., 1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423). Описана экспрессия FcRI на субпопуляции лимфоцитов (см. статью Morton H.C. и соавт.,1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423) и на гломерулярных мезангиальных клетках (см. статью Gomez-Guerrero С. и соавт., 1996, J. Immunol., 156: 4369-4376). Его экспрессия на моноцитах и PMN (полиморфонуклеарный лейкоцит) может быть усилена с помощью TNF- (фактор некроза опухоли-) (см. статьи Gesl А. и соавт. , 1994, Scad. J. Immunol., 39:151-156; Hostoffer R.W. и соавт. , 1994, The J. Infectious Diseases, 170:82-87), IL-1 (интерлейкин-1), GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), LPS (липополисахариды) или форболовых сложных эфиров (см. статью Shen L. и соавт. , J. Immunol., 152:4080-4086; Schiller С.А. и соавт., 1994, Immunology, 81: 598-604), тогда как IFN- (интерферон-) и TGF-1 (Т-клеточный ростовой фактор-1) снижают экспрессию FcRI (см. статью Reterink T.J.H. и соавт., 1996, Clin. Exp. Immunol., 103:161-166). Альфа-цепь человеческого FcRI является сильно гликозилированной трансмембранной молекулой первого типа, которая принадлежит к семейству супергена Ig, который включает также рецепторы IgG и IgE. Один ген, расположенный на хромосоме 19, кодирует несколько образованных альтернативным сплайсингом изоформ -цепи FcRI (мол. масса 55-110 кД; см. статью Morton H.C. и соавт., 1996, Critical Reviews in Immunology, 16: 423). Было показано, что FcRI миелоцитов ассоциирован с -цепью FcR, которая, как считают, участвует в сигнальной трансдукции FcRI (см. статьи Morton H.C. и соавт., 1995, J. Biol. Chem., 270:29781; Pfefferkorn L. C. и соавт., 1995, J. Immunol., 153:3228-3236; Saito К. и соавт., 1995, J. Allergy Clin. Immunol., 96:1152).

FcRI связывает IgА1 и IgA2 как в комплексе с антигеном, так и в мономерной форме (см. статьи Mazangera R.L и соавт., 1990, Biochem. J., 272:159-165), что согласуется с тем, что рецептор in vivo насыщен мономерным IgA таким же образом, как FcR и FcRI насыщены IgG и IgE соответственно. Перекрестное сшивание FcRI на миелоидных эффекторных клетках полимерным IgA, иммунными комплексами IgA или mAb (моноклональными антителами), специфическими в отношении эпитопов внутри или вне лигандсвязывающего домена, стимулирует дегрануляцию, высвобождение супероксида, секрецию воспалительных цитокинов, эндоцитоз и фагоцитоз (см. статьи Patty С., A.Herbelin, A. Lihuen, J. F. Bach и R.C.Monteiro, 1995, Immunology, 86:1-5; Stewart W.W., R.L. MazYegera, L. Shen и M.A.Kerr, 1994, J. Leucocyte Biology, 56:481-487; Stewart W.W. и М.А. Kerr, 1990, Immunology, 71:328-334; Shen L., 1992, J. Leucocyte Biology, 51: 373-378). Данные физиологические ответы, запускаемые с помощью FcRI, могут быть важными в первой линии гуморальной защиты на поверхностях слизистых оболочек (см. статью Моrton Н.С., М. van Egmond и J.G. J. van de Winkel, 1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423).

Таким образом, FcRI является клинически приемлемым запускающим рецептором на цитотоксических иммунных эффекторных клетках, и его активность может быть использована для разработки новых иммунотерапевтических средств. Цитотоксический потенциал FcRI не был тщательно исследован, поскольку почти все способы терапии на основе моноклональных антител (mAb) разрабатываются с использованием mAb класса IgG, которые не связывают FcRI.

Сущность изобретения
Данное изобретение относится к мультиспецифическим терапевтическим молекулам, содержащим детерминанты связывания для рецепторов иммуноглобулина A (IgA). IgA является антителом класса, преобладающего в жидкостях и на поверхностях слизистых оболочек, а IgA- рецепторы (Fc-рецепторы, FcR или FcRI) обнаружены на белых кровяных клетках, включая макрофаги, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и лимфоциты. Биспецифические и мультиспецифические молекулы, соответствующие изобретению, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов для запуска активностей цитолиза и фагоцитоза данных белых кровяных клеток, усиления “атаки” данных клеток на раковые клетки, клетки инфекционных микроорганизмов и клетки, инфицированные патогенами.

В одном аспекте изобретение включает биспецифические связывающие молекулы, содержащие первую связывающую детерминанту, которая связывает Fc-рецептор, и вторую связывающую детерминанту, которая связывает один или более антигенов-мишеней. Предпочтительно, когда первая детерминанта связывает сайт на FcR, который отличен от сайта связывания эндогенного IgА таким образом, что связывание молекул, соответствующих изобретению, не блокируется или не блокируется в значительной мере IgА. В предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень, связанный второй детерминантой связывания биспецифических молекул, соответствующих изобретению, является антигеном раковых клеток. В более предпочтительном варианте осуществления антиген раковых клеток представлен антигеном рака молочной железы, яичников, семенников, легкого, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови или лимфатической системы. В другом предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень является антигеном инфекционной болезни из патогена или инфицированной патогеном клетки. В еще одном варианте осуществления изобретение касается лечения аутоиммунного заболевания с помощью композиции, которая связывает и модулирует рецептор для IgА, вызывая такую модуляцию рецептора, которая снижает дальнейшее связывание IgА с данным рецептором. В другом варианте осуществления изобретение представляет композиции, которые связывают и не модулируют рецептор для IgА таким образом, что эффекторные клетки субъекта “вооружаются” биспецифическими и мультиспецифическими молекулами и могут связывать антиген патогена или рака.

Предпочтительный вариант осуществления биспецифических молекул, соответствующих данному изобретению, представлен молекулами с детерминантами связывания для рецептора из семейства рецепторов, подобных человеческому EGF (эпидермальный фактор роста), канцероэмбрионального антигена, антигена рецептора гастрин-высвобождающего пептида и муцинового антигена, сверхэкспрессия которых происходит в ряде опухолевых клеток.

Биспецифические молекулы, соответствующие изобретению, охватывают молекулы, которые частично содержатся в связывающих детерминантах антител, и молекулы, соответствующие изобретению, включают молекулы, сконструированные таким образом, что они включают по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела. Биспецифические связывающие молекулы, соответствующие изобретению, предпочтительно содержат детерминанту связывания из антитела IgG или фрагмента IgG, включая Fab, Fab’, F(аb’)₂, Fv и Fv из одной цепи. Детерминанта связывания, включая Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv и Fv из одной цепи, может быть получена также из антитела IgA или антитела другого изотипа. Предпочтительная биспецифическая связывающая молекула, соответствующая изобретению, содержит первую детерминанту связывания, которая является по меньшей мере функциональным фрагментом антитела А77, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген раковой клетки, антиген патогена или антиген инфицированной клетки. Другие предпочтительные биспецифические связывающие молекулы, соответствующие изобретению, содержат первую детерминанту связывания, которая является по меньшей мере функциональным фрагментом антител A3, А59 или А62, которые близки к А77 по аффинности к рецептору IgА, и не блокируются IgА субъекта. Изобретение включает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие участки V_H и V_к антитела А77, а также предсказанные последовательности аминокислот данных участков. Данные последовательности предпочтительно используют для гуманизации связывающих детерминант А77 в терапевтических мультиспецифических молекулах. Предпочтительно, когда вторая детерминанта связывания молекул, соответствующих изобретению, является по меньшей мере функциональным фрагментом антитела 520С9, антитела Н425 или антитела СС49. Предпочтительный вариант осуществления представляет одну детерминанту связывания для FcR и одну для антигена HER/neu, обнаруженного, например, на опухолях молочной железы, яичников и легкого.

Изобретение охватывает ряд способов получения биспецифических связывающих молекул, включая присоединение связывающих детерминант химическими методами и с помощью рекомбинантных генетических методов. Изобретением охватываются рекомбинантные биспецифические молекулы, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, которые несут гены, кодирующие детерминанты связывания, которые таким образом являются генетически присоединенными. Далее, соответствующие изобретению биспецифические связывающие молекулы получают слиянием клеток двух продуцирующих антитела клеточных линий, несущих соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют детерминанты связывания, например, гибридомных клеточных линий с целью получения потомства клеточной линии, продуцирующего биспецифическую молекулу, соответствующую изобретению.

Кроме биспецифических связывающих молекул, данное изобретение охватывает мультиспецифические связывающие молекулы, которые содержат по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает FC-рецептор, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген-мишень, а также по меньшей мере одну третью детерминанту связывания. Связывание первой детерминанты данных мультиспецифических связывающих молекул с FcR не блокируется или не ингибируется человеческим иммуноглобулином А, вследствие чего существует незначительная или совсем не существует конкуренции за связывание эндогенными молекулами IgА. Мультиспецифические связывающие молекулы охватывают биспецифические и триспецифические композиции и композиции с четырьмя или более местами связывания. Предпочтительный вариант осуществления триспецифической связывающий молекулы несет дополнительную детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор, не являющийся Fc-рецептором, включая, например, детерминанту связывания для CD2, CD3, Fc-рецептор, Fс-рецептор, Fc-рецептор и/или Fc-рецептор. При этом данные детерминанты являются дополнением к первой детерминанте связывания для Fc-рецептора. Наиболее предпочтительным вариантом осуществления дополнительной детерминанты связывания для FcR является детерминанта для Fc-рецептора. Для мультиспецифической связывающей молекулы, соответствующей изобретению, несущей детерминанту связывания для Fc-рецептора, связывание FcR не ингибируется человеческим IgG, поскольку молекула связывает Fс по другому сайту эпитопа связывания FcR из IgG. Путем инкорпорации в одну молекулу по меньшей мере связывающей детерминанты для каждого из FcR и FcR увеличивают терапевтическую активность молекулы для повышения аффинности и кинетики связывания белых кровяных клеток с опухолевыми клетками или клетками патогенных организмов, или инфицированными патогенами клетками, повышая возможность цитолиза и фагоцитоза данных мишеней.

Другой предпочтительный вариантосуществления мультиспецифических связывающих молекул с детерминантoм для Fc представлен молекулой, которая несет третью детерминанту связывания, которая связывает второй антиген-мишень или второй эпитоп-мишень на раковой клетке, патогене или инфицированной патогеном клетке. Предпочтительным способом получения данных молекул является химическое присоединение детерминант связывания, однако, изобретение охватывает также полученные рекомбинантным путем мультиспецифические связывающие молекулы или молекулы, которые получены слиянием клеток двух или более клеточных линий, каждая из которых несет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие связывающие детерминанты. Предпочтительно, когда по меньшей мере одна детерминанта связывания является антителом или фрагментом антитела и когда для упрочения успешного результата при продолжительном лечении человека детерминанта связывания является гуманизированным антителом, которое конструируют так, чтобы свести к минимуму число чужеродных эпитопов на молекуле.

Предпочтительный вариант осуществления мультиспецифических связывающих молекул, соответствующих данному изобретению, содержит одну или более детерминант связывания для антигенов раковых клеток-мишеней, в частности антигенов клеток рака молочной железы, яичников, семенников, легкого, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови и лимфатической системы. Другой предпочтительный вариант осуществления изобретенных мультиспецифических связывающих молекул содержит в качестве антигена-мишени антигены инфекционной болезни из патогенов или инфицированных патогенами клеток. В одном варианте осуществления антигены-мишени являются антигенами инфекционной болезни и антигенами, экспрессирующимися на инфицированных клетках, например антигенами инфекций, вызываемых бактериями, грибами, простейшими и вирусами. В более предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень является антигеном из патогенного гриба, включая антиген из патогенных дрожжей. В наиболее предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень является антигеном из видов Candida, например Candida albicans.

Подходящими мишенями среди антигенов раковых клеток предпочтительно являются члены семейства EGF-подобных рецепторов человека, более предпочтительно антиген раковых клеток представлен EGF-рецептором и наиболее предпочтительно антиген раковых клеток является HER-2/neu, HER-3, HER-4 или гетеромультимерным рецептором, содержащим по меньшей мере одну субъединицу HER. Дополнительные предпочтительные антигены раковых клеток включают канцероэмбриональный антиген, антиген рецептора гастрин-высвобождающего пептида и TAG 72.

Наиболее предпочтительная мультиспецифическая связывающая молекула содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, представленную по меньшей мере функциональным фрагментом антитела А77, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген раковой клетки, клетки патогенного организма или инфицированной патогеном клетки. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифических связывающих молекул на основе А77 с детерминантой связывания ракового антигена предпочтительной второй детерминантой связывания является по меньшей мере функциональный фрагмент антитела 520С9 или антитела СС49. Первая детерминанта связывания для Fc-рецептора предпочтительно связывает рецептор на белой кровяной клетке. Типы белых кровяных клеток, которые связывают молекулы, предпочтительно представлены макрофагами, моноцитами, нейтрофилами, эозинофилами и лимфоцитами.

Еще один аспект изобретения содержит мультиспецифические связывающие молекулы, в которых молекула содержит по меньшей мере один антиген из патогена или инфицированной патогеном клетки или антиген из раковой клетки. Молекулы данного варианта осуществления могут служить для доставки данных антигенов в качестве вакцины прямо к клеткам иммунной системы, представляющим собой антиген, для иммунизации реципиента против инфекционного заболевания или рака. Для иммунизации пациента данные антигены могут быть выделены из последовательностей антигенных белков бактерий, вирусов, грибов и простейших, а также из клеток, инфицированных данным патогеном, или из раковой клетки.

Мультиспецифические связывающие молекулы, соответствующие изобретению, содержат детерминанты связывания из молекул антител или фрагментов антител, которые предпочтительно представлены IgG или фрагментами IgG. Фрагменты антитела предпочтительно представлены Fab, Fab’, F(аb’)₂, F(аb’)₃, Fv или Fv из одной цепи в качестве источников детерминант связывания для конструирования мультиспецифических связывающих молекул. Фрагменты антител могут быть получены из класса антител изотипа IgG, например из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело IgG, или из препарата поликлонального IgG. В предпочтительном варианте осуществления препарат поликлонального IgG получают из животного, которое иммунизировано антигеном из патогенного организма, более предпочтительно из патогенного гриба.

Другой признак мультиспецифических связывающих молекул, в которых первая детерминанта связывания связывает FcR, а вторая детерминанта связывания связывает антиген клетки-мишени, охватывает третью детерминанту связывания, которая связывает другой антиген на той же клетке-мишени, которую связывает вторая детерминанта связывания. Далее, варианты осуществления охватывают третье место связывания, которое связывает другой эпитоп на том же антигене, что связывает вторая детерминанта связывания. Данные детерминанты обеспечивают увеличение вдвое способности связывания мультиспецифической молекулы с мишенью при ее присоединении к иммунной эффекторной клетке для цитолиза или фагоцитоза.

Изобретение представляет также способ уничтожения клетки-мишени или уменьшения количества клеток-мишеней в организме субъекта, который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективной дозы мультиспецифической молекулы, которая представляет собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, связывающую Fc-рецептор и не блокируемую IgA, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген на клетке-мишени, в фармацевтически приемлемом носителе. Для человека детерминанты связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения. Другой вариант осуществления способа уничтожения клетки-мишени у субъекта включает дополнительное лечение субъекта агентом, который повышает число или активность Fc-рецепторов, например лечение субъекта цитокином. Предпочтительные цитокины для введения при лечении соответствующей изобретению композицией включают по меньшей мере один из G-CSF, GM-CSF, IFN- и TNF, представлены также способы, предусматривающие лечение молекулами, соответствующими данному изобретению, и более чем одним дополнительным терапевтическим агентом.

В другом варианте осуществления эффекторные клетки субъекта могут быть “вооружены” против антигена введением субъекту терапевтически эффективной дозы мультиспецифической связывающей молекулы, которая содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор, и вторую детерминанту связывания, которая связываетантиген, в фармацевтически приемлемом носителе. Таким образом вооруженные мультиспецифической молекулой эффекторные клетки не модулируют или не регулируют по типу обратной связи Fс-рецепторы на своей поверхности и способны связывать антиген-мишень. Для человека детерминанты связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ удаления клетки-мишени у субъекта, предусматривающий получение аликвот образца крови или клеток крови данного субъекта, обработку данной крови или клеток крови ex vivo терапевтически эффективной дозой мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор, и вторую детерминанту связывания, которая связывает один или более антигенов-мишеней, и введение указанных обработанных крови или клеток крови обратно субъекту. Предпочтительно, когда клетки из образца крови выделяют и размножают в культуре, и более предпочтительно, когда клетки из образца крови обрабатывают агентами, которые повышают число или активность Fc-рецепторов. Для человека детерминанты связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения.

В одном из аспектов изобретение представляет способ лечения субъекта с инфекционным заболеванием, который предусматривает введение пациенту в фармацевтически приемлемом носителе терапевтически эффективной дозы мультиспецифической связывающей молекулы, в которой первая детерминанта связывания связывает Fс-рецептор, а вторая детерминанта связывания связывает антиген-мишень из патогена или инфицированной патогеном клетки, повышая способность иммунной системы бороться с инфекцией.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет способ иммунизации субъекта против ракового антигена или антигена, находящегося на патогене или клетке, инфицированной патогеном, который предусматривает введение в фармацевтически приемлемом носителе композиции мультиспецифического (с множественной специфичностью) связывающего агента, несущего один или более антигенов патогенного инфекционного организма или антиген инфицированных клеток, или раковой клетки. Предпочтительный вариант инфекционного организма представлен патогенным грибом, включая патогенные дрожжи; более предпочтительным вариантом являются виды Candida. Для человека места (детерминанты) связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения.

Изобретение предлагает также способ идентификации агента, который модулирует Fc-рецепторы на поверхности клеток, включающий контактирование образца клеток, несущих Fc-рецепторы, с агентом. Способ идентификации агента, который модулирует Fc-рецепторы на поверхности клеток, предусматривает контактирование образца клеток, несущих Рс-рецепторы, с агентом, и определение активности Fс-рецептора в образце с агентом и в контрольном образце с антителом, которое модулирует Fc-рецепторы, таким как антитело А77, а также в еще одном контрольном образце, содержащем клетки, не контактировавшие с данным агентом или антителом; затем сравнивают активность Fc-рецептора в образцах. Таким образом, если образец клеток, который контактировал с агентом, имеет статистически значимое уменьшение активности Fc-рецептора по сравнению с контрольными, клетки, которые не контактировали с агентом, или имеет статистически значимую настолько же низкую, как у клеток в образце с антителом, активность Fc-рецептора, то это позволяет идентифицировать агент, который модулирует Fc-рецепторы на поверхности клеток.

В другом варианте осуществления изобретение представляет способ конструирования агента, который модулирует Fс-рецепторы для лечения аутоиммунного заболевания, путем получения трехмерной модели сайта связывания А77 против Fc-рецептора с использованием последовательностей детерминант вариабельных участков тяжелой и легкой цепей А77. Данный способ включает сравнение остатков аминокислот вариабельного участка А77 с остатками вариабельных участков тяжелой и легкой цепей антител известной трехмерной структуры, определение положения негомологичных остатков аминокислот в основной пептидной цепи участка связывания сайтов V_Н и V_к для того, чтобы определить размер, форму и заряд сайта связывания А77 к Fc-рецептору; скрининг библиотеки молекул для получения путем компьютерного моделирования молекул подходящего размера, формы и заряда, которые имитируют сайт связывания А77, и скрининг данных кандидатов соответствующего размера, формы и заряда на активность потенциальных модуляторов Fс-рецепторов с целью создания агента, который модулирует Fc-рецепторы.

Перечень чертежей
На Фигуре 1 представлен профиль элюции препарата биспецифической молекулы А77Х520С9 с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), в котором пик при 9,86 мин (~150 кД) представляет гетерокомплекс F(аb’)₃, содержащий одну молекулу F(ab’) A77 и две молекулы F(ab’) 520C9, а пик при 10,43 мин представляет гетерокомплекс F(ab’)₂, содержащий по одной молекуле F(ab’) A77 и 520C9; гель-фильтрационную ВЭЖХ проводили с использованием колонки TSK-3000.

На Фигуре 2 представлен график, показывающий в виде функции концентрации (в мкг/мл) степень связывания А77Х520С9 (биспецифического антитела анти-FcR Х анти-НЕR-2/neu (BsAb)) с нейтрофилами (PMN, белые квадраты) и моноцитами (черные квадраты), где средняя интенсивность флуоресценции, проанализированная с помощью FACScan, является количественным значением связывания.

На Фигуре 3 представлены результаты цитометрического анализа, показывающие степень связывания А77Х520С9, BsAb анти-FсR Х анти-HER-2/neu (в конечной концентрации 10 мкг/мл) с эффекторными клетками в гепаринизированной цельной крови после инкубирования в течение одного часа при 0^oС; был добавлен фикоэритрин – противомышиный IgG, эритроциты были лизированы и образцы анализировали с помощью FACScan; данные показывают значительное связывание с моноцитами (средняя панель) и нейтрофилами (нижняя панель) при отсутствии связывания с лимфоцитами (верхняя панель).

На Фигуре 4 представлен график, показывающий в виде функции концентрации BsAb (в мкг/мл) связывание А77Х520С9, BsAb анти-FcR Х анти-HER-2/neu (ромбы) и связывания другого BsAb MDX210, также несущего детерминанту для HER-2/neu (белые квадраты), с клетками опухоли молочной железы SKBR-3-мишени, где средняя интенсивность флуоресценции, проанализированная с помощью FACScan, является количественным значением связывания.

На Фигуре 5 представлено связывание с клетками опухоли молочной железы SKBR-3-мишени препарата А77Х520С9, BsAb анти-FcR Х анти-HER-2/neu, в виде функции концентрации (в мкг/мл); клетки SKBR-3 инкубировали с различными концентрациями А77Х520С9 (кружки), F(аb’)₃ А77 (треугольники) или F(аb’)₂ 520С9 (квадраты) на льду, клетки промывали, окрашивали противомышиным IgG, конъюгированным с изотиоцианидом флуоресцеина (FITC), и анализировали с помощью FACScan.

На Фигуре 6 представлен график, показывающий связывание BsAb А77ХН425 с клетками-мишенями А431 со сверхэкспрессией EGF-R, где средняя интенсивность флуоресценции, проанализированная с помощью FACScan, является количественным значением связывания; клетки инкубировали с различными концентрациями А77ХН425 (кружки), F(аb’)₂ A77 (треугольники) или F(аb’)₂ Н425 (квадраты); клетки инкубировали, как указано, на льду; клетки промывали, окрашивали античеловеческим IgG, конъюгированным с FITC и анализировали с помощью FACScan.

На Фигуре 7 представлен график, показывающий в виде функции концентрации BsAb (в мкг/мл) обусловленную BsAb A77X520C9 антитело-зависимую цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней опухоли молочной железы SKBR-3 эффекторными нейтрофилами при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 200 к 1 в двух различных препаратах BsAb.

На Фигуре 8 представлен график, показывающий в виде функции концентрации BsAb (в мкг/мл) обусловленную BsAb A77X520C9 антитело-зависимую цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней опухоли молочной железы SKBR-3 эффекторными клетками в цельной крови, при использовании независимых дубликатов препаратов BsAb.

На Фигуре 9 представлен график в виде столбиков, показывающий ингибирование с помощью F(аb’)₂ A77 против FcR обусловленного BsAb A77X520C9 киллинга (цитолиза) клеток опухоли молочной железы моноцитами в сравнении с отсутствием ингибирования при добавлении F(ab’)₂ M22 против FcR.

На Фигуре 10 представлен график, показывающий обусловленную BsAb А77Х520С9 цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней SKBR-3 эффекторными клетками PMN, очищенными из цельной крови; в клетки-мишени SKBR-3 вводили метку 100 мкКи ⁵¹Сr за 1 час до смешивания с PMN и другим препаратом BsAb, обозначенным здесь как BSM (кружки); и данную смесь клеток-мишеней, PMN и BsAb в присутствии 50 мкг/мл F(ab’)₂ А77 (квадраты); и данную смесь в присутствии F(аb’)₂ M22 (треугольники), каждая из которых находится в планшете для микротитрования с U-образным дном; смеси клеток и антител инкубировали в течение 16 час при 37^oС, супернатанты собирали и анализировали на радиоактивность и вычисляли цитотоксичность по формуле: % лизиса = (экспериментальное СРМ (число импульсов/мин) – СРМ-утечки мишени/СРМ лизиса детергентами – СРМ утечки мишени) х 100%. BsAb-зависимый лизис = % лизиса с помощью BsAb – % лизиса без BsAb при соотношении эффектор : мишень 200:1; границы ошибки представляют стандартное отклонение от среднего, полученного из значений трех повторов эксперимента.

На Фигуре 11 представлен график, показывающий обусловленную BsAb А77Х520С9 цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней SKBR-3 моноцитами, очищенными из Leukopaks^{, которые используют в качестве эффекторных клеток, при соотношении эффектор : мишень 100 : 1; другие условия и обозначения те же, что в описании Фигуры 10.}

На Фигуре 12 представлен график, показывающий обусловленную BsAb А77Х520С9 цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней SKBR-3 эффекторными клетками в цельной крови, другие условия и обозначения те же, что в описании Фигуры 10.

На Фигуре 13 представлен график, показывающий цитотоксичность для клеток-мишеней А431 со сверхэкспрессией EGF-R, обусловленную BsAb А77ХН425 (обозначенными как BSM, кружки) и эффекторными клетками PMN, очищенными из цельной крови; клетки инкубировали также с BsAb в присутствии 50 мкг/мл F(ab’)₂ A77 (квадраты) или F(ab’)₂ M22 (треугольники); в клетки-мишени вводили метку 100 мкКи ⁵¹Сr в течение 1 час и определяли цитотоксичность согласно краткому описанию Фигуры 10.

На Фигуре 14 представлен график, показывающий обусловленный BsAb А77ХН425 лизис клеток-мишеней А431 моноцитами, очищенными из цельной крови с помощью Leukopaks ^{(соотношение Е : Т 100:1); другие условия и обозначения те же, что в кратком описании Фигуры 13.}

На Фигуре 15 представлен график, показывающий обусловленный BsAb А77ХН425 лизис клеток-мишеней А431 эффекторными клетками в цельной крови; другие условия и обозначения те же, что в кратком описании Фигуры 13.

На Фигуре 16 представлен график, показывающий обусловленную BsAb анти-TAG 72XА77 антитело-зависимую цитотоксичность нейтрофилов в отношении TAG 72-несущих опухолевых клеток в виде функции концентрации антител BsAb (в мкг/мл).

На Фигуре 17 представлен график, показывающий стимуляцию с помощью композиции BsAb A77XTT роста специфических в отношении токсоида столбняка (ТТ) Т-клеток, определенную спектрофотометрическим анализом клеточной лактатдегидрогеназы и по присутствию данного антигена на моноцитах при действии BsAb по сравнению с присутствием, определенным при действии ТТ вне комплекса в виде функции концентрации каждого антигена (в мкг/мл).

На Фигуре 18 представлен график, показывающий степень обусловленного BsAb A77X520C9 фагоцитоза в виде функции концентрации (в мкг/мл) клеток опухоли молочной железы SKBR-3-мишеней при соотношении 15 нейтрофилов на клетку-мишень (кружки) или 3 моноцита (квадраты) на клетку-мишень.

На Фигуре 19 представлены результаты поточного цитометрического анализа, обусловленного BsAb фагоцитоза клеток SKBR-3 макрофагами, образованными из моноцитов (MDM); клетки-мишени SKBR-3 метили липофильным красным флуоресцентным красителем РКН 26 и культивировали с MDM в отсутствие или в присутствии BsAb A77X520C9 (или контрольных антител) при 37^oС в течение 24 час; MDM и нефагоцитированные опухолевые клетки выделяли с помощью трипсина и окрашивали aнти-CD14, меченным FITC, затем образцы анализировали по двухцветной флуоресценции с помощью FACScan. Процент фагоцитоза вычисляли, как число дважды положительно окрашенных клеток-мишеней (поглощенных MDM), деленное на общее число клеток-мишеней.

На Фигуре 20 представлен график, показывающий фагоцитоз клеток SKBR-3 с помощью BsAb A77X520C9, где специфический фагоцитоз клеток SKBR-3 индуцировали с помощью BsAb A77X520C9 (кружки), по сравнению с присутствием обоих несвязанных фрагментов F(аb’)₂ А77 и 520С9 (треугольники). Обусловленный BsAb фагоцитоз блокировали добавлением 10 мкг/мл F(аb’)₂ А77 (квадраты). BsAb-зависимый фагоцитоз вычисляли как % фагоцитоза с BsAb -% фагоцитоза без BsAb.

На Фигуре 21 представлена с помощью фотографии и способа поточной цитометрии иллюстрация обусловленного нейтрофилами фагоцитоза грибкового патогена Candida albicans в присутствии BsAb A77 Х антитела анти-Candida (A77X-Candida); панели А и В являются репрезентативными фотографиями, а панели С и D – результатами анализа с помощью FACScan нейтрофилов, которые были смешаны с клетками С. albicans в отсутствие (панели А и С) и в присутствии (панели В и D) BsAb.

На Фигуре 22 представлен график, показывающий степень BsAb-обусловленного киллинга (в виде функции концентрации в мкг/мл) клеток опухоли молочной железы-мишеней SKBR-3 нейтрофилами, обработанными G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов) (верхняя панель) или G-CSF и IFN- (нижняя панель).

На Фигуре 23 представлен график, показывающий степень BsAb-обусловленного киллинга (в виде функции концентрации в мкг/мл) клеток опухоли молочной железы-мишеней SKBR-3 эффекторными клетками, которые являются обработанными IFN- моноцитами (верхняя правая панель), обработанными TNF моноцитами (нижняя панель) или необработанными моноцитами (верхняя левая панель).

На Фигуре 24 представлен график в виде столбиков, показывающий, что предварительное инкубирование эффекторных клеток с IgA человека не влияет на связывание mAb A77 по сравнению с контролем, который инкубировали в отсутствие IgA.

На Фигуре 25 представлен график в виде столбиков, показывающий модуляцию Fс-рецепторов путем инкубирования клеток с mAb A77 в диапазоне концентраций от 0,001 до 10 мкг/мл, показывающий уровень изменений числа рецепторов на клеточной поверхности в виде функции инкубирования при возрастающей концентрации A77 по сравнению с контрольным mAb 520C9 в концентрации 10 мкг/мл.

На Фигуре 26 представлен график в виде столбиков, показывающий, что связывание BsAb с моноцитами или эффекторными клетками PMN не вызывает модуляцию FcR; модуляцию FcR после связывания А77Х520С9, F(ab’)₂ A77 или mAb A77 с PMN и моноцитами исследовали с помощью поточной цитометрии при различных концентрациях антител, добавляемых непосредственно к цельной крови, при инкубировании в течение ночи при 37^oС в среде, содержащей 5% CO₂. Эритроциты лизировали и уровень экспрессии FcR на поверхности PMN и моноцитах определяли путем инкубирования с зондом анти-hulgA-PE при 4^oС. Модуляцию вычисляли как [1-(MFI образца/ MFI в отсутствие антитела/контроль BSM)] х 100% (MFI – среднекратное увеличение, BSM – биспецифическая молекула).

На Фигуре 27 представлена последовательность ДНК вариабельного участка V_к легкой цепи гена, кодирующего антитело A77 против FcR (SEQ ID No 5), и предсказанной последовательности остатков аминокислот (SEQ ID No 6).

На Фигуре 28 представлена последовательность ДНК вариабельного участка V_Н тяжелой цепи гена, кодирующего антитело A77 против FcR (SEQ ID No 7) и предсказанной последовательности остатков аминокислот (SEQ ID No 8).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
I. Определения.

Определения терминов и фраз, которые используют в контексте заявки, должны иметь нижеуказанные значения. Термин антитело (или его фрагмент) используют в изобретении как компонент мультиспецифических агентов, которые вызывают ассоциацию цитолитической, фагоцитарной клетки белой крови с опухолевой клеткой или нежелательным агентом инфекционной болезни, или инфицированной клеткой. Антитела, пригодные для использования в способах, соответствующих изобретению, можно получить в данной области техники (например, в American Type Culture Collection (Американской коллекции типовых культур), Rockville, MD, или коммерческим путем, например приобрести у фирм Becton-Dickinson или Immunotech) или они могут быть приготовлены стандартными способами получения антител. Термин “антитело”, как используют в контексте заявки, относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным детерминантам молекул иммуноглобулинов, т.е. молекул, которые содержат участок связывания антигена, который специфически связывает (вступает в иммунную реакцию) антиген. Самое простое по структуре существующее в естественных условиях антитело (например, IgG) содержит четыре полипептидные цепи, две копии тяжелой (Н) цепи и две – легкой (L) цепи, все они ковалентно связаны дисульфидными связями. Специфичность связывания большого и разнообразного набора антител обнаружена в вариабельном (V) участке Н- и L-цепей; участки молекул, которые представляют собой исходные структуры, являются константными (С) в данном наборе.

С точки зрения структуры существующее в природных условиях антитело (например, IgG мол. массы 150 кД) состоит из четырех полипептидных цепей, двух копий тяжелой (Н) цепи и двух – легкой (L) цепи (мол. массы 25 кД), при этом четыре цепи ковалентно связаны дисульфидными связями. Специфичность связывания антигена каждой молекулой, которая содержит большой и разнообразный набор антител, обнаружена в вариабельном (V) участке Н- и L-цепей; участки молекул, представляющие собой исходные структуры, являются константными (С) в данном наборе. IgG (мол. масса 150 кД) является преобладающим антителом в выделениях (слюна, слезы, молоко, носовая слизь и выделения желудочно-кишечного и дыхательного трактов). IgA может существовать как мономер, димер и в виде мультимерных форм более высокого порядка (см. монографию под ред. J. Kendrew, The Encyclopedia of Molecular Biology, 1994, Blackwell Science, Oxford). Следующий изотип, представленный IgM, может быть обнаружен в виде связанного с мембраной мономера (мол. масса 190 кД) на В-клетках и в виде циркулирующей секреторной формы (как пентамер мол. массы 950 кД), которая отличается от связанной формы N-концом тяжелой цепи вследствие альтернативного сплайсинга. Тяжелая цепь пентамера присоединена дисульфидными мостиками к молекуле J-цепи. Минорные изотипы антител включают IgD (мол. масса 175 кД), экспрессируемый на клеточных поверхностях, и IgE. IgE (общая мол. масса 175 кД) содержит 0,0003% сывороточного иммуноглобулина, однако, его содержание может быть существенно выше у субъекта с аллергией, такого как астматик, и с медицинской точки зрения он является важным как главный медиатор аллергической реакции немедленного типа.

Участки связывания белков, которые содержат антитело, т.е. антигенсвязывающие функции антитела, локализованы с помощью анализа фрагментов существующего в естественных условиях антитела. Таким образом, предусматривается также определение антигенсвязывающих фрагментов термином “антитело”. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антитело, включают: фрагмент Fab, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L, С_H1; фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и С_H1 ; фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела; фрагмент dAb (см. статью Ward и соавт., 1989, Nature, 341:544-546), состоящего из домена V_H; выделенный определяющий комплементарность (гипервариабельный) участок (CDR) и фрагмент F(ab’)₂ – бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента F(ab’), связанных дисульфидным мостиком по шарнирному участку. Данные фрагменты антител получают, используя общепринятые способы, хорошо известные специалистам, и проводят скрининг фрагментов для того, чтобы использовать их так же, как интактные антитела. Термин “антитело” далее предусматривает включение биспецифических и химерных молекул, имеющих по меньшей мере одну детерминанту связывания антигена, полученную из молекулы антитела. Более того, хотя Н- и L-цепи фрагмента Fv кодируются отдельными генами, может быть создан синтетический линкер, который дает возможность сделать из них одну белковую цепь (известную как антитело из одной цепи, sAb; см. статьи Bird и соавт., 1988, Science, 242:423-426, и Huston и соавт. , 1988, PNAS, 85:5879-5883) рекомбинантными методами. Данные антитела из одной цепи также охватываются термином “антитело” и могут быть использованы в качестве связывающих детерминант при разработке и инженерном получении мультиспецифической связывающей молекулы. Фрагменты антител используют также для модуляции числа рецепторов для данного антитела на поверхности клеток и для получения агентов, имитирующих данную активность, путем скрининга таких агентов при анализе модуляции рецептора.

Поликлональные антитела образуются иммунизированными животными, обычно млекопитающими, при множественных подкожных или внутрибрюшинных введениях иммуногена (антигена) и адъюванта соответствующим образом. В качестве иллюстративного варианта осуществления животных обычно иммунизировали в отношении белка, пептида или производного путем смешивания от 1 мкг до 1 мг белка, способного вызывать иммунный ответ, с усиливающим действие препаратом-носителем, таким как полный адъювант Фрейнда, или агентом агрегации, таким как квасцы, и чрескожно вводили композицию в множество участков. Позднее животных ревакцинировали по меньшей мере одним последующим введением меньшего количества (от 1/5 до 1/10 исходного количества) иммуногена в полном адъюванте Фрейнда (или другом подходящем адъюванте) посредством подкожных инъекций в множество мест. Впоследствии у животных брали кровь, анализировали сыворотку для определения титра специфических антител и животных снова ревакцинировали и анализировали до тех пор, пока титр антител не переставал повышаться (т.е. выходил на плато).

Такие популяции молекул антител называют “поликлональными”, поскольку популяция содержит большой набор антител, каждое из которых является специфическим в отношении одного из многих различающихся эпитопов, находящихся в имуногене, и каждое из которых характеризуется специфической аффинностью к данному эпитопу. Эпитоп представляет собой минимальную антигенную детерминанту, которая в случае белка содержит пептид длиной от шести до восьми остатков (см. Berzofsky J. и I. Berkower (1993) в монографии под ред. Paul W. Fundamental Immunology (Фундаментальная иммунология), Raven Press N.Y., стр. 246). Аффинности антител к антигену изменяются в диапазоне от низкой, например 10^-6М, до высокой, например 10^-11. Фракцию поликлональных антител, собранную в сыворотке млекопитающего, выделяют хорошо известными способами, например хроматографией с аффинным матриксом, который селективно связывает молекулы иммуноглобулина, таким как белок А, с целью получения фракции IgG. Для повышения чистоты и специфичности антитела специфические антитела могут быть далее очищены иммуноаффинной хроматографией с использованием связанного с твердой фазой иммуногена. Антитело контактирует со связанным с твердой фазой иммуногеном в течение периода времени, который является достаточным для иммунной реакции иммуногена с молекулами антитела, с образованием связанного с твердой фазой иммунокомплекса. Связанные антитела элюируют с твердой фазы стандартными способами, такими как использование буферов с понижением рН или повышением ионной силы. Элюированные фракции анализируют и объединяют фракции, содержащие специфические антитела.

Термин “моноклональное антитело” или “композиция моноклонального антитела” в контексте заявки относится к препарату молекул антител единственной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела (mAb) проявляет специфичность и аффинность связывания, предназначенную для одного отдельного эпитопа. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием способа, который обеспечивает образование молекул антител путем непрерывного роста клеток в культуре. Данные способы включают, но не ограничиваются способами с использованием гибридом, впервые описанными Kohlern Milstein (см. статью 1975, Nature, 256:495-497; см. также статьи Browm и соавт., 1981, J. Immunol. , 127:539-546; Brown и соавт., 1980, J. Biol. Chem., 255:4980-4983; Yeh и соавт., 1976, PNAS, 76:2927-2931 и Yeh и других, 1982, Int. J. Cancer, 29:269-275), и более современного способа с использованием В-клеточных гибридом (см. статью Kozbor и соавт., 1983, Immunol. Today, 4:72), способом с использованием EBV-гибридом (см. Cole и другие, 1985, в монографии Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Моноклональные антитела и терапия рака), Alan R. Liss. Inc., стр. 77-96) и способы с использованием триомы.

Не имеется опухолеспецифических mAb класса IgA человека. Однако, вероятно, что сывороточные IgA (до 4,0 мг/мл) могут нарушать активность mAb IgA в физиологических условиях. В другом подходе используют молекулы биспецифического антитела для получения РсRI-зависимой связанной с клетками цитотоксичности в отношении опухолевых мишеней. Описаны биспецифические молекулы (BsAb), которые одновременно связывают клетки-мишени (опухолевые клетки, патогены) и запускающий рецептор (например, CD3, CD2, FcR) на иммунных эффекторных клетках (см. статьи Michon J. и соавт., 1995, Blood, 86:1124-1130; Bakacs T. и соавт., 1995, International Immunology, 7.6:947-955). BsAb могут быть получены из гетерогибридом или путем химического или генетического связывания фрагментов F(ab’) двух антител с различными специфичностями или фрагмента F(ab’) и лиганда (см. Graziano R.F. и соавт., 1995, в монографии Bispecific Antibodies (Биспецифические антитела) под ред. M.W.Fanger, R.G. Landes Company/Austin ТХ; см. также статью Goldstein J. и соавт., 1997, J. Immunol. , 158:872-879). BsAb, полученные с использованием специфического к запускающему рецептору антитела, которое связывается вне связывающего домена природного лиганда запускающего рецептора, могут обойти препятствия в виде сывороточных антител и рекрутировать иммунные эффекторные клетки при наличии насыщающей концентрации природного лиганда (см. статью Fanger M. и соавт., 1989, Immunol. Today, 103:92-99). Данную стратегию использовали для получения FcR-специфических BsAb, которые обусловливают антитело-зависимую цитотоксичность (ADCC) в отношении опухолевых клеток в присутствии мономерного или агрегированного IgG (см. статьи Michon J. и соавт., 1995, Blood, 86: 1124-1130; Bakacs T. и соавт., 1995, International Immunology, 7.6:947-955), и показали обнадеживающие результаты в клиническихусловиях (см. статью Deo Y. M. и соавт. , 1997, Immunol. Today, 18:127-135). Описаны четыре FcRI-специфических mAb, идентифицированных как A3, А59, А62 и А77, которые связывают FсRI вне лигандсвязывающего домена lgА (см. статью Monteiro R.C. и соавт., 1992, J. Immunol., 148:1764).

Моноклональные антитела могут быть получены следующими путями. Во всех способах животное иммунизируют антигеном, таким как белок (или его пептид), как описано выше для получения поликлонального антитела. Иммунизацию, как правило, выполняют путем введения иммуногена иммунологически компетентному млекопитающему в иммунологически эффективном количестве, т.е. в количестве, достаточном для получения иммунного ответа. Млекопитающее предпочтительно представлено грызуном, таким как кролик, крыса или мышь. Затем млекопитающее проводят по схеме ревакцинации в течение периода времени, который является для млекопитающего достаточным для генерации молекул высокоаффинных антител, как описано. У каждого иммунизированного млекопитающего, секретирующего желаемое антитело, берут суспензию продуцирующих антитело клеток. Через достаточное для генерации высокоаффинных антител время животное (мышь) умерщвляют и получают продуцирующие антитело лимфоциты из одного или более лимфатических узлов, селезенки или периферической крови. Клетки селезенки являются предпочтительными, они могут быть механически разделены на отдельные клетки в физиологической среде с использованием хорошо известных специалистам способов. Продуцирующие антитела клетки иммортализуют путем слияния с клетками линии мышиной миеломы. Лимфоциты мыши дают высокий процент стабильных слияний с мышиными гомологичными миеломами, однако, могут быть также использованы соматические клетки крысы, кролика и лягушки. Клетки селезенки желаемых продуцирующих антитело животных иммортализуют путем слияния с клетками миеломы, обычно в присутствии агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль. Любую из числа линий клеток миеломы, пригодную в качестве партнера для слияния, используют в стандартных способах, например линии миеломы P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 или Sp2/О-Ag14, имеющиеся в American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md.

Полученные при слиянии клетки, которые включают желаемые гибридомы, культивируют в селективной среде, такой как среда HAT, разработанная для элиминации неслитых клеток родительской миеломы или лимфоцитов, или клеток селезенки. Для получения изолированных клонов клетки гибридомы отбирают и выращивают в условиях ограниченного разведения. Проводят скрининг супернатантов каждой клональной гибридомы на образование антитела желаемой специфичности и аффинности, например, иммуноаналитическими способами, с целью определения желаемого антигена, такого, который был использован при иммунизации. Моноклональное антитело выделяют из культур клеток-продуцентов принятыми способами, такими как преципитация сульфатом аммония, ионообменная хроматография и аффинная хроматография (см. Zola и соавт. в монографии Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications (Моноклональные гибридомные антитела – методики и применение) под ред. Hurell, стр. 51-52, CRC Press, 1982). Гибридомы, полученные в соответствии с данными методами, могут быть размножены в культуре in vitro или in vivo (в асцитной жидкости) с использованием хорошо известных специалистам способов.

При терапевтическом применении антител нечеловеческого происхождения у человека нечеловеческие “чужеродные” эпитопы вызывают у пациента иммунную реакцию. При достаточном ее развитии может возникнуть потенциально летальное заболевание, известное как НАМА (человеческие антитела против мышиного антитела). Для устранения или сведения к минимуму НАМА желательно инженерное получение химерных производных антител, т.е. “гуманизированных” молекул антител, в которых сочетаются места связывания вариабельного участка Fab нечеловека и константный участок (Fc) человека. Данные антитела характеризуются равной специфичностью и аффинностью к антигену моноклональных и поликлональных антител, описанных выше, и уменьшенной иммуногенностью при введении человеку, вследствие чего они, вероятно, лучше переносятся пациентом.

Химерные моноклональные антитела типа мышь-человек (т.е. химерные антитела) могут быть получены способами с использованием рекомбинантной ДНК, известными в уровне техники. Например, ген, кодирующий константный участок Fc молекулы мышиного (или другого вида) моноклонального антитела, расщепляют рестриктазами для удаления участка, кодирующего мышиный Fc, и заменяют его эквивалентной частью гена, кодирующего человеческий константный участок Fc (см. Robinson и соавт., Международная заявка WO 87/02671; Akira и соавт., Европейская патентная заявка (ЕР) 184187; Taniguchi М., ЕР 171496; Morrison и соавт. , ЕР 173494; Neuberger и соавт., Международная заявка WO 86/01533; Cabilly и соавт. Патент No 4816567; Cabilly и соавт., ЕР 125023; статьи Better и соавт., 1988, Science, 240:1041-1043; Liu и соавт., 1987, PNAS, 84: 3439-3443; Liu и соавт. , 1987, J. Immunol., 139:3521-3526; Sun и соавт., 1987, PNAS, 84:214-218; Nishimura и соавт., 1987, Canc. Res., 47:999-1005; Wood и соавт. , 1985, Nature, 314:446-449, и Shaw и соавт. 1988, J. Natl. Cancer Inst, 80:1553-1559).

Химерное антитело может быть далее гуманизировано заменой последовательностей вариабельного участка Fv, который непосредственно не участвует в связывании антигена, эквивалентными последовательностями из вариабельных участков Fv человека. Основные обзоры гуманизированных химерных антител представлены Morrison S. L, 1985, Science, 229:1202-1207 и Oi и соавт., 1986, BioTechniques, 4:214. Данные методы включают выделение, различные манипуляции и экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют полностью или частично вариабельные участки Fv иммуноглобулина из по меньшей мере одной из тяжелой или легкой цепей. Источники данных нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам и, например, могут быть выделены из гибридомы 7Е3, продуцирующей антитело против GРII_bIII_a. Рекомбинантная ДНК, кодирующая химерное антитело или его фрагмент, может быть клонирована в предназначенный вектор экспрессии. Подходящие гуманизированные антитела могут быть альтернативно получены путем замены CDR (см. Патент США 5225539; статьи Jones и соавт. , 1986, Nature, 321:552-525; Verhoeyan и соавт., 1988, Science, 239: 1534, и Beidler и соавт., 1988, J. Immunol., 141:4053-4060).

Человеческие антитела, направленные против белков человека, могут быть получены с использованием трансгенных мышей, несущих полную человеческую иммунную систему, а не систему мыши. Спленоциты данных трансгенных мышей, иммунизированные антигеном, представляющим интерес, используют для получения гибридом, которые секретируют человеческие mAb со специфическими аффинностями к эпитопам из человеческого белка (см., например, Wood и соавт., Международная заявка WO 91/00906, Kucherlapati и соавт. , Публикация PCT WO 91/10741; Lonberg и соавт., Международная заявка WO 92/03918; Кау и соавт., Международная заявка WO 92/03917; статьи Lonberg N. и соавт., 1994, Nature, 368:856-859; Green L.L и соавт., 1994, Nature Genet., 7:13-21; Morrison S.L. и соавт., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81:6851-6855; Bruggeman и соавт. , 1993, Year Immunol., 7:33-40; Tuaillon и соавт., 1993, PNAS, 90:3720-3724; Bruggeman и соавт., 1991, Eur. J. Immunol., 21:1323-1326).

Моноклональные антитела могут быть также получены другими хорошо известными специалистам способами с использованием рекомбинантной ДНК. Альтернативный способ, называемый способом “комбинаторного воспроизведения антител”, был разработан для идентификации и выделения фрагментов антител, имеющих специфичность к определенному антигену, и может быть использован для получения моноклональных антител (описания комбинаторного воспроизведения антител см., например, в статьях Sastry и соавт., 1989, PNAS, 86:5728; Huse и соавт. , 1989, Science, 246:1275, и Orlandi и соавт., 1989, PNAS, 86:3833). После иммунизации животного иммуногеном, как описано выше, клонируют спектр антител из полученного набора В-клеток. В основном известны способы получения последовательности ДНК вариабельных участков популяции различных молекул иммуноглобулинов при использовании смеси олигомерных праймеров и ПЦР (полимеразной цепной реакции). Например, смешанные олигонуклеотидные праймеры, соответствующие 5′-лидерным последовательностям (последовательностям сигнального пептида) и/или последовательностям рамки считывания 1 (FR1), а также праймер к праймеру консервативного 3′-константного участка могут быть использованы для ПЦР-амплификации вариабельных участков тяжелой и легкой цепей из ряда мышиных антител (см. статью Larrick и соавт., 1991, Biotechniques, 11:152-156). Подобная стратегия также может быть использована для амплификации вариабельных участков тяжелой и легкой цепи человеческих антител (см. статью Larrick и соавт., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology, 2:106-110).

Термин “комплемент” относится к набору из более чем 30 сывороточных белков, которые повсюду присутствуют без предварительной обработки определенным антигеном (см. Liszewski M. и соавт., 1993, в сборнике Fundamental Immunol. (Фундаментальная иммунология), 3-е изд. под ред. W. Paul, гл. 26 “The Complement System” (Система комплемента), стр. 917). Функцией системы комплемента является модификация мембраны инфекционного агента и стимуляция воспалительной реакции посредством активности клетки. Белки комплемента конвертируются в активные формы под действием ряда протеолитических расщеплений. Образование реактивного белка С3b может происходить быстро и эффективно по “классическому” пути комплемента или медленно и неэффективно по “альтернативному” пути. С3 секретируется моноцитами и макрофагами; комплекс факторов В и D и пропердин расщепляют С3 с образованием С3а и С3b. Данные продукты стимулируют дегрануляцию мастоцитов, высвобождая тем самым молекулы воспаления, такие как гистамин, протеазы, лизоцим, кислые гидролазы и миелопероксидазы. Опсонизация мембран клеток-мишеней способствует лизису и фагоцитозу.

Как используют в контексте заявки, термин “цитокин” означает белковый гормон, который может участвовать в иммунной защите против “чужеродных” субстанций или организмов. Основные свойства цитокинов описаны, например, в монографии Abbas А. и соавт., Cell and Molecular Immunology (Клетка и молекулярная иммунология), 2-е изд. , 1994, Saunders, Philadelphia. Воспалительные цитокины включают фактор некроза опухоли (TNF), интерлейкин 1 (IL-1), IL-6 и -интерферон (INF-). Образование цитокинов хозяином можно стимулировать микробным продуктом, таким как липополисахарид (LPS), или чужеродным антигеном.

Цитокины могут образовываться клетками иммунной системы, например Т-клетками и базофилами, и могут действовать на расположенные рядом другие клетки (паракринное действие) или на продуцирующие клетки (аутокринное действие) или могут высвобождаться в систему кровообращения и воздействовать на отдаленные клетки (эндокринное действие). Категории функций цитокинов включают: участие в естественном иммунитете, регуляцию активации, роста и дифференциации лимфоцитов; регуляцию связанного с иммунитетом воспаления и стимуляцию роста и дифференциации лейкоцитов.

Функцию цитокинов инициируют связыванием со специфическим рецептором на клетке-мишени. Например, полипептид ТNF мол. массы 17кД, который функционирует в виде тримера, образуется фагоцитами и Т-клетками. Он связывает специфический TNF-рецептор, расположенный, например, на нейтрофиле или эндотелиальной клетке, для активации воспалительных реакций. Одной из таких реакций клеток-мишеней является образование IL-1, который в свою очередь вызывает образование IL-6. Оба TNF и IL-1 действуют на тимоциты, инициируя сигнальный каскад, приводящий к повышенной экспрессии генов, кодирующих белки Ig. Подобным образом IFN- связывает специфические клеточные рецепторы для стимуляции экспрессии различных последовательностей. Данные цитокины также связывают рецепторы на клетках печени, активируя экспрессию белков острой фазы иммунной реакции.

Другие цитокины могут быть противовоспалительными по своим эффектам на иммунную систему, например, IL-4, IL-10 и IL-13 (см. статьи Joyce D. и соавт. , 1994, Eur. J. Immunol., 24:2699-2705; Zurawski G. и соавт. 1994, Immunol. Today, 15:19-26). IL-10, таким образом, снижает противовоспалительные эффекты TNF путем регуляции по типу обратной связи экспрессии TNF-рецептора (TNF-R), повышая продукцию растворимого TNF-R и ингибируя высвобождение TNF.

Далее, функция белка IL-13 человека, исследованная стимуляцией моноцитов с помощью LPS (липополисахаридов), ингибирует образование Il-1, IL-1, IL-6, IL-8, МIР-1, TNF-, IL-10, GM-CSF и G-CSF. Далее, усиливается образование IL-1rа (антагониста рецептора), растворимой формы рецептора IL-1. Эти противовоспалительные свойства подобны таковым IL-4 и IL-10.

Иммунный ответ на “чужеродные антигены” содержит представление о том, что “свои” белки и другие молекулы, экспрессируемые в организмах, не являются антигенными или иммуногенными для данного организма. На самом деле, установление различий между изологичными или гомологичными детерминантами и чужеродными или гетерологичными детерминантами достигается при созревании иммунной системы организма во время развития иммунной системы. Существует система селекции в отношении иммунных клеток, несущих антитела с местами связывания со “своими”, таким образом при созревании иммунная система не действует на нативные для организма белки или другие молекулы. В определенных патологических условиях, известных как “аутоиммунные заболевания”, однако, данное установление различий не является точным и эндогенные структуры могут быть объектом атаки иммунной системы. Примеры аутоиммунных заболеваний и состояний, при которых присутствует аутоиммунный фактор обострения симптомов, включают системную красную волчанку, миастению gravis, рассеянный склероз и ревматоидный артрит. Композиции данного изобретения, которые способны связывать сайт на Fc-рецепторе благодаря содержанию места связывания антитела для сайта на рецепторе, могут также модулировать число данных рецепторов на поверхности клетки и, соответственно, являются потенциальными агентами для лечения аутоиммунных заболеваний. Далее, данные о последовательности аминокислотных остатков участков Fv места связывания антитела являются базой для создания трехмерной модели таких харектеристик белка, как размер, заряд и форма набора остатков, который содержит данный сайт связывания. При этом могут быть сконструированы агенты, которые имитируют данный сайт связывания.

Агенты, соответствующие изобретению, вводят субъектам в биологически совместимых формах, пригодных для фармацевтического введения in vivo с целью получения терапевтического ответа против рака или инфекционного заболевания. Термин “биологически совместимая форма, пригодная для введения in vivo”, означает форму белка для введения, в которой терапевтическое действие композиции преобладает над токсическими и побочными эффектами.

Термин “субъект”, как используют в данном контексте, относится к живому животному или человеку, находящемуся или имеющему предрасположенность к состоянию, в частности “раку или инфекционному заболеванию”, определенному ниже. Субъект является организмом, несущим лейкоциты, способные отвечать на антигенную стимуляцию и стимуляцию фактором роста. В предпочтительных вариантах осуществления субъект является млекопитающим, включая человека и таких животных, как собаки, кошки, свиньи, коровы, овцы, козы, лошади, крысы и мыши. В наиболее предпочтительном варианте осуществления субъектом является человек. Термин “субъект” не исключает особей, полностью здоровых в плане рака, инфекционных заболеваний или здоровых во всех отношениях.

Термин “пациент”, как здесь используют, относится к человеку, который обратился в клиническое учреждение с определенным симптомом или симптомами, предполагающими одну или более схем терапии. Пациент может нуждаться в дальнейшей диагностике клиническими методами, хорошо известными практикующим врачам (или может не иметь других признаков заболевания или, возможно, быть в каких-либо или всех отношениях здоровым). Диагноз пациента может изменяться в период развития заболевания, например развития дальнейших симптомов болезни, или ремиссии болезни, либо спонтанной, либо во время курса лечения, или может ставиться новый диагноз полностью нормального состояния.

Термин “инфекционная болезнь” предназначен для включения нарушений, вызываемых одним или более видов бактерий, вирусов, грибов и простейших, которые являются болезнетворными организмами, обозначаемыми общим понятием “патогены”. Термин “грибы” предусматривает включение дрожжей. В данном изобретении примеры патогенов включают, но не ограничиваются грамположительными бактериями, такими как Enterococcus fecalis, Hemophilus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, S. epidermis, S. intermedias, Streptococcus hemolyticus, S. pneumoniae; грамотрицательные бактерии, такие как Flavobacterium meningosepticum, Helicobacter pylori, Hemophilus pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteria, Salmonella typhi, S. paratyphi, Escherichia coli серотипа 0157, виды Chlamydia, виды Helicobacter; вирусы, такие как ВИЧ-1, -2 и -3, HSV-I и -II, вирус гепатита не-А, не-В, не-С, поксвирусы, вирусы бешенства и вирус ньюкастлской болезни; грибы, такие как Candida albicans, С. tropicalis, С. krusei, С. pseudotropicalis, С. parapsilosis, С. quillermondii, С. stellatoidea, Aspergillus fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, Absidia corymbifera, A. ramosa, Cryptococcus neoforms, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Pneumocystis carinii, Rhizopus arrhizus, R. oryzae, Mucor pusillus и другие грибы, а также простейшие, такие как Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Giardia lamblia, G. intestinalis, Eimeria sp., Toxoplasma sp., Cryptosporidium parvum, C. muris, C. baileyi, C. meleagridis, C. wrairi и С. nosarum. Получение уникальных эпитопов из этих организмов путем скрининга белков и анализа полипептидов in vitro в большинстве случаев известно специалистам.

II. Молекулы с множественной специфичностью (мультиспецифические молекулы).

Настоящее изобретение в одном из вариантов осуществления касается рекомбинантных мультиспецифических молекул, которые обладают аффинностью и способны связывать по меньшей мере две различные структуры. Мультиспецифические молекулы могут включать биспецифические молекулы, содержащие детерминанту связывания для Fc-рецептора и детерминанту связывания для мишени. Предпочтительные для данного изобретения мультиспецифические молекулы включают молекулы, которые содержат по меньшей мере одну копию места связывания, которое специфически связывает Fс-рецептор или мишень, или молекулы, содержащие по меньшей мере одну детерминанту связывания, которая специфически связывает Fc-рецептор, одну детерминанту связывания для мишени и дополнительно одно или более мест связывания, которые распознают другие молекулы. Предпочтительные мультиспецифические молекулы представлены биспецифическим антителом (BsAb), которое несет по меньшей мере два различных места связывания по меньшей мере одно из которых имеет природу антитела.

Термин “детерминанта связывания для Fc-рецептора” относится к антителу, функциональному фрагменту антитела (например, фрагменту Fab) или лиганду, такому как инженерный связывающий белок, который распознает Fc-рецептор на эффекторной клетке. Предпочтительные антитела для использования в данном изобретении связывают Fc-рецептор на эффекторной клетке (белой кровяной клетке) по сайту, который не связан эндогенным иммуноглобулином А (IgА). Наиболее предпочтительно, когда фрагмент V_H и V_L против Fc-рецептора связывает человеческий FcR. Представлены предпочтительные гуманизированные моноклональные антитела против FcR, описания которых введены здесь полностью в виде ссылки. Антитело, которое представлено BsAb или мультиспецифической молекулой, соответствующей изобретению, может быть целым, т.е. имеющим тяжелую и легкую цепи, или его фрагментом, например фрагментом Fab или (Fab’)₂. Антитело далее может быть димером легкой цепи или тяжелой цепи, или каким-либо его минимальным фрагментом, таким как Fv, или конструкцией из одной цепи, как описано у Ladner и соавт. (см. Патент США No 4946778, выданный 7 августа 1990 г.), содержание которого полностью введено в виде ссылки.

Термин “эффекторная клетка”, как используют в данном контексте, относится к иммунной клетке, которая представлена лейкоцитом или лимфоцитом. Специфические эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. Например, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и лимфоциты, которые экспрессируют FcR, участвуют в специфическом киллинге клеток-мишеней и презентации антигенов для других компонентов иммунной системы или в связывании клеток, которые представляют собой антигены. Экспрессия определенного FcR на эффекторной клетке может регулироваться такими гуморальными факторами, как цитокины. Например, обнаружено, что экспрессия FcRI регулируется по типу обратной связи интерфероном- (IFN-). Данная повышенная экспрессия увеличивает цитотоксическую активность FcRI-несущих клеток в отношении мишеней.

Рекомбинантные антитела или фрагменты антител, которые специфически связывают Fc-рецептор, предпочтительно являются “гуманизированными”, т.е. несут фрагменты, полученные из человеческого антитела, но имеющие по меньшей мере один фрагмент определяющего комплементарность участка (CDR), полученного из нечеловеческого антитела. Обычно фрагмент, который “гуманизирован”, выбирают таким образом, чтобы обеспечить специфичность гуманизированного антитела в связывании Fc-рецептора человека. Гуманизированное антитело имеет фрагменты CDR, выделенные из нечеловеческого антитела, и “константные” участки молекулы антитела человеческой природы.

Фрагмент нечеловеческого CDR, введенный в человеческое антитело, выбирают так, чтобы он был достаточным для обеспечения связывания гуманизированного антитела с Fс-рецептором. Достаточный фрагмент может быть выбран путем инсерции фрагмента CDR в человеческое антитело и тестирования связывающей способности созданного гуманизированного антитела с использованием поточной цитометрии или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Все CDR данного человеческого антитела могут быть заменены по меньшей мере одним фрагментом нечеловеческого CDR или только некоторые CDR могут быть заменены нечеловеческими CDR. Необходимой является только замена такого количества CDR, которое требуется для связывания гуманизированного антитела с Fc-рецептором.

Антитело может быть гуманизировано любым способом, которым можно заменить по меньшей мере один фрагмент CDR человеческого антитела фрагментом CDR, выделенным из нечеловеческого антитела. Winter описывает способ, который может быть использован для приготовления гуманизированных антител, соответствующих данному изобретению (Патентная заявка GB 2188638 А, поданная 26 марта 1987 г., содержание которой полностью включено в виде ссылки). Человеческие CDR могут быть заменены нечеловеческими CDR с использованием олигонуклеотидного сайт-направленного мутагенеза, как описано в Международной заявке WO 94/10332 под названием “Гуманизированные антитела к Fc-рецепторам для иммуноглобулина G на мононуклеарных фагоцитах человека”.

Кроме фрагмента против Fc-рецептора заявленные мультиспецифические молекулы могут содержать детерминанту связывания для мишени, т.е. антитела, функционального фрагмента антитела или лиганда, который распознает и связывает патоген (например, вирусы, бактерии, грибы, простейшие), инфицированные патогеном клетки, раковые или опухолевые клетки (например, молочной железы, яичников, простаты, семенников, легкого, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови или лимфатической системы) или другие нежелательные клетки у субъекта (например, человека или животного), или антиген, или его модифицированную форму. Дополнительно фрагмент-мишень может содержать или быть направленным против антигена. Предпочтительный вариант осуществления содержит антиген, который может быть использован для индукции специфического иммунного ответа против хронической инфекции, против опухолевой или раковой клетки или для истощения антигена в кровотоке. Другой особенно предпочтительный вариант осуществления представляет антиген, который связан с мультивалентной молекулой, содержащей детерминанту связывания для FcR, который стимулирует иммунную систему путем направления антигена к антиген-презентирующей клетке (клетка, преподносящая или представляющая антиген).

В одном варианте осуществления изобретения мультиспецифическая молекула содержит детерминанту связывания или лиганд, который взаимодействует c молекулой. В предпочтительном варианте осуществления детерминанта связывания связывает белок, например белок на клетке-мишени, такой как раковая клетка или клетка агента инфекционной болезни, или сам агент, или инфицированную клетку. Предпочтительные места связывания включают антитела, фрагменты антител и рецепторы для факторов роста или факторов дифференциации. Например, мультивалентная молекула может содержать эпидермальный фактор роста (EGF) или по меньшей мере фрагмент или модифицированную форму, которые способны к взаимодействию с рецептором, например, рецептором эпидермального фактора роста EGF-R или антитела к EGF-R. Особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения содержит BsAb, несущее детерминанту связывания для человеческого EGF-подобного рецептора, включая EGF-R, HER-2/neu, HER-3, HER-4 и т.п. В еще одном предпочтительном варианте осуществления детерминанта связывания представлена опухолевым антигеном TAG 72, обнаруженном, например, на опухолях молочной железы, толстой кишки и яичников.

В другом предпочтительном варианте осуществления лиганд является маленьким пептидом, таким как бомбезин, гастрин-высвобождающий пептид (GRP), литорин, нейромедин В или нейромедин С. Последовательности пептидов могут быть найдены, например, в Патенте США No 5217955, содержание которого введено в контекст изобретения в виде ссылки. Лиганд может также быть модифицированной формой какого-либо из данных пептидов. Модификация может повышать связывание рецептора, снижать связывание или не влиять на связывание рецептора. Модификация лиганда может также трансформировать агонист в антагонист таким образом, что лиганд ингибирует, а не стимулирует пролиферацию клеток. Модификация лиганда может быть представлена введением, делецией, заменой или модификацией по меньшей мере одной аминокислоты.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мультиспецифическая или биспецифическая молекула содержит антиген. Как используют в контексте данной заявки, термин “антиген” означает любую
естественную или синтетическую иммуногенную субстанцию, фрагмент или часть иммуногенной субстанции, пептидный эпитоп или гаптен. В варианте осуществления изобретения би- или мультиспецифическую молекулу используют для получения направленности антигена, например токсоида столбняка, на клетку для усиления процессов интернализации и презентации у данных клеток и в конечном счете для стимуляции у них иммунного ответа. В специальном варианте осуществления биспецифический связывающий агент специфически связывает антиген (либо непосредственно эпитоп антигена, либо не прямо, через эпитоп, связанный с антигеном) и в то же самое время связывает поверхностный рецептор антиген-презентирующей клетки, которая может интернализовать антиген для процессинга и презентации. В другом варианте осуществления антиген связан с мульти- или биспецифической молекулой и в то же самое время связывает поверхностный рецептор антиген-презентирующей клетки. В предпочтительном варианте осуществления антиген ковалентно связан с мультиспецифической молекулой генетическими или химическими средствами. Рецепторсвязывающий компонент би- или мультиспецифической молекулы (и таким образом сама би- или мультиспецифическая молекула) связывает рецептор антиген-презентирующей клетки по другому сайту, отличному от существующего в естественных условиях лиганда. Таким образом, связывание мультиспецифической молекулы происходит без конкуренции с природным лигандом за рецептор. В результате физиологические уровни лиганда не будут препятствовать связыванию рецептора, и целенаправленный рецептор будет сохранять способность связывания молекулы, соответствующей изобретению, и лиганда.

Один тип антигена может быть представлен аллергеном. Термин “аллерген” относится к субстанции, которая может индуцировать аллергическую или астматическую реакцию у чувствительного субъекта. Число аллергенов, которые вызывают аллергическую реакцию, в пропорциональном отношении к количеству населения (популяции) является огромным и включает различную пыльцу, яды насекомых, перхоть животных, белки клещей, обитающих в пыли, споры грибов и лекарственные вещества (например, пенициллин). Примеры естественных аллергенов животного и растительного происхождения включают белки, специфические для следующих родов: Felis (Felis domesticus), Canis (Canis familiaris), Dermatophagoides (например, Dermatophagoides farinae), Periplaneta (например, Periplaneta americana), Ambrosia (Ambrosia artemisiifolia), Lolium (например, Lolium perenne или Lolium multiflorum), Cryptomeria (Cryptomeria japonica), Alternaria (Alternaria alternata), Alder, Alnus (Alnus gultinosa), Betula (Betula verrucosa), Quercus (Quercus alba), Olea (Olea europa), Artemisia (Artemisia vulgaris), Plantago (например, Plantago lanceolata), Parietaria (например, Parietaria officinalis или Parietaria judaica), Blatella (например, Blatella germanica), Apis (например, Apis multiflorum), Cupressus (например, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica и Cupressus macrocarpa), Juniperus (например, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis и Juniperus ashei), Thuya (например, Thuya orientalis), Chamaecyparis (например, Chamaecyparis obtusa), Agropyron (например, Agropyron repens), Secale (например, Secale cereale), Triticum (например, Triticum aestivum), Dactylis (например, Dactylis glomerata), Festuca (например, Festuca elatior), Poa (например, Poa pratensis или Poa compressa), Avena (например, Avena sativa), Holcus (например, Holcus lanatus), Anthoxanthum (например, Anthoxanthum odoratum), Arrhenatherum (например, Arrhenatherum elatius), Agrostis (например, Agrostis alba), Phleum (например, Phleum pratense), Phalaris (например, Phalaris arundinacea), Paspalum (например, Paspalum notatum), Sorghum (например, Sorghum halepensis) и Bromus (например, Bromus inermis).

Множество аллергенов обнаружено в переносимой по воздуху пыльце амброзии, трав или деревьев или в грибах, у животных, в домашней пыли или в пищевых продуктах. Как класс, они являются относительно устойчивыми к протеолитическому разложению. Предпочтительными аллергенами являются аллергены, которые связывают IgE на мастоцитах и базофилах, вызывая таким образом ряд симптомов от воспаления и астмы до анафилактической аллергической реакции типа I.

В другом предпочтительном варианте осуществления детерминанта связывания является специфической в отношении антигена на агенте инфекционного заболевания или инфицированной клетке, как описано supra. Место связывания (детерминанта) может быть выделено из поликлонального антитела, которое может быть получено при инъекции кролику или другому подходящему животному фрагмента или компонента патогена, например, компонента клеточной стенки патогена. IgG может быть очищен из сыворотки иммунизированного животного. F(ab’)₂ может быть получен и использован в качестве источника детерминанты связывания мишени. Например, возможно получение поликлонального антитела, приготовленного иммунизацией кролика препаратом фрагментов Candida albicans, и его использование для получения F(ab’)₂ IgG против С. albicans, который может быть связан с детерминантой связывания для FcRI описанными здесь химическими методами.

В ряде случаев может быть желательным связывание субстанции, которая является слабоантигенной или неантигенной по своей природе (такой как гаптен) с молекулой-носителем, такой как большой иммуногенный белок (например, бактериальный токсин), для введения. В таких случаях может быть получен биспецифический связывающий реагент для связывания эпитопа носителя, к которому присоединена субстанция, а не эпитопа самой субстанции.

Антиген, который может быть прямо или непрямо связан с мульти- или биспецифической молекулой, соответствующей изобретению, может быть растворимым или в виде частиц; он может нести В-клеточные эпитопы, Т-клеточные эпитопы или оба варианта. Антиген может быть бактериальной, грибной, вирусной или паразитарной природы. Часто антиген будет содержать компонент поверхностной структуры патогенного организма или поверхностной структуры клетки, инфицированной патогенным организмом. Например, антиген может содержать вирусную поверхностную структуру, такую как гликопротеин оболочки вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или поверхностный антиген вируса гепатита. Кроме того, антиген может быть ассоциирован с больной клеткой, такой как опухолевая клетка, в отношении которой может быть вызван иммунный ответ с целью лечения заболевания. Антиген может содержать опухолеспецифический или ассоциированный с опухолью антиген, такой как продукт протоонкогена HER-2/neu, который экспрессируется на клетках рака молочной железы и яичников человека (см. статью Slamon и соавт., 1989, Science, 244:707). Другим важным раковым антигеном, который содержит мишень BsAb, соответствующего данному изобретению, является TAG 72, который был идентифицирован у приблизительно 90% колоректальных раковых заболеваний, 85% опухолей молочной железы и 95% опухолей яичников (см. статью Johnson и соавт., 1986, Cancer Res., 46:850-897; Bodmer M. и соавт., описание Европейского Патента 0348442 В1; Mezes P. и соавт., Международная заявка WO 93/12231).

Клетки субъекта могут быть обработаны ex vivo или in vivo мультиспецифическими молекулами, соответствующими изобретению, для получения направленности антигена на антиген-презентирующие клетки. Иммунные клетки отделяют и очищают от крови, обрабатывают мультиспецифической молекулой, содержащей антиген, или клетки могут быть обработаны антигеном в сочетании с мультиспецифической молекулой, содержащей детерминанту связывания для антигена. После стимуляции клетки вводят обратно субъекту. Клетки, предназначенные для использования в данной процедуре, могут быть также обработаны цитокинами и другими факторами с целью, например, позитивной регуляции числа рецепторов на клетку. Далее терапевтическое применение in vivo или ex vivo молекул может быть усилено лечением субъекта одним или более цитокинами или факторами роста.

Способ, соответствующий данному изобретению, может быть использован для усиления или укрепления иммунного ответа на антиген. Например, способ является ценным для лечения хронических инфекций, таких как гепатит и СПИД, при которых пораженная иммунная система не способна преодолевать инфекцию. Он также может быть использован при лечении острых стадий инфекции, когда может быть необходимым усиление иммунного ответа против патогенного организма.

Способ может быть использован для снижения дозы антигена, требующейся для получения защитного или терапевтического иммунного ответа или в случаях, когда хозяин не реагирует или минимально реагирует на антиген. Желательное в целом снижение эффективной дозы может быть особенно желательным, когда антиген является токсичным для хозяина, например в случаях аллергий. Способы и применение би- и мультиспецифических молекул, содержащих один или более антигенов или содержащих однo или более мест связывания, например, антитела, взаимодействующего с антигеном, описаны далее в опубликованной международной заявке WO 92/05793.

III. Способы получения мультиспецифических молекул.

Вышеописанные мультиспецифические молекулы могут быть получены рядом способов. Например, обе специфичности могут кодироваться в одном векторе и экспрессироваться и собираться в одной и той же клетке-хозяине. Данный способ особенно применим, если мультиспецифическая молекула представлена слитым белком mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)₂ или лиганд x Fab. Биспецифическая молекула, соответствующая данному изобретению, может быть также биспецифической молекулой из одной цепи, такой как биспецифическое антитело из одной цепи, биспецифическая молекула из одной цепи, содержащая антитело из одной цепи и детерминанту связывания, или биспецифическая молекула из одной цепи, содержащая два места связывания. Мультиспецифические молекулы могут быть также молекулами из одной цепи или могут содержать по меньшей мере две молекулы из одной цепи. Способы получения би- и мультивалентных антител описаны, например, в Патенте США No 5260203, Патенте США No 5455030, Патенте США No 4881175, Патенте США No 5132405, Патенте США No 5091513, Патенте США No 5476786, Патенте США No 5013653, Патенте США No 5258498 и Патенте США No 5482858.

Связывание молекул из одной цепи с их специфическими мишенями может быть подтверждено биспецифическим ELISA, который известен специалистам. Альтернативно каждую специфичность мультиспецифической молекулы можно производить отдельно и химически конъюгировать полученные белки или пептиды друг с другом. Например, два гуманизированных антитела или фрагмента антитела могут быть конъюгированы посредством сульфгидрильного связывания С-конца шарнирных участков двух тяжелых цепей, как описано в Примерах infra.

BsAb, соответствующие данному изобретению, могут быть получены конъюгированием фрагментов против FcR и против мишени с использованием способов, описанных в последующих Примерах или хорошо известных специалистам. Например, для ковалентного конъюгирования может быть использован ряд связывающих или перекрестно сшивающих агентов. Примеры перекрестно сшивающих агентов включают белок А, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см. , например, статьи Karpovsky и соавт., 1984, J. Exp. Med., 160:1686; Liu M.A. и соавт., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:8648). Другие способы включают описанные в работе Paulus (Behring Ins. Mitt., 1985, No 78, стр. 118-132); в статьях Brennan и соавт. (Science, 1985, 229:81-83) и Glennie и соавт. (J. Immunol. , 1987, 139:2367-2375). Примеры других перекрестно сшивающих агентов включают орто-фенилдималеимид (o-PDM), белок А, карбодиимид. В предпочтительном варианте осуществления BsAb агентом для конъюгирования является o-PDM. Другими предпочтительными агентами для конъюгирования являются SATA и сульфо-SMCC, оба имеются у Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

На основании способности связывать несущие FcR иммунные клетки и специфические клетки-мишени данный вариант осуществления мультиспецифической молекулы может быть введен субъекту с целью лечения или профилактики рецидивов ряда заболеваний и состояний, включая рак (например, молочной железы, яичников, семенников, простаты, легкого, головного мозга, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови и лимфатической системы, патогенных инфекций, таких как вирусная (например, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), HTLV (вирус человеческого Т-клеточного лейкоза) и FELV (вирус лейкемии кошек)), простейших (например, Toxoplasma gondii), грибной (например, Candida albicans) и бактериальной (например, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus и Мусоbacterium tuberculosis). Другой аспект изобретения представляет молекулы, которые используют для вакцинации против болезней и рака путем включения антигена из болезнетворных организмов, инфицированных клеток, продуктов генов болезнетворных организмов и раковых клеток. Для данных целей в изобретении представлены композиции, которые являются мультиспецифическими молекулами, связывающими полезный функциональный антиген с детерминантой связывания, которая направляет антиген на иммунную систему. В приведенном в заявке Примере описывают молекулу, которая действует, направляя токсоид столбняка-мишень непосредственно к FcR на моноцитах, что приводит к стимуляции Т-клеток при более низких дозах, чем требуются при использовании свободного токсоида столбняка.

Для применения в терапии эффективное количество подходящей мультиспецифической молекулы может быть введено субъекту любым способом, который позволяет молекулам проявить предусмотренный терапевтический эффект. Предпочтительные способы введения включают пероральное, чрескожное (например, с помощью пластыря), инъекционное (подкожное, внутривенное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутриоболочечное и т.п.). Инъекция может быть осуществлена в ударной дозе или путем непрерывного вливания.

Далее, возможно выделение клеток тканей, например крови, фракционирование и культивирование, если необходимо увеличение числа клеток, обработка ex vivo мультиспецифической мультивалентной композицией в фармацевтически приемлемом носителе и введение обратно пациенту с целью лечения. Во время культивирования и размножения ex vivo могут быть отобраны клетки определенного типа, например популяция моноцитов. Далее, культивируемые ех vivo клетки могут быть на различных стадиях культивирования и размножения ех vivo обработаны агентами для модификации определенных функциональных молекул FcR. Агенты включают, но не ограничиваются ростовыми факторами, цитокинами, лимфокинами, такими как INF-, G-CSF, TNF и GM-CSF и интерлейкинами, такими как IL-2, IL-10 и IL-12.

Мультиспецифическую молекулу вводят в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Как использовано в контексте заявки, фраза “фармацевтически приемлемый носитель” предусматривает включение субстанций, которые могут быть введены совместно с мультиспецифической молекулой и позволяют молекуле выполнять предназначенную функцию. Примеры данных носителей включают растворы, растворители, дисперсные среды, удерживающие агенты, эмульсии и т.п. Использование данных сред для фармацевтически активных веществ (субстанций) хорошо известно в уровне техники и обсуждается infra. Любой другой общепринятый носитель, пригодный для использования вместе с молекулами, входит в объем данного изобретения. Далее, терапия мультиспецифической мультивалентной связывающей молекулой может комбинироваться со схемой лечения другими подобными молекулами или традиционными химиотерапевтическими агентами, такими как цисплатин, АZТ (азидотимидин), DDI (дидезоксиинозин), адриамицин, тетрациклин, цефахлор, нистатин и ацикловир.

Может быть проведен скрининг комбинаторных библиотек для получения членов библиотеки с желаемой активностью связывания и для идентификации активных структур способами, которые были описаны (см., например, Gordon и соавт. , J. Med. Chem., op. cit. (цитируемая работа)). Они включают аффинную хроматографию с подходящим “рецептором” для выделения лигандов к рецептору с последующей идентификацией выделенных лигандов традиционными методами (например, масс-спектрометрией и ЯМР). Предпочтительно, когда растворимый рецептор конъюгирован с меткой (например, флуорофорами, ферментами для спектрофотометрии, радиоактивными изотопами или люминесцентными соединениями), которые могут быть определены с целью установления связывания лиганда. Альтернативно возможно избирательное высвобождение иммобилизованных соединений и обеспечение их диффузии через мембрану для взаимодействия с рецептором.

Комбинаторные библиотеки соединений могут быть также синтезированы с метками, для того, чтобы кодировать идентичность каждого члена библиотеки (см. , например, W. С. Still и соавт., Международная заявка WO 94/08051). Как правило, данный способ предусматривает использование инертных и легко определяемых меток, которые связаны с твердым носителем или с соединениями. После детекции активного соединения идентичность соединения устанавливают идентификацией уникальной сопутствующей метки. Данный способ мечения позволяет синтезировать большие библиотеки соединений, которые могут быть идентифицированы при очень низких уровнях содержания в общем наборе всех соединений в библиотеке.

Специфические связывающие белки с высокой аффинностью к мишеням могут быть получены в соответствии со способами, известными в уровне техники. Например, возможно конструирование белков, которые связывают специфические последовательности ДНК, и белки, которые связывают множество мишеней, особенно белковых мишеней (см. Ladner R.C. и соавт., Патент США 5233409, Ladner R.C. и соавт., Патент США 5403484) могут быть сконструированы и использованы в данном изобретении как детерминанта связывания FcR или как детерминанта связывания мишени соответственно. Далее, способы с использованием данных библиотек могут быть использованы при скрининге для получения мест связывания, которые имитируют структурные детерминанты антител.

В частности, Fv-связывающая поверхность молекулы определенного антитела взаимодействует со своей мишенью в соответствии с закономерностями взаимодействий типа белок-белок, поскольку данные о последовательности для V_H и V_L (последняя из которых может быть цепью типа к или ) являются основой для способов инженерного получения белков, известных специалистам. Детали строения белковой поверхности, которая содержит места связывания, могут быть получены на основе информации о последовательности антитела, полученной путем моделирования с использованием предварительно установленных трехмерных структур других антител, полученных при исследованиях с помощью ЯМР или данных кристаллографии. См., например, работы Bajorath J. и S.Sheriff, 1996, Proteins: Struct. Funct. And Genet., 24(2), 152-157; Webster D.M. и A.R. Rees, 1995, “Molecular modeling of antibody-combining sites” (Молекулярное моделирование комбинированных сайтов антител) в сборнике под ред. S. Paul “Methods in Molecular Biol.” (Методы молекулярной биологии), 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, стр. 17-49, а также Johnson G., Wu Т.Т. и E.A.Kabat, 1995, “Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences” (Раздел: Программа скрининга упорядоченных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей) в “Methods in Molecular Biol.”, 51, op. cit. стр.1-15.

Рак молочной железы и яичников являются зависимыми от половых гормонов формами рака. Опухоли молочной железы могут быть охарактеризованы аномальной экспрессией рецепторов, например рецепторов семейства человеческого EGF-подобного рецептора (HER), в частности HER-2, -3 и -4. Изобретение не ограничивается данными вариантами осуществления HER-антигенов. Природный лиганд HER, герегулин, может быть инкорпорирован в биспецифическое антитело (BsAb) или мультиспецифическую молекулу в качестве средства получения направленности на клетки опухоли молочной железы, экспрессирующие один или более HER-рецепторов при раке. Далее, молекулы герегулина являются детерминантами связывания для гетеродимерных HER-рецепторов, содержащих, например, комбинацию мономеров каждого из HER-2, -3 и -4.

Дополнительные примеры зависимых от половых гормонов форм рака включают рак простаты (работа Smith P. (1995), Cancer Surveys, том 23: Preventing Prostate Cancer (Профилактика рака простаты), Imper. Cancer Research Fund и рак семенников. Рост гормонозависимых форм рака стимулируется мужскими гормонами (например, андрогенами, такими как тестостерон и дигидротестостерон). Удаление яичек (кастрация) была в течение многих лет стандартным способом предупреждения секреции мужских гормонов половыми железами для замедления роста раковой опухоли. В настоящее время секрецию мужских гормонов супрессируют химическими средствами путем нарушения образования лютеинизирующего гормона (LH), который регулирует синтез мужских гормонов. Подобные предположения распространяются на другие зависимые от половых гормонов формы рака, такие как рак молочной железы или яичников. При этом пациентам с данными заболеваниями или из популяции, предрасположенной к данным заболеваниям, обычно не вводят половые гормоны в качестве терапевтического или замещающего средства. Мультиспецифические молекулы, соответствующие изобретению, могут содержать места связывания для половых гормонов с целью снижения их концентрации и супрессии роста опухоли.

В предпочтительном варианте осуществления способы, соответствующие изобретению, включают введение, например, онкологическому пациенту, препарата мультиспецифической мультивалентной молекулы, содержащей по меньшей мере одну детерминанту связывания с аффинностью к опухолевому маркеру или опухолеспецифическому белку рака, который лечат, например к белку нестину при раке головного мозга. Белок нестин, который экспрессируется при нормальном эмбриональном развитии млекопитающего, экспрессируется также на опухолях центральной нервной системы, включая большинство форм рака головного мозга (см. McKay D.G., Ronald, Патент США No 5338839, 8/16/94). Он экспрессируется также на меланомах на коже и на меланомах, метастазирующих в другие органы (см. статью V.A.Florenes, R.Holm, O.Myklebost, U.Lendahl, O.Fodstad, Cancer Res. , 54:354-356, 1994), выявление и лечение которых сопряжены с трудностями. Предпочтительной областью доставки для лечения опухоли головного мозга молекулами, соответствующими данному изобретению, является доставка непосредственно в центральную нервную систему или прямо в головной мозг путем инъекции в спинной мозг или доставка с использованием тонкой иглы. Для метастазирующего рака предпочтительным способом доставки была бы прямая инъекция в кровоток или описанными в заявке способами с использованием крови ex vivo.

Другими типами опухолей, для которых приведены примеры способов, соответствующих изобретению, но не ограниченные ими, являются опухоль Вильмса (A. J.Buckler и соавт. Патент США No 5350840), рак почки у детей, обусловленный присутствием соматической мутации в одной копии гена пациента, в норме обнаруживаемого в двух интактных копиях. Лечение опухоли Вильмса проводят хирургическим путем в 95% случаев, и биспецифический или мультиспецифический связывающий белок, как предполагают, может применяться в качестве вспомогательного терапевтического средства для хирургических пациентов. Другие примеры известных ассоциированных с раком белков, при которых применимы композиции объектов и способов, соответствующих данному изобретению, включают белки, ассоциированные с раком желудочно-кишечного тракта (см. R. Fishel и соавт. Международная заявка WO 95/14085, 05/26/95), которые характеризуются развитием множественной лекарственной устойчивости при химиотерапии (см. J. M. Сrоор и соавт. Патент США No 5198344) и большим числом онкогенов, хорошо известных специалистам, таких как Rb, ras и c-myc, последовательности которых доступны специалистам для анализа. Композиции, соответствующие данному изобретению, подходят, например, для ингибирования секретируемых ферментов, таких как металлопротеиназы матрикса, которые, как считают, потенцируют метастазы опухолей (см. статью Liotta L.A. и соавт., 1991, Cell, 64:327-336). В последнем варианте осуществления мультиспецифическая связывающая молекула с детерминантой связывания для металлопротеиназы матрикса и другой для FcR облегчала бы ингибирование и очистку данных ферментов от активности in situ. При использовании в сочетании со стандартными хирургическими и химиотерапевтическими схемами лечения композиции, как предполагают, уменьшат рецидивы рака и увеличат длительность жизни.

IV. Фармацевтические композиции.

Соединения, соответствующие изобретению, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту in vivo. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит ту или иную мультиспецифическую молекулу (соединение или агент), соответствующую изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель. В еще одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция может вводиться при комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию, соответствующую данному изобретению, с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом по меньшей мере одним антибиотиком по меньшей мере одним цитокином по меньшей мере одной вакциной или другой традиционной терапией. Примеры противоопухолевых агентов включают цисплатин, адриамицин и таксол. Примеры антибиотиков включают изониазид, рифамицин и тетрациклин. Примеры цитокинов включают G-CSF, GM-CSF, интерлейкины и интерфероны. Как используют в данном контексте, термин “фармацевтически приемлемый носитель” включает любой и все растворители, дисперсные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие поглощение агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно, когда носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или накожного применения (например, в виде инъекции или вливания). В зависимости от способа введения активное соединение может находиться в оболочке из материала для защиты соединения от действия кислот и других факторов естественной среды, которые могут инактивировать соединение, или для задержанного выхода.

Термин “фармацевтически приемлемая соль” относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не придает никаких нежелательных токсикологических эффектов (см., например, статью Berge S. M. и соавт. (1977), J. Pharm. Sci., 66:1-19). Примеры данных добавок солей включают соли кислот и оснований. Соли кислот включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная (соляная), азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, иодистоводородная, фосфористая и т.д., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алканоевые кислоты, гидроксиалканоевые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.д. Соли оснований включают соли, полученные из щелочных и щелочноземельных металлов, например натрия, калия, магния, кальция и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N, N’-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.

Композиция, соответствующая данному изобретению, может быть введена рядом известных в уровне техники способов. Специалист оценит, что способ и/или вид введения будет различным в зависимости от желаемых результатов. Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого выхода, например препараты с контролируемым выходом, включая имплантаты, чрескожные пластыри и системы для доставки в микрокапсулах. Возможно использование биодеградируемых биосовместимых полимеров, таких как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Запатентовано и в основном известно специалистам множество способов приготовления данных препаратов. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Системы для доставки лекарственных веществ с задержанным или контролируемым выходом). Под ред. J.R.Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Для введения соединения, соответствующего изобретению, определенными способами введения может быть необходимым помещение соединения в оболочку из материала, препятствующего инактивации, или совместное введение соединения с таким материалом. Например, соединение может быть введено субъекту в подходящем носителе, например в липосомах или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают солевые растворы и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии CGF типа вода-масло-вода, а также традиционные липосомы (см. статью Strejan и соавт. (1984), J. Neuroimmunol., 7:27). Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления непосредственно перед введением стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение данных сред и агентов для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в уровне техники. Кроме случаев, когда какие-либо общепринятые среды или агент несовместимы с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению, является возможным. В композиции могут быть также введены дополнительные активные соединения.

Как правило, терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может представлять собой раствор, микроэмульсию, липосому или иную предписанную структуру, пригодную для получения высокой концентрации лекарственного вещества. Носитель может быть растворителем или дисперсной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, использованием покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть осуществлено путем включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например солей моностеарата и желатина.

Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены введением активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним из вышеперечисленных ингредиентов или их комбинацией соответственно с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Как правило, дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами являются высушивание под вакуумом и высушивание замораживанием (лиофилизация), которая дает порошок активного ингредиента с добавлением какого-либо дополнительного желаемого ингредиента из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрацией.

Схемы дозирования подбирают таким образом, чтобы они обеспечивали оптимальный желаемый ответ (например, ответ на терапию). Например, может вводиться одна ударная доза, может быть введено несколько дробных доз через промежутки времени или доза может пропорционально снижаться или увеличиваться в соответствии с требованиями терапевтической ситуации. Особенно предпочтительным является приготовление композиций для парентерального введения в унифицированной лекарственной форме для простоты применения и единообразия дозирования. Унифицированная лекарственная форма, как использовано в контексте заявки, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве разовых доз субъектам, которых предполагают лечить; каждая единица содержит определенное количество активного соединения, которое рассчитано для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Определение унифицированных лекарственных форм, соответствующих изобретению, диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и определенного терапевтического эффекта, который предполагают получить, и (b) ограничений, связанных в уровне техники с рецептурами таких активных соединений для лечения чувствительности у субъектов.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, натрия бисульфат, натрия метабисульфит, натрия сульфит и т.п.; (2) растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбила пальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, -токоферол и т.п. и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

В плане терапевтических композиций препараты, соответствующие данному изобретению, включают композиции, пригодные для перорального, назального, наружного (в том числе защечного и подъязычного), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Препараты могут быть, как принято, представлены в унифицированных лекарственных формах и могут быть приготовлены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. Количество активного ингредиента, которое может быть смешано с материалом носителя для разовой лекарственной формы будет изменяться в зависимости от субъекта, проходящего лечение, и определенного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может быть смешано с материалом носителя для получения разовой лекарственной формы будет, как правило, представлено количеством композиции, которое дает терапевтический эффект. В основном данное количество будет находиться в интервале от приблизительно 0,01% до приблизительно 99% активного ингредиента из ста процентов, предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 30%.

Чрескожные пластыри имеют преимущество в обеспечении контролируемой доставки соединения, соответствующего данным терапевтическим изобретениям, в организм. Данные лекарственные формы могут быть приготовлены путем растворения или диспергирования композиции в соответствующей среде. Возможно также использование усилителей впитывания для улучшения прохождения композиции через кожу. Скорость данного прохождения может контролироваться либо присутствием контролирующей скорость мембраны или диспергированием композиции в полимерном матриксе или геле. Устройства, в том числе пластыри для чрескожной доставки композиции посредством ионофореза или другие способы с применением электричества, также могут быть использованы в данном изобретении, включая, например, устройства, описанные в Патентах США Nо 4708716 и 5372579.

Выражения “парентеральное введение” и “вводится парентерально” в данном контексте означают способы введения, отличные от энтерального и наружного применения, обычно путем инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субэпидермальную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, использованием создающих оболочку материалов, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ.

Данные композиции могут также содержать адъюванты и консерванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение появления микроорганизмов может обеспечиваться как стерилизационными процедурами, supra, так и введением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Может быть желательным также включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть получено за счет введения агентов, которые замедляют всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

При применении соответствующих данному изобретению соединений в качестве фармацевтических препаратов они могут вводиться отдельно или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,01 до 99,5% (более предпочтительно от 0,1 до 90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Независимо от выбранного способа введения соответствующие данному способу соединения, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, соответствующие данному изобретению, готовят в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм традиционными способами, известными специалистам.

Обычный врач или ветеринар может легко определить и прописать эффективное количество необходимой фармацевтической композиции. Например, врачу или ветеринару следует начинать с более низких доз соответствующих изобретению соединений, используемых в фармацевтических композициях, чем дозы, требующиеся для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозировку до получения желаемого эффекта. Как правило, подходящая дневная доза соответствующих изобретению композиций будет представлена таким количеством соединения, которое является самой низкой дозой, эффективной для получения терапевтического действия. Данная эффективная доза будет в основном зависеть от вышеописанных факторов. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное (предпочтительно около области мишени) введение. Если желательно, эффективная дневная (суточная) доза терапевтических композиций может вводиться в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, которые вводят раздельно через надлежащие интервалы в течение дня (необязательно) в унифицированных лекарственных формах. Хотя соединение, соответствующее данному изобретению, может быть введено одно, предпочтительным является введение соединения в виде фармацевтического препарата (композиции).

Терапевтические композиции могут быть введены с помощью медицинских устройств, известных в уровне техники. Например, в предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция, соответствующая изобретению, может быть введена с помощью безыгольного гиподермического инъекционного устройства, такого как устройства, описанные в Патентах США Nо 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, используемых в данном изобретении, включают: Патент США No 4487603, в котором описан имплантируемый насос для микровливаний с целью введения лекарственного препарата с контролируемой скоростью; Патент США No 4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; Патент США No 4447233, в котором описан насос для вливания лекарственного препарата с целью доставки препарата при точной скорости вливания; Патент США No 4447224, в котором описано имплантируемое устройство для вливаний с изменяющимся потоком для непрерывного введения лекарственного вещества; Патент США No 4439196, в котором описана осмотическая система для доставки лекарственных веществ с многокамерными отделениями, и Патент США No 4475196, в котором описана осмотическая система для доставки лекарственных веществ. Данные патенты включены в заявку в виде ссылки. Специалистам хорошо известно много других подобных имплантатов, систем для доставки и модулей.

В ряде вариантов осуществления соединения, соответствующие изобретению, могут быть приготовлены так, чтобы обеспечить надлежащую локализацию in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие соединения с высокой гидрофильностью. Чтобы обеспечить прохождение терапевтических соединений, соответствующих изобретению, через ВВВ (если это желательно), они могут быть приготовлены, например, в липосомах. Относительно способов производства липосом см. , например, Патенты США No 4522811, 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более структур, которые избирательно транспортируются в специфические клетки или органы, увеличивая таким образом направленную доставку лекарственных веществ (см., например, статью V. V.Ranade (1989), J. Clin. Pharmacol., 29:685). Примеры направленных структур включают фолат или биотин (см., например, Патент США 5416016, выданный Low и соавт. ); маннозиды (Umezawa и соавт. (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun. , 153:1038); антитела (P.G.Bloeman и соавт. (1995), FEBS Lett. 357: 140; M. Owais и соавт. (1995), Antimicrob. Agents Chemother., 39:180); рецептор поверхностно-активного белка A (Briscoe и соавт. (1995), Am. J. Physiol. , 1233: 134), различные виды которых могут содержать препараты, соответствующие изобретению, а также компоненты заявленных молекул; р120 (см. статью Schreier и соавт. (1994), J. Biol. Chem., 269:9090); см. также K.Keinanen; M.L. Laukkanen (1994), FEBS Lett., 346:123; J.J.Killion, I.J.Fidler (1994), Immunomethods, 4:273. Водном варианте осуществления изобретения соответствующие изобретению терапевтические соединения готовят в липосомах, в более предпочтительном варианте осуществления липосомы включают направленную структуру. В наиболее предпочтительном варианте осуществления терапевтические соединения в липосомах доставляют инъекцией ударной дозы в области, близкой к опухоли или инфекции. Композиция должна быть жидкой до такой степени, чтобы она легко вводилась с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть предохранена от загрязнения такими микроорганизмами, как бактерии и грибы.

“Терапевтически эффективная доза” предпочтительно ингибирует рост опухоли или инфекцию патогена по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% относительно нелеченых субъектов. Способность соединения ингибировать рак или инфекционное заболевание может быть оценена в системе модели на животном, прогнозирующей эффективность в отношении опухолей и инфекционных заболеваний человека. Альтернативно данное свойство композиции может быть оценено исследованием способности соединения подавлять данное ингибирование in vitro способами, хорошо известными специалисту-экспериментатору. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли, препятствовать или задерживать гибель инфицированных тканей или органов, снижать лихорадочное состояние или число белых кровяных клеток, повышать число CD4 или иным образом облегчать симптомы у субъекта. Специалист смог бы определить данные количества на основе таких факторов, как масса субъекта, острота симптомов у субъекта, а также состав композиции или выбранный способ введения.

Далее изобретение иллюстрируют следующими примерами, которые не должны быть истолкованы как дальнейшее ограничение. Содержание всех ссылок, находящихся на рассмотрении патентных заявок и опубликованных патентов, приведенных в данной заявке, полностью входит в данную заявку в виде ссылки.

ПРИМЕРЫ
Следующие методы, описанные в разделе Материалы и Методы, используют в нижеприведенных Примерах.

Материалы и Методы
Клеточные линии и моноклональные антитела
Линию клеток мышиной гибридомы, продуцирующую антитело против FcR, используют для конструирования композиций BsAb, описанных здесь как А77 (см. статью Monteiro и соавт., 1992, J. Immunol., 148:1764-1770), могут быть также использованы другие линии клеток гибридомы против FcRI с аналогичными или близкими А77 свойствами, такие как A3, А59 и А62 (см. статью Monteiro, 1992). Линия гибридомных клеток для антитела анти-HER-2/neu, 520С9 (см. статью Frankel А. и соавт. , 1985, J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286) имеется в American Type Culture Collection, ATCC, 12301, Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, регистрационный номер НВ8696). Антитело Н425 представляет собой гуманизированное антитело против EGF-R (см. статью Kettlesborough С. и соавт., 1991, Prot. Eng., 4:773-783). Гибридома СС49 (против TAG 72) получена из ATCC (регистрационный номер НВ 9459). mAb-продуцирующие клеточные линии культивируют в модифицированной Iscove среде Dulbecco (IMDM, Gibco BRL, Grand Island, NY) с добавлением 10% сыворотки телячьих эмбрионов (FBS). Препараты mAb очищают из супернатантов соответствующих гибридом аффинной хроматографией с использованием белка A (Bio-Rad, Richmond, CA).

SKBR-3 (см. статью Backman и соавт., Cancer Res., 54:2456-2461), клеточную линию карциномы молочной железы человека и SKOV-3 (карцинома яичников), которая обладает сверхэкспрессией протоонкогена HER-2/neu, получают из АТСС. Клеточные линии со сверхэкспрессией EGF-R A431 (карцинома кожи), HN5 (карцинома головы и шеи) и MDA-MB-468 (карцинома молочной железы) получают из АТСС. Линии опухолевых клеток культивируют в модифицированной Iscove среде Dulbecco (IMDM, Gibco BRL, Grand Island, NY) с добавлением 10% сыворотки телячьих эмбрионов (FBS). Линию моноцитоидных клеток U937 (J. Immunol., 136: 1641-1647, 1986), которая экспрессирует FcR получают из АТСС и выращивают в RPMI-1640 с добавлением 10% FBS (Gibco BRL, Grand Island, NY).

Candida albicans (штамм АТСС 448585) выращивают в мальтозном бульоне Сабуро (Difco, Detroit, MI).

Получение клеток крови
Лейкоциты получают из гепаринизированной цельной венозной крови или путем афереза у здоровых добровольцев. Цельную кровь разводят RPMI, содержащей 5% декстрана, в соотношении 2,5:1 (об./об.). После седиментации эритроцитов в течение 45 минут на льду клетки в супернатанте переносят в новую пробирку и осаждают центрифугированием. Остаточные эритроциты удаляют гипотоническим лизисом. Оставшиеся лимфоциты, моноциты и нейтрофилы хранят на льду до использования в анализах связывания. Для ряда экспериментов нейтрофилы отделяют от мононуклеарных клеток градиентным разделением в фиколл-гипак (среда для фракционирования клеток крови) (Pharmacia-Upjohn, Piscataway, NJ). Моноциты обогащают из мононуклеарных клеток путем холодной агрегации и осаждения в градиенте сыворотки телячьих эмбрионов. Культуры моноцитов используют только что приготовленными или инкубируют при 37^oС и 5% СО₂ в течение от 24 до 48 часов в тефлоновых чашках при концентрации 410⁶ клеток/мл MSFM, содержащей 2,0% нормальной человеческой сыворотки типа АВ (Sigma, St. Louis, МО) и 500 IRU/мл IFN- (R&D Systems, Minneapolis, MN). Нейтрофилы культивируют в течение от 24 до 48 час (37^oС, 5% CO₂) в среде AIM V (Gibco/BRL, Grand Island, NY) с 50 нг/мл G-CSF (любезно предоставлен R. Repp, U. of Erlanger, Germany) и 500 IRU/мл IFN-.

Связывание с помощью поточной цитометрии
Связывание BsAb с FcR и HER-2/neu оценивают поточной цитометрией. Различные концентрации BsAb, разведенные в PBS (фосфатный буфер), рН 7,4, содержащем 2 мг/мл BSA (бычий сывороточный альбумин) и 0,05% NaN₃ (РВА), инкубируют с клетками SKBR-3 или лейкоцитами человека в течение 1 часа при 0^oС. Клетки промывают РВА и инкубируют с меченным фикоэритрином козьим антителом против мыши в течение одного часа при 0^oС. Клетки промывают и фиксируют 1% параформальдегидом и анализируют ассоциированную с клетками флуоресценцию на FACScan Becton Dickinson (Mountain View, CA).

Чтобы оценить, нарушает ли связывание с IgA связывание с mAb A77, инкубируют A77 с обработанными TNF клетками в присутствии избытка человеческого IgA и сравнивают с контролями, инкубируемыми без IgA. Связывание A77 определяют, как указано выше, с помощью меченного фикоэретрином козьего антитела против мыши. Клетки промывают и фиксируют 1% параформальдегидом и анализируют ассоциированную с клетками флуоресценцию на FACScan Becton Dickinson. Кроме того,
связывание человеческого IgА с клетками U937 оценивают в присутствии mAb 77 и сравнивают с контролями при отсутствии избытка mAb 77. Связывание IgA определяют с FIТС-меченым антителом IgA против человека.

Способ связывания BsAb
Препараты BsAb конструируют, используя способ Glennie и соавт. (см. работу в J. Immunol. , 1987, 139:2367-2375). Антитела mАbА77 (против FcR), 520С9 (против HER-2/neu), CC49 (против TAG 72) и Н425 (против EGF-R) получают путем культивирования in vitro соответствующей линии клеток гибридомы. Каждый из препаратов антител расщепляют пепсином для получения препаратов F(ab’)₂ с последующим превращением в Fab’ путем добавления 10 мМ меркаптоэтаноламина (МЕА) и инкубирования в течение 30 мин при 30^oС. Фрагменты Fab’ наносят на колонку Sephadex G-25 ^{(Pharmacia-Upjohn, Piscataway, NJ), уравновешенную 50 мМ ацетатом натрия, 0,5 мM EDTA, рН 5,3 (4oС). Половину объема орто-фенилендималеимида (о-PDM, 12 мM), растворенного в диметилформамиде и охлажденного на бане со смесью метанол/лед, добавляют к Fab’ 520C9 и инкубируют смесь в течение 30 мин при 0oС. Затем Fаb’-малеимид отделяют от свободного o-PDM на колонке с Sephadex G-25, уравновешенной 50 мМ ацетатом натрия, 0,5 мM EDTA, рН 5,3 (4oС).}

Для приготовления BsAb Fab’ 520С9-малеимид вносят в эквимолярный раствор Fab’ A77. Реагенты концентрируют в атмосфере азота до исходного объема, используя мембрану Diaflo ^{в камере Amicon (Lexington, MA) при 4oС в течение 18 час. Затем рН подводят до 8,0 с помощью 1М трис-HCI, рН 8,0, восстанавливают смесь 10 мМ МЕА (30 мин, 30oС) и алкилируют 25 мМ иодацетамида. А77ХСС49 и А77ХН425 получают аналогичными способами. Полученный препарат биспецифического F(ab’)₂ отделяют от непрореагировавших Fab’ и других материалов, используя колонку Superdex 200 (Pharmacia-Upjohn, Piscataway, NJ), уравновешенную PBS.}

Анализ BsAb A77X520C9 с помощью ВЭЖХ показывает, что данное BsAb содержит две основные структуры: 75-85% гетеродимера F(ab’)₂ (мол. масса 100 кД, 10,43 мин) и 15-25% гетеротримера F(аb’)₃ (~150 кД, 9,86 мин) (Фигура 1). На основе данного способа получения ожидают, что F(аb’)₃ содержит два F(ab’) 520C9 и один F(ab’) A77. Контрольный эксперимент, в котором производное F(ab’)-o-PDM инкубируют без недериватизированного второго F(ab’), подтверждает, что производное F(ab’)-o-PDM не образует перекрестные сшивки со своей молекулой, поскольку шарнирные SH-группы заняты o-PDM и отсутствуют свободные SH-группы, пригодные для связывания (данные не представлены). Таким образом структуры F(аb’)₂ и F(аb’)₃ в данных препаратах BsAb являются гетеродимерными комплексами фрагментов F(ab’) с двумя различными специфичностями.

Антитело-зависимая клеточная токсичность (ADCC)
Клетки карциномы молочной железы человека SKBR-3 с суперэкспрессией HER-2/neu используют в качестве клеток-мишеней для определения лизиса с помощью мультиспецифических композиций, содержащих места связывания для HER-2/neu. Другие линии клеток-мишеней используют в тестах молекул с другими антигенсвязывающими детерминантами, например, клетки А431 для EGF-R, KLEB для TAG 72 и т. д. Образцы эффекторных клеток получают при использовании гепаринизированной цельной крови, очищенных нейтрофилов (очищают, как описано supra) или моноцитов, приготовленных из Leukopaks^{, получаемых от Advanced Biotechnologies Inc. (Columbia, MD), как описано выше (статья Guyre P.M. и соавт., 1989, J. Immunol., 193:1650). При приготовлении для использования в качестве эффекторных клеток моноциты культивируют в контейнерах Teflon в бессывороточной среде для макрофагов (Gibco/BRL), содержащей 2% человеческой сыворотки, в течение от 24 до 48 час. Клетки-мишени метят 100 мкКи 51Сг за 1 час до смешивания с эффекторными клетками и антителами в планшете для микротитрования с U-образным дном. После инкубирования в течение от 16 до 18 час при 37oС супернатанты из каждой лунки собирают и анализируют на радиоактивность. Цитотоксичность вычисляют по формуле: % лизиса = (экспериментальное значение СРМ – СРМ утечки мишени/СРМ лизиса от детергента – СРМ утечки мишени) x 100%. Далее, специфический лизис =% лизиса с антителом – % лизиса без антитела. Анализы проводят в трех повторностях.}

Обработка антител флуоресцеином
рН раствора mAb доводят до 9,3 добавлением 0,1 М Na₂CO₃. Изотиоцианатфлуоресцеина (FITC, Sigma, St. Louis, МО) растворяют в ДМСО (диметилсульфоксид) в концентрации 2 мг/мл. 40 мкг FITC добавляют на каждый миллиграмм mAb и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре. Флуоресцеинированные mAb отделяют от свободного FITC хроматографией на G-25.

Модуляция FcR с помощью А77
Способность mAb A77 модулировать число FcR на поверхности человеческих моноцитов оценивают путем инкубирования моноцитов с различными разведениями MAb A77 при 37^oС в течение 18 час (или с mAb 520С9 в качестве изотипического контроля). Затем моноциты промывают РВА и инкубируют в течение одного часа при 0^oС в присутствии человеческого сывороточного IgA в концентрации 100 мкг/мл. Затем клетки промывают РВА и определяют связывание IgA с FcR с помощью меченных FITC антител IgA против человека. Процент модуляции = 1 – (МFI образца/МFI контроля) х 100%, где МFI – средняя интенсивность флуоресценции.

BsAb-обусловленный фагоцитоз
Анализ связанного с моноцитами и нейтрофилами фагоцитоза клеток SKBR-3 проводят с клетками SKBR-3-мишенями, меченными липофильным красным флуоресцентным красителем РКН 26. Клетки светлого слоя кровяного сгустка, очищенные из гепаринизированной цельной крови, содержащие моноциты, нейтрофилы и лимфоциты, инкубируют с мечеными мишенями при 37^oС в течение 6 час в отсутствие и в присутствии BsAb. Моноциты и нейтрофилы окрашивают мечеными FITC mAb против CD14 (AML-2-23) при 0^oС, и клетки промывают и анализируют по двухцветной флуоресценции с помощью FACScan. Процент фагоцитоза выражают как процент эффекторных клеток (моноцитов или нейтрофилов), которые ассоциированы с окрашиванием РКН 26.

Пример 1. Биспецифическое антитело А77Х520С9 связывает эффекторные клетки.

Для определения эффективности биспецифической молекулы BsAb А77Х520С9 при киллинге (цитолизе) клеток рака молочной железы у пациента определяют их способность специфически связывать клетки рака молочной железы в культуре. В данных экспериментах используют клетки линии SKBR-3 со сверэкспрессией онкогена HER-2/neu. Место связывания 520С9 получают из мышиной гибридомы против HER-2/neu (см. статью Frankel А. и соавт., 1985, J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286).

На Фигуре 2 показано, что BsAb A77X520C9 связывает каждый из двух типов эффекторных клеток, нейтрофилов (PMN) и моноцитов. На Фигуре 3 представлено, что в цельной крови BsAb A77X520C9 связывает FcRI-экспрессирующие PMN и моноциты, но не связывают РсR-отрицательные лимфоциты. Данная активность связывания не ингибируется физиологическими уровнями сывороточного IgA в цельной крови, что является достаточным для насыщения всех FcRI, экспрессирующихся in vivo.

Пример 2. Биспецифическое антитело A77X520C9 связывает клетки-мишени рака молочной железы.

BsAb A77X520C9 связывает клетки-мишени опухоли молочной железы SKBR-3, выделенные из опухоли молочной железы (Фигура 4) в той же самой степени, что ранее описанные BsAbMBX210 (см. статью Valone и соавт., 1995, J. Clin. Oncol. , 13(9): 2281-2292). Обнаруживают, что средняя интенсивность флуоресценции (MFI), как мера связывания, возрастает как функция концентрации BsAb, когда клетки опухоли молочной железы инкубируют с каждой из концентраций 0,1, 1,0 или 10 мкг/мл. Фракция BsAb A77X520C9, связанного с клетками опухоли молочной железы-мишени, равна или превышает фракцию контрольных MDX210 (Фигура 4), а связывание эффекторных клеток (Фигура 2) подобно функции концентрации каждого из BsAb.

Следующие данные, представляющие связывание BsAb A77X520C9 с НЕR-2/nеu-положительными клетками SKBR-3, приводят на Фигуре 5. Как ожидается, только BsAb и F(аb’)₂ 520C9, но не контрольный F(ab’)₂ A77 связывают клетки рака молочной железы-мишени. Данные представляют на Фигурах 7-12 для ряда эффекторных клеток, препаратов нескольких независимых биспецифических антител и различных концентраций разных препаратов BsAb.

Пример 3. Биспецифическое антитело А77ХН425 связывает клетки-мишени карциномы кожи.

Моноклональное антитело Н425 является специфическим в отношении рецептора EGF (EGF-R), которое отличается сверхэкспрессией на клеточных линиях, полученных из карциномы кожи (А431) и MDA-MB468 (карцинома молочной железы). Биспецифическую молекулу А77ХН425, которая несет детерминанту связывания для EGF-R и для FcRI, получают тем же способом химического связывания, что A77X520C9, и тестируют на связывание клеток-мишеней описанными в заявке способами.

Аналогично связыванию A77X520C9 с НЕR-2/nеu-несущими клетками-мишенями, представленному в Примере 2 и на Фигурах 2-5, на Фигуре 6 показано, что опухолеспецифичность EGF-R антитела BsAb А77ХН425 вызывает связывание данной молекулы с опухолевыми клетками А431, которые отличаются сверхэкспрессией EGF-R. Далее, связывающая опухоль детерминанта F(ab’)₂ H425, но не F(ab’)₂ A77, которая несет детерминанту связывания FcRI, связывает клетки-мишени А431, которые отличаются сверхэкспрессией EGF-R.

Пример 4. Связывание биспецифического антитела А77Х520С9 обусловливает цитолиз эффекторными лейкоцитами НЕR-2/neu-несущих клеток-мишеней.

После определения способности А77Х520С9 связывать клетки опухоли молочной железы устанавливают также его способность связывать как клетки-мишени, так и специфические лейкоциты, так что происходит цитолиз клеток опухоли молочной железы. Таким образом антитело-зависимый цитолиз клеток (ADCC), обусловленный биспецифическими антителами (BsAb, называемыми также биспецифическими молекулами, BSM), соответствующими изобретению, представляют на Фигурах 7-16, как процент цитотоксичности или процент лизиса.

Как показано на Фигуре 7, цитотоксичность клеток SKBR-3, обусловленная А77Х520С9 и нейтрофилами как эффекторными клетками (PMN), варьирует от 6 до 9% при концентрации 0,1 мкг/мл и повышается до 20 – 30% при концентрации 1,0 мкг/мл. Аналогичные данные представлены для киллинга, обусловленного эффекторными клетками в цельной крови, на Фигуре 8. На Фигуре 9 показывают, что добавление также FcRI-связывающего F(ab’)₂ A77, но не FcRI-детерминанты F(ab’)₂ M22, ингибирует данную цитотоксичность, связанную с BsAb.

Для терапевтического лечения субъектов с помощью мультиспецифических мультивалентных химических композиций, которые вводят прямо в кровоток, требуется, чтобы данные агенты обладали активностью в цельной крови. Способность к функционированию в цельной крови, т.е. к участию в цитолизе, представлена на Фигуре 8, где показано, что препараты А77Х520С9 участвуют в цитолизе культивируемых клеток опухоли молочной железы эффекторными клетками крови. При концентрации 0,1 мкг/мл А77Х520С9 лизирует между 15 и 20% опухолевых клеток, а при концентрации 1,0 мкг/мл цитолиз составляет приблизительно от 25 до 30% клеток опухоли молочной железы. Хотя цельная кровь содержит IgA в концентрации от 2 до 5 мг/мл, эти результаты показывают также, что IgA не ингибирует цитотоксическую активность данного BsAb. Данные результаты показывают, что BsAb может быть доставлен для терапевтического применения in vivo.

Связанную с BsAb деструкцию опухолевых клеток FcRI-экспрессирующими цитотоксическими эффекторными клетками исследуют, используя только что очищенные эффекторные клетки (моноциты и PMN), а также цельную кровь в качестве источника эффекторных клеток. На Фигуре 10 показано, что BsAb A77X520C9 вызывает до 37% BsAb-зависимого лизиса НЕR-2/neu-положительных клеток SKBR-3 очищенными PMN (нейтрофилами). Данная цитотоксическая активность является доза-зависимой и насыщается при концентрации 1,0 мкг/мл BsAb. На Фигуре 11 показано, что A77X520C9 вызывает до 40% BsAb-зависимого лизиса клеток SKBR-3 при использовании очищенных моноцитов в качестве эффекторных клеток. Наконец, BsAb A77X520C9 вызывает до 40% BsAb-зависимого лизиса тех же самых клеток-мишеней при использовании цельной крови в качестве источника эффекторных клеток (Фигура 12). В данных, представленных на Фигурах 10-12, F(ab’)₂ A77 с детерминантой связывания для FcRI ингибирует активность ADCC данного BsAb, но F(аb’)₂ M22 против CD64 с детерминантой для FcRI не ингибирует ее. Неспецифический лизис (в отсутствие BsAb) в данных экспериментах составляет приблизительно 10%.

Аналогичным образом BsAb A77X520C9 участвуют в лизисе другой опухолевой линии со сверхэкспрессией HER-2/neu SKOV-3 (линия карциномы яичников) в анализе с использованием ADCC цельной крови.

Пример 5. Связывание биспецифического антитела А77Х5Н425 обусловливает цитолиз эффекторными лейкоцитами EGF-R-несущих клеток-мишеней.

Аналогично данным, представленным для BsAb к опухолевому антигену HER-2/neu, BsAb A77XH425 с детерминантой аффинности для EGF-R обусловливает до 52% BsAb-зависимого лизиса опухолевых клеток-мишеней А431 очищенными PMN в качестве эффекторных клеток (Фигура 13), до 55% BsAb-зависимого лизиса очищенными моноцитами в качестве эффекторных клеток (Фигура 14) и до 43% BsAb-зависимого лизиса цельной кровью в качестве источника эффекторных клеток (Фигура 15). В данных экспериментах F(ab’)₂ A77, но не F(аb’)₂ M22, ингибирует цитотоксическую активность. Неспецифический лизис (в отсутствие BsAb) составляет приблизительно 10%.

Данные результаты показывают, что BsAb A77X520C9 могут связывать как эффекторные, так и НЕR-2/nеu-несущие клетки-мишени и могут обусловливать цитолиз очищенными нейтрофилами и моноцитами и данными эффекторными клетками в цельной крови. Лимфоциты в цельной крови не связывают BsAb. Далее, BsAb A77XH425 могут связывать клетки-мишени со сверхэкспрессией EGF-R и обусловливать цитолиз данных клеток в присутствии эффекторных клеток.

В анализах ADCC цельной крови наблюдают BsAb А77ХН425-зависимый лизис (40-50% цитолиз) HN5 (линия карциномы головы и шеи) и MDA-MB468 (линия карциномы молочной железы), которые экспрессируют EGF-R на сравнимых с А431 (карцинома кожи) уровнях.

Пример 6. Биспецифическое антитело 72ХА77 против TAG обусловливает цитолиз TAG 72-несущих опухолевых клеток.

Вышеописанные Примеры показывают, что препараты BsAb являются эффективными для получения цитолиза клетки линии клеток, выделенной из опухолей, несущих опухолевые антигены HER-2/neu и EGF-R. Для расширения потенциального применения BsAb готовят другую композицию с детерминантой связывания для опухолевого маркера TAG 72 с помощью метода связывания, описанного supra. Мышиный антиген TAG 72 обнаруживают в большинстве случаев рака молочной железы, толстой кишки, яичников и других форм. Имеется ряд антител, которые специфически связывают TAG 72, например, моноклональное антитело, образуемое гибридомой СС49 (АТСС НВ 9459, Mezes P. и соавт., Международная заявка WO 90/04410).

СС49 связывают с А77 для получения BsAb 72XA77 против TAG с целью обеспечения специфической направленности опухолевых клеток-мишеней, несущих антиген TAG 72, к эффекторным клеткам, несущим FcR. На Фигуре 16 представляют вызванную нейтрофилами антитело-зависимую цитотоксичность TAG 72-несущих опухолевых клеток, обусловленную BsAb 72ХА77 (конструируемых из антител mAb CC49 и А77) против TAG, в виде функции от концентрации (в мкг/мл). Результаты на Фигуре 16 показывают, что BsAb 72XA77 против TAG обусловливают цитолиз опухолевых клеток в степени, близкой действию BsAb A77X520C9 в отношении клеток, несущих HER-2/neu и А77ХН425 в отношении клеток, несущих EGF-R, как показано на предшествующих Фигурах.

В целом, Примеры 1-6 демонстрируют цитолиз опухолевых клеток, несущих три различных опухолевых антигена, обусловленный биспецифическими молекулами, соответствующими изобретению. Данные Примеры и другие исследования, которые проводят с использованием клеточных линий, взятых из опухолей молочной железы, карциномы кожи, карциномы желудка, карциномы головы и шеи и карциномы яичников, показывают, что FcRI-направленные препараты BsAb, соединенные с детерминантами связывания для ряда опухолевых антигенов, могут широко применяться при многих злокачественных новообразованиях. Данное заключение является важным, поскольку ограничение антигеном-мишенью FcR-обусловленной ADCC-активности PMN описывают для антигенов, ассоциированных с В-клеточной лимфомой (см. статью D. и соавт., 1996, Blood, 879:3803-3812).

Пример 7. Необходимость доступа к FcR через детерминанту связывания А77 для цитолиза с помощью BsAb.

Для демонстрации того, что обусловленный BsAb цитолиз клеток-мишеней происходит вследствие распознавания FсR детерминантой связывания А77, цитолиз с помощью BsAb исследуют в присутствии F(ab’)₂A77, что показано на Фигурах 9-15. Если действие BsAb-цитолиза обусловлено связыванием с FcR благодаря детерминанте связывания, выделенной из А77, то добавление F(ab’)₂ A77, но не антитела с другой детерминантой связывания рецептора, могло бы вызвать ингибирование цитолиза клеток опухоли молочной железы.

Результаты, представленные на Фигурах 9-15, показывают, что обусловленный BsAb цитолиз функционирует путем связывания с FcRI с помощью полученной из A77 детерминанты связывания. На Фигурах 9-12 добавление F(ab’)₂ A77 к смеси А77Х520С9, клеток-мишеней и эффекторных клеток вызывает ингибирование цитолиза, тогда как аналогичное добавление антитела, которое не затрагивает FcRI, не оказывает воздействия на уровень цитолиза. На Фигурах 13-15 представляют такой же результат для цитолиза опухолевых клеток, связанный с BsAb A77XH425: ингибирование наблюдают в присутствии 50 мкг/мл F(ab’)₂ A77, но не в присутствии 50 мкг/мл F(аb’)₂ М22. F(ab’)₂ M22 специфически связывает другой рецептор, FcRI-рецептор (см. статью Valone и соавт., 1995, J. Clin. Oncol., 13:2281-2292).

Данные результаты показывают, что участие антител BsAb A77X520C9 и A77XH425 в цитолизе опухолевых клеток зависит от специфического связывания BsAb с FcRI на эффекторных клетках. Далее, обнаружено, что ингибирование киллинга с помощью BsAb посредством F(ab’)₂ A77 не зависит от природы эффекторных клеток.

Пример 8. Стимуляция роста Т-клеток путем презентации антигена с использованием биспецифического антитела.

Для применения BsAb для доставки антигена используют следующий способ соединения места связывания FcRI антитела mAb A77 с токсоидом столбняка. Очищенный токсоид столбняка (ТТ, Accurate Chemical and Scientific Company, Westbury, NY) реагирует с сульфосукцидимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (s-SMCC, Pierce, Rockford, IL) в молярном соотношении 20 SMCC: 1TT в течение двух часов при комнатной температуре. Свободный SMCC удаляют из смеси ТТ:SМССG-25-хроматографией. Фрагмент F(ab’)₂ антитела mAb A77 превращают в Fab’ инкубированием в присутствии 5 мМ меркаптоэтиламина (МЕА, Sigma, St. Louis, МО) в течение 30 мин при 30^oС. Свободный МА удаляют из Fab’ хроматографией на G-25. Fab’ A77 инкубируют с комплексом SMCC-TT в течение двух часов при комнатной температуре с последующим инкубированием в течение ночи при 4^oС. Конъюгат А77-ТТ очищают от несвязанного Fab’ гель-фильтрацией на Superdex ^{200 (Pharmacia-UpJohn, Piscataway, NJ).}

Для анализа пролиферации Т-клеток после презентации антигена получают линии ТТ-специфических Т-клеток от иммунизированных субъектов, как описано ранее (см. статью Gosselin E.J. и соавт., J. Immunol., 179:3477, 1992), моноциты очищают холодной агрегацией, как описано ранее (см. статью Guyre P.M. и соавт. , J. Immunol., 143:1650,1989). Т-клетки (50 мкл при концентрации 10⁶/мл) и аутологичные моноциты (50 мкл при концентрации 5 x 10⁵/мл) вносят в лунки 96-луночного планшета для культуры тканей в присутствии различных концентраций ТТ или А77-ТТ и инкубируют при 37^oС в инкубаторе с СО₂. Относительное число Т-клеток в каждой лунке оценивают после инкубирования в течение четырех дней путем измерения лактатдегидрогеназы (LDH), выходящей из клеток после лизиса, с помощью набора, приобретаемого у Promega (Madison, WI). Уровни LDH количественно определяют спектрофотометрически после добавления субстрата и прекращающего реакцию раствора. Оптическую плотность определяют при длине волны 490 нм, используя планшет-ридер для ELISA (Molecular Devices, Palo Alto, CA).

Каждая представляющая данные точка, приведенная на Фигуре 17, является средним по четырем образцам значением результата за вычетом величины фона (моноциты и Т-клетки в присутствии только среды). Конъюгат А77-ТТ индуцирует равную пролиферацию Т-клеток при дозах антигена, которые в 30-100 раз ниже, чем дозы несвязанного ТТ. Данные результаты показывают, что направленность антигена ТТ на FcRI путем связывания с mAb A77 определенно повышает презентацию ТТ на моноцитах относительно ТТ-специфических Т-клеток. Аналогичная презентация антигена может быть достигнута с помощью антигенов, вызывающих аллергии, таких как антиген клещей, обитающих в пыли, и антигены кошек и собак, а также с помощью презентации вакцинного антигена, такого как антиген малярии, птичьей оспы, вируса гепатита С и других вирусов гепатита не-А не-В.

Пример 9. Биспецифическое антитело связывает клетки-мишени и вызывает фагоцитоз с помощью эффекторных клеток.

Для демонстрации участия BsAb в фагоцитозе проводят следующие эксперименты для определения уровня, до которого эффекторные клетки подавляют клетки опухоли молочной железы и фрагменты клеток SKBR-3 в присутствии BsAb A77X520C9. Данные исследования определяют фагоцитоз SKBR-3 нейтрофилами, моноцитами и макрофагами из моноцитов (MDM). Фагоцитоз опухолевых клеток, обусловленный FcRI, не описан.

Опухолевые клетки метят перед обработкой лейкоцитами липофильным красным флуоресцентным красителем РКН26. После инкубирования эффекторных клеток с клетками-мишенями в течение 6 час эффекторные моноциты и нейтрофилы, очищенные из цельной крови, окрашивают мечеными FITC mAb против CD14 и анализируют путем сортинга клеток. Результаты представлены на Фигурах 18-20. Процент фагоцитоза выражают как долю окрашенных FITC эффекторных клеток, ассоциированных с липофильным красным красителем. Как представлено на Фигуре 18, процент эффекторных клеток, участвующих в фагоцитозе, составляет порядка от 65 до 75% в зависимости от того, какие клетки (моноциты или нейтрофилы), тестируют. Повышение концентрации биспецифического антитела выше 1 мкг/мл не приводит к повышению процента эффекторных клеток, участвующих в фагоцитозе.

Известно, что моноциты, дифференцирующиеся в макрофаги (MDM), участвуют в фагоцитозе опухолевых клеток (см. статью Ely P. и соавт. 1996, Blood, 87: 3813-3821). Чтобы определить, может ли BsAb A77X520C9 индуцировать фагоцитоз с помощью MDM, данные эффекторные клетки инкубируют с меченными красителем клетками SKBR-3 в присутствии BsAb в различных концентрациях. Уровень фагоцитоза определяют анализом с использованием двухцветной поточной цитометрии, при котором одну флуоресцентную метку обозначают FL1, а другую обозначают FL2. На Фигуре 19 показано, что клетки MDM (панель 1, FL1⁺, FL2^–) и SKBR-3 (панель 2, FL1^–, FL2⁺) отличаются друг от друга в смеси этих двух типов клеток по своим уникальным типам флуоресценции (панель 3). При добавлении BsAb А77Х520С9 к смеси данных клеток-мишеней и эффекторных клеток BsAb вызывают почти полную потерю опухолевых клеток (панель 5, нижний правый квадрат). Это подтверждается практически полным отсутствием опухолевых клеток, которые могли быть выделены из содержащих BsAb лунок, что определяют с помощью опухолеспецифического ELISA (данные не представлены). Как ожидают, только MDM вызывают некоторый фагоцитоз (~45%) клеток SKBR-3 без BsAb (панель 3). Однако добавление 0,1 мкг/мл А77Х520С9 является достаточным для усиления фагоцитоза до >95% (панель 5). Данная обусловленная BsAb активность фагоцитоза почти полностью ингибируется F(аb’)₂ (панель 6). Более того, смесь несвязанного F(аb’)₂ А77 и F(ab’)₂ 520C9 не может усилить фагоцитоз (панель 4), указывая на необходимость того, чтобы конъюгированное BsAb F(ab’) A77 Х F(ab’) 520C9 направляло опухолевые клетки к эффекторным клеткам, приводя к активации эффекторных клеток (MDM).

На Фигуре 20 представлено, что обусловленная BsAb активность фагоцитоза является доза-зависимой и насыщается (почти полная потеря опухолевых клеток) при концентрации BsAb 0,1 мкг/мл. F(аb’)₂ A77 почти полностью блокирует данный обусловленный BsAb фагоцитоз. Снова смесь несвязанного F(ab’)₂ A77 и F(ab’)₂ 520C9 не обладает активностью вызывать фагоцитоз.

Вышеописанные исследования показывают, что в дополнение к стимуляции экстрацеллюларного лизиса направленные на FcRI BsAb обусловливают сильную активность фагоцитоза. В частности, при использовании MDM в качестве эффекторных клеток около 100% опухолевых клеток подвергается фагоцитозу. Вероятно, что обусловленные BsAb активности ADCC и фагоцитоз проявляются одновременно и цельные клетки или фрагменты лизированных клеток фагоцитируются MDM с помощью FcRI. Данные два механизма, как было показано, совместно действуют при FcRI-обусловленном фагоцитозе (см. статью Ely P. и соавт., 1996, Blood, 87: 3813-3821). Показано, что антиген-презентирующие фагоцитарные клетки (такие как MDM) могут презентировать антигены путями класса I и класса II после фагоцитоза несущих антиген частиц (см. статью Falo L.D. и соавт., 1995, Nature Medicine, 17:649-656). Таким образом, сильный фагоцитоз опухолевых клеток с помощью FcRI может привести к активации обеих, гуморальной и клеточной, иммунных функций, специфически направленных на ассоциированные с опухолью антигены.

Данные цитотоксические активности FcRI-направленного BsAb имеют терапевтическую ценность, поскольку экспрессия FcRI исходно ограничена иммунными эффекторными клетками, которые, как здесь демонстрируют, обусловливают BsAb-зависимые цитотоксические активности, т.е. PMN, моноцитами и макрофагами (см. статью Morton H.C. и соавт., 1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423). Поскольку распространение FcRI исходно ограничено цитотоксическими эффекторными клетками и вследствие его сильной запускающей активности, BsAb, содержащие детерминанту связывания для FcRI, могут быть широко использованы в клеточно-опосредованной иммунотерапии. Более того, описанный в данной заявке подход может быть применен для приготовления FcRI-направленных BsAb с использованием существующей высокой аффинности опухолеспецифических mAb IgG, т. е. компоненты места связывания BsAb против FcRI могут быть молекулами IgG, поскольку они превращены в фрагменты F(ab’)₂ перед химическим связыванием. Далее, при конструировании рекомбинантного BsAb Fc-фрагмент IgG может быть удален подходящим рестрикционным расщеплением и соответствующим экзонуклеазным расщеплением. Возможность использования мест связывания из Fab-фрагмента молекул IgG устраняет необходимость получения новых опухолеспецифических mAb класса IgA для разработки цитотоксического потенциала FcRI.

Пример 10. Фагоцитоз грибкового патогена Candida albicans.

Композиции биспецифических и мультиспецифических антител, соответствующих изобретению, могут быть использованы для получения направленности FcRI-несущих лейкоцитов против антигенов из микробных патогенов, например против бактерий, вирусов, простейших и многоклеточных паразитов и грибов. В порядке примера следующие исследования демонстрируют, что BsAb обусловливает фагоцитоз Candida albicans, патогенных дрожжей, которые вызывают вредные инфекции у иммунокомпромиссных пациентов с Т-клеточной недостаточностью.

Биспецифическое антитело, направленное против данного патогена, получают из поликлональных IgG кролика против Candida (Biodesign, Kennebunk, ME). Фрагменты F(ab’)₂ данного поликлонального IgG обрабатывают сульфо-SMCC для введения малеимида в свободные аминогруппы. Данный конъюгат реагирует с эквимолярным F(ab’) A77 с образованием BsAb A77X анти-Candida, которое очищают от несвязанных фрагментов хроматографией на Superdex ^{200 (Pharmacia, Piscataway, NJ). BsAb A77X против Candida связывает эффекторные клетки и клетки-мишени, в соответствии со специфичностью компонентов антител.}

Клетки Candida albicans, культивируемые в течение ночи при 37^oС, собирают центрифугированием, промывают три раза забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) и вводят флуоресцентную метку путем инкубирования с FITC (Sigma, St. Louis, МО) в концентрации 0,1 мг/мл в 0,1 М буфере NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 9.6) в течение 30 мин при 4^oС. Флуоресцентные клетки гриба, промытые три раза PBS (5 x 10⁵), инкубируют в течение 30 минут при 37^oС с 2 х 10⁵ выделенных нейтрофилов в присутствии 10 мкг/мл BsAb A77X анти-Candida (A77 Х Candida), контроли инкубируют без BsAb. Фагоцитоз количественно определяют по измерению интенсивностей FITC-флуоресценции клеток на поточном цитометре, используя РЕ-конъюгированные MoAbCD11b (Becton Dickinson, San Jose, CA) в качестве маркера окна (флуоресценции) для нейтрофилов, фагоцитоз определяют также в цитоспиновых препаратах и оценивают по данным микроскопии. Каждый эксперимент делают в трех повторностях.

Фагоцитоз Candida нейтрофилами, наиболее важной популяцией эффекторных клеток в отношении патогенных грибов, таких как виды Candida и Aspergillus (см. статьи Pizzo P., 1984, Cancer, 54:2649; Schaffner A. и соавт., 1986, J. Clin. Invest. , 78:511), и стимуляция фагоцитоза биспецифическим антителом, соответствующим изобретению, представлены на Фигуре 21. Обнаружено, что в присутствии А77 Х анти-Candida 37,37,5% нейтрофилов содержат фагоцитозные грибные частицы, в отсутствие данного BsAb 4,21,5% нейтрофилов содержат фагоцитозные грибные частицы (среднее по трем экспериментам). Таким образом, BsAb FcRI вызывает 8,9-кратную стимуляцию фагоцитоза нейтрофилами грибного патогена, как демонстрируют на фотографиях на панелях А и В Фигуры 21, и по сдвигу интенсивности флуоресценции FIТС-меченых грибных клеток к интенсивности РЕ-меченых нейтрофилов на панелях С и D.

FcRI-направленное BsAb может быть использовано для борьбы с рядом инфекционных заболеваний, поскольку большинство инфекционных агентов (бактерии, вирусы, грибы и т.п.) экспрессируют на своей поверхности уникальные антигены и описан ряд патоген-специфических антител. Данный способ может быть использован для борьбы с антибиотикоустойчивыми патогенами, такими как метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus, или другими видами патогенных бактерий и видами патогенных грибов дополнительно к Candida.

Пример 11. BsAb-обусловленный цитолиз с помощью эффекторных клеток, обработанных цитокинами и ростовыми факторами.

На Фигуре 22 представляют процент цитотоксичности эффекторных клеток нейтрофилов, предварительно инкубированных с G-CSF (Панель А) или обоими G-CSF и IFN- (Панель В), в отношении клеток опухоли молочной железы-мишени SKBR-3 в виде функции концентрации BsAb A77X520C9. Нейтрофилы предварительно инкубируют с данными факторами в течение ночи при 37^oС перед цитотоксическим анализом. При сравнении сданными, представленными в Примере 4, где не проводят предварительное инкубирование нейтрофилов с цитокинами, обнаружено, что процент цитотоксичности повышается при предварительном инкубировании эффекторных клеток с обоими G-CSF и INF-, так что при концентрации BsAb 0,1 мкг/мл специфически лизируется более чем 10% опухолевых клеток по сравнению с менее чем 10%, приведенных в Примере 1, и при концентрации BsAb 1,0 мкг/мл отмечают 40% цитотоксичность по сравнению с приблизительно от 24 до 32%, приведенными на Фигуре 7 в отсутствие данных факторов.

На Фигуре 23 представляют результаты предварительной обработки эффекторных моноцитов IFN- (Панель В) или TNF (Панель С) с использованием BsAbA77XH425, которое сочетает детерминанту связывания для FcR и детерминанту связывания для EGF-R. Как описано выше, известна сверхэкспрессия EGF-рецепторов на карциномах молочной железы, кожи, головы и шеи и других опухолевых клеток, таким образом BsAb A77XH425 предусматривает другой вариант осуществления мультиспецифической композиции для лечения опухоли молочной железы и других опухолей. Как показано на Фигуре 23, необработанные моноциты обладают значительной цитотоксичностью в отношении клеток рака молочной железы, обусловленной BsAb A77XH425 при концентрациях BsAb 0,1 и 1,0 мкг/мл. В частности, BsAb A77XH425 вызывают более чем 60% цитолиз при концентрации 1,0 мкг/мл при использовании необработанных моноцитов и обработанных TNF моноцитов и более 40% при концентрации 1,0 мкг/мл при использовании обработанных IFN- моноцитов.

В целом данные результаты демонстрируют, что каждый из двух препаратов BsAb A77X520C9 и А77ХН425 связывает клетки опухоли молочной железы или клетки карциномы кожи соответственно и обусловливает цитолиз раковых клеток нейтрофилами или моноцитами без дополнительной обработки данных эффекторных клеток экзогенными цитокинами.

Пример 12. Отличие сайта связывания для FcR A77 от сайта связывания для природного лиганда FcR.

При создании терапевтического BsAb, направленного на FcRI, его оптимальная функциональность как терапевтического агента для субъектов была бы достигнута при независимом от конкуренции с эндогенными молекулярными структурами, такими как природный лиганд IgА, связывании данного участка. Таким образом, терапевтическое BsAb или мультиспецифическая связывающая композиция могут вводиться без блокирования и ингибирования или без значительного блокирования и ингибирования эндогенным IgА.

На Фигуре 24 показано, что антитело A77 связывает в полной мере эффекторные клетки в присутствии IgА в концентрации 200 мкг/мл по сравнению с контрольным связыванием в отсутствие IgА. Присутствие IgА не влияет на среднее значение интенсивности флуоресценции. Данные результаты демонстрируют, что mАb A77 специфически связывает эпитоп на FcRI, который отличается от сайта связывания IgА (см. статью Monteiro и соавт., 1992, J. Immunol., 148:1764-1770).

Пример 13. Модуляция FcRI с помощью А77 и отсутствие модуляции с помощью А77Х520С9 и F(ab’)₂ A77.

Характеристики эффекта добавления mAb A77 к клеткам на регуляцию FcRI получают при исследованиях, в которых изучают модуляцию (снижение числа рецепторов) FcRI на поверхности клетки как функцию концентрации mAb A77.

Как показано на Фигуре 25, инкубирование моноцитов с различными концентрациями A77 в течение 18 час при 37^oС вызывает модуляцию при концентрации 10 нг/мл, которая выходит на плато при 55 – 60% от контроля (число рецепторов в отсутствие A77) при концентрации от 1,0 до 10 мкг/мл. Напротив, инкубирование моноцитов с антителом 520С9, которое принадлежит к тому же изотипу, что A77, и которое специфически связывает НЕR-2/neu-рецептор, не экспрессирующийся на моноцитах, не влияет на модуляцию FcR моноцитами. Таким образом, функциональная детерминанта mAb A77 способна вызывать интернализацию и модуляцию FcR с поверхности. Далее, способность BsAb связывать HER-2/neu с помощью места связывания, выделенного из 520С9, является независимой от места связывания FcRI. Данный результат показывает, что снижающая модуляция FcR достигается путем инкубирования клеток, несущих данный рецептор, с антителом A77. Данная модуляция может быть использована для регуляции аутоиммунных нарушений.

Подтверждение и сопоставление данных результатов с результатами для BsAb A77X520C9, а также для F(ab’)₂ A77 показывают отсутствие снижающей модуляции FcRI в моноцитах и незначительную модуляцию по сравнению с А77 в PMN. Модуляцию экспрессии FcRI при связывании BsAb или mAb A77 с моноцитами или PMN исследуют поточной цитометрией. На Фигуре 26 показано, что целое mAb A77 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл индуцирует приблизительно 40 – 50% снижение FcRI на PMN и моноцитах после инкубирования в течение ночи при 37^oС. Данная модулированная активность не требует перекрестного сшивания связанного A77 противомышиным антителом. Однако 1 и 10 мкг/мл BsAb A77X520C9 или F(ab’)₂ A77 индуцируют минимальную или не индуцируют модуляцию FcRI в подобных условиях, указывая на то, что Fc-участок mAb A77 может быть необходимым для снижения модуляции экспрессии FcRI.

Из данных, представленных на Фигуре 26, показывающих модуляцию с помощью mAb A77, а не BsAb или F(ab’)₂ A77, можно заключить, что связывание BsAb с моноцитами и PMN не приводит к перекрестному сшиванию и последующей снижающей модуляции FcRI в отсутствие антигена-мишени или клеток-мишеней. Вследствие этого, FcRI-направленное BsAb может быть использовано для “вооружения” эффекторных клеток у субъекта или пациента без активации перекрестного связывания рецептора, что позволяет избежать нежелательные системные побочные эффекты. Данные эффекторные клетки, вооруженные мультиспецифическими антителами, соответствующими изобретению, могут быть активированы местно только перекрестным сшиванием FcRI путем связывания антигена-мишени, например антигена на опухолевой клетке или на патогене. Показано аналогичное “вооружение” моноцитов FcRI-направленным BsAb (см. статью Valone F.H. и соавт. , 1995, J. Clin. Oncol., 13:2281-2292), однако, для того чтобы вооружение FcRI-направленного BsAb было эффективным, требуется предварительное лечение субъекта G-GSF или IFN- для связывания популяции эффекторов PMN in vivo (см. статью Repp R. и соавт., Blood, 78:995; работу Weber J.S. и соавт. , 1996, Proc. of ASCO, 15:354 (Тезисы)). Описанное в заявке FcRI-направленное BsAb может связывать эффекторные клетки, такие как моноциты, PMN и макрофаги, без обработки цитокином и без снижающей модуляции родственного рецептора на лейкоцитах.

Пример 14. Клонирование и секвенирование генов вариабельного участка А77.

РНК А77 готовят из гибридомы, продуцирующей FcR-специфическое антитело А77, и 33 мкг всей (тотальной) РНК получают из приблизительно 410⁷ клеток А77, используя набор для получения Total PHKRNAeasy (Qiagen). Затем проводят RT-PCR (полимеразную цепную реакцию с использованием обратной транскриптазы для получения матрицы) на 200 нг препарата тотальной РНК с использованием набора для PCR с термостабильной rTth обратной транскриптазой РНК GeneAmp ^{(Perkin Elmer). кДНК V-участка Ig получают, используя праймеры CG1 для 5′-GGAAGCTTAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTG, SEQ ID No 1 (кодирующей аминокислоты 115-122 домена СН1 и сайта HindIII тяжелой цепи мышиного IgG1) и СК2 для 5′-GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC, SEQ ID No 2 (кодирующей аминокислоты 111-118 мышиного константного домена и сайта HindIII к-легкой цепи).}

кДНКV_H и V_к амплифицируют ПЦР, используя праймеры для кДНК наряду c SH1 BACKBAM, 5′-GACTGGATCCATGGRATGGAGCTGGRTCWTBHTCTT, SEQ ID No 3 (кодирующей консенсусную последовательность аминокислот от -20 до -12 некоторых сигнальных пептидов V_H и сайта BamHI) и VK1BACKBAM, 5′-GACTGGATCCGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA, SEQ ID No 4 (кодирующей аминокислоты от -4 до -1 сигнального пептида и остатков от 1 до 4 некоторых мышиных доменов V_к и сайта BamHI). Однобуквенный код для комбинаций нуклеотидов, известный специалистам, приводится на стр. 174 каталога 1996-1997 New England Biolabs catalog (32 Tozer Rd., Beverly, MA).

Амплифицированные ДНКV_H и V_к очищают, используя набор Wizard PCR Prep (Promega), клонируют в pUC19 и секвенируют способом с использованием дидезоксинуклеотидов (дидезокси-способом). Секвенирование ДНК проводят с помощью National Biosciences, Inc. пo меньшей мере 5 клонов pUC19 каждой V_к и V_H секвенируют для получения консенсусных последовательностей данных генов, которые представлены на Фигурах 27 (SEQ ID No 5) и 28 (SEQ ID No 7). Предсказанные аминокислотные последовательности представляют на Фигурах 27 (SEQ ID No 6) и 28 (SEQ ID No 8) для V_к и V_H соответственно.

Данные последовательности используют для получения рекомбинантных гуманизированных FсR-связывающих мест А77, для получения антител из одной цепи и BsAb из одной цепи, с целью конструирования детерминант с повышенной аффинностью с использованием рекомбинантных способов, для исследований на базе моделирования с целью разработки лекарственных веществ-миметиков с помощью рационального конструирования лекарственных веществ (“драгдизайна”) и для дополнительных способов применения, описанных в данном изобретении.

Эквивалентные решения
Специалистам понятны и они способны произвести с помощью не более, чем рутинных экспериментов множество эквивалентных решений, специфических вариантов осуществления описанного изобретения. Предусматривается, что данные эквивалентные решения охватываются следующей формулой изобретения.

Содержание всех патентов и публикаций, приведенных в контексте описания, введено в него в виде ссылки.

Формула изобретения

1. Мультиспецифическая молекула, представляющая собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержащая по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает Fс-рецептор без блокирования иммуноглобулином А(IgA), и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген-мишень, выбранный из группы, включающей в себя антиген инфекционной болезни из патогена, антиген раковой клетки или антиген на инфицированной патогеном клетке.

2. Мультиспецифическая молекула по п.1, отличающаяся тем, что антиген-мишень представлен антигеном раковой клетки.

3. Мультиспецифическая молекула по п.2, отличающаяся тем, что антиген раковой клетки выбран из раков молочной железы, яичников, семенников, легкого, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови и лимфатической системы или является представителем семейства человеческого EGF-подобного рецептора, выбранного из группы, включающей в себя EGF-рецептор, HER-2/neu, HER-3, HER-4 или гетеродимерный рецептор, составленный из по меньшей мере одной субъединицы HER, или выбран из группы, состоящей из канцероэмбрионального антигена, антигена рецептора гастрин-высвобождающего пептида и муцинового опухолевого антигена TAG-72.

4. Мультиспецифическая молекула по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что в качестве по крайней мере одной из указанных детерминант связывания она содержит антитело или фрагмент антитела, которое необязательно представлено IgG, фрагментом IgG или Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv и Fv из одной цепи.

5. Мультиспецифическая молекула по п.1, отличающаяся тем, что в качестве по крайней мере одной из указанных детерминант связывания она содержит лиганд для клеточного рецептора.

6. Мультиспецифическая молекула по п.1, отличающаяся тем, что в качестве первой детерминанты, которая связывает Fc-рецептор, она содержит человеческое или гуманизированное антитело, при этом, но необязательно, гуманизированная детерминанта получена из полных или частичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих места связывания Fv участков V_k и V_н антитела А77, представленных SEQ ID No 5 и SEQ ID No 7, соответственно, или гуманизированная детерминанта происходит из полных или частичных последовательностей аминокислотных остатков мест связывания Fv участков V_k и V_н антитела А77, представленных SEQ ID No 6 и SEQ ID No 8, соответственно, причем необязательно, гуманизированная детерминанта более чем на 50% гомологична месту связывания участков V_k или V_н антитела А77, представленных SEQ ID No 6 и SEQ ID No 8, соответственно, или в качестве второй детерминанты связывания она содержит антитело, выбранное из группы, состоящей из АТСС НВ 8696 (антитело 520С9), АТСС НВ 9459 (антитело СС49) и их функциональных фрагментов, причем мультиспецифическая молекула по выбору получена химическим связыванием фрагмента антитела А77 и второй детерминанты связывания или рекомбинатным путем в клетке-хозяине.

7. Мультиспецифическая молекула по п.1, отличающаяся тем, что она представлена триспецифической молекулой, содержащей третью детерминанту связывания, специфическую для Fc-рецептора, за исключением Fc-рецептора.

8. Мультиспецифическая молекула по п.1, отличающаяся тем, что она получена рекомбинатным путем в клетке-хозяине, трансфицированной нуклеиновой кислотой, кодирующей указанные детерминанты связывания, или получена химическим соединением указанных детерминант связывания.

9. Мультиспецифическая молекула по п.1, отличающаяся тем, что в качестве первой детерминанты связывания она содержит антитело А77 или его функциональный фрагмент, а вторая детерминанта связывания связывает антиген, выбранный из группы, состоящей из антигена на раковой клетке, антигена на патогене и антигена на инфицированной патогеном клетке, необязательно при этом вторая детерминанта связывания выбрана из группы, состоящей из АТСС НВ 8696 (антитело 520С9), АТСС НВ 9459 (антитело СС49) и их функциональных фрагментов, или патоген выбран из группы, включающей в себя бактерии, вирусы, грибы и простейшие, например, виды рода Candida, такой, как С.albicans.

10. Мультиспецифическая молекула, представляющая собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержащая детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор без блокирования IgA и антиген.

11. Мультиспецифическая молекула по п.10, отличающаяся тем, что в качестве детерминанты связывания она содержит антитело или фрагмент антитела, которое необязательно представлено IgG, фрагментом IgG или Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv и Fv из одной цепи.

12. Мультиспецифическая молекула по п.10, отличающаяся тем, что детерминанта связывания является человеческой или гуминизированной.

13. Способ уничтожения клетки-мишени или уменьшения количества клеток-мишеней в организме субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективной дозы мультиспецифической молекулы, представляющей собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержащей по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор и не блокируется IgA, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген на клетке-мишени.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что по крайней мере одна из указанных детерминант связывания представлена человеческим или гуманизированным антителом или его фрагментом, которое необязательно является IgG, фрагментом IgG или Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv и Fv из одной цепи.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что дополнительно субъекту вводят по меньшей мере один агент, который повышает число или активность Fc-рецепторов на несущей Fc-рецептор клетке.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве указанного агента используют цитокин.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что цитокин выбирают из группы, состоящей из по меньшей мере одного из G-CSF, GM-CSF, IFN- и TNF.

18. Способ лечения субъекта, инфицированного патогеном, включающий введение терапевтически эффективной дозы мультиспецифической молекулы, причем указанная молекула представляет собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор и не блокируется IgA, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген-мишень на патогене или инфицированной патогеном клетке.

19. Способ вакцинации субъекта, включающий введение субъекту мультиспецифической молекулы, которая представляет собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержит первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор и не блокируется IgA, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген, например, на патогене или на раковой клетке, или которая представлена антигеном.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.07.2006

Извещение опубликовано: 20.12.2007 БИ: 35/2007