Патент на изобретение №2201679

(54) ИНКАПСУЛИРОВАННЫЙ БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ БОРЬБЫ С КОЛОРАДСКИМ ЖУКОМ И ДРУГИМИ ЖЕСТКОКРЫЛЫМИ НАСЕКОМЫМИ-ВРЕДИТЕЛЯМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству средств защиты растений. Изобретение представляет собой новый высокоактивный препарат против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых-вредителей. Препарат создан на основе инактивированной биомассы рекомбинантного штамма Pseudomonas putida IPM-36, продуцирующего инсектицидный белок cry 3А-типа. Активное начало препарата инкапсулировано в клеточную оболочку. Препарат не содержит жизнеспособных клеток и спор и имеет следующую жидкую форму состава, мас.%: обработанный концентрат биомассы штамма Pseudomonas putida IPM-36 79-89, стабилизатор (глицерин) 5-10, прилипатель (минеральное или растительное масло) 5-10, эмульгаторы (Brij 30 и Brij 58, или Surfynol 61 и Span 20 или аналогичные 0,5-1,0, консервант (фенол) 0,1-0,3. Предложенный состав препарата обеспечивает его биологическую и физиологическую стабильность. Гарантийный срок хранения препарата – не менее 1 года при температуре до +25^oС. В процессе хранения частицы действующего начала не агрегируются, что в совокупности с хорошей адгезией и высокой биологической активностью обеспечивает высокую эффективность препарата против колорадского жука в дозах 1-2 л/га. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений.

Известно, что одним из основных недостатков препаратов на основе Bacillus thuringiensis является их быстрая инактивация под действием солнечного света и других факторов внешней среды [1]. Также обычно препараты на основе В. thuringiensis кроме энтомотоксинов содержат жизнеспособные споры, поэтому их широкое применение может привести к нарушению экологического равновесия. В связи с этим японские исследователи разработали физико-химические методы инактивации спор [2], а в России был создан препарат астур на основе аспорогенного штамма В. thuringiensis var. kurstaki против чешуекрылых насекомых-вредителей [3,4] . За рубежом предложены инсектицидные композиции на основе генноинженерных штаммов Pseudomonas fluorescens, продуцирующих -эндотоксин, эффективный против чешуекрылых насекомых [1]. Эти композиции не содержат жизнеспособных клеток и спор, а энтомоцидный белок в них защищен от воздействий окружающей среды клеточной оболочкой.

Известные в настоящее время микробиологические средства против колорадского жука содержат большое количество жизнеспособных спор. Так, отечественный препарат Битоксибациллин (БТБ), рекомендуемый для борьбы против личинок колорадского жука 1-2 возраста и ряда других насекомых вредителей, содержит от 4510⁹ до 6010⁹ спор/г [3]. Этот препарат готовят на основе В. thuringiensis subsp. thuringiensis. Препарат выпускается в виде сухого и смачивающегося порошков, при этом в последнем случае в его состав дополнительно входит смачиватель. Недостатком этого препарата является и высокие нормы расхода при использовании против колорадского жука: 2-5 кг/га.

Большое количество жизнеспособных спор содержат также жидкие препараты Децимид и Новодор, которые готовятся на основе штаммов В. thuringiensis var. tenebrionis. Эти препараты рекомендуется применять против личинок 1-2 возраста. Недостатком их также являются сравнительно высокие нормы расхода: 2-6 л/га [3].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является жидкий отечественный препарат Колорадо [5]. Он также готовится на основе В. thuringiensis var. tenebrionis и содержит в качестве действующего начала -эндотоксин, обладающий специфической инсектицидной активностью против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых. В 1 мл препарата содержится не менее 210¹⁰ жизнеспособных спор. Его рекомендуется применять против личинок 1-2 возраста. Препарат содержит в своем составе глицерин, масло тридекан, углерод технический в качестве фотопротектора, в качестве ПАВ – Спан 60 и неонол, а также отдушку. Препарат Колорадо дешевле сухих микробных препаратов и удобнее в применении, более устойчив к воздействию окружающей среды после нанесения на листья. Недостатком его является сравнительно низкая эффективность, приводящая к высоким нормам расхода: 4-5 кг/га [3, 5].

Задачей изобретения является создание нового еще более экологически безопасного, устойчивого к воздействию окружающей среды высокоэффективного препарата против колорадского жука и других жесткокрылых насекомых-вредителей.

Задача решается тем, что предлагается препарат на основе инактивированной биомассы генноинженерного штамма Pseudomonas putida IPM-36 [6], который синтезирует внутриклеточный инсектицидный белок cry 3А-типа, вызывающий гибель насекомых отряда Coleoptera. Препарат не содержит жизнеспособных клеток и спор. Кроме действующего начала заявляемый препарат содержит стабилизатор, прилипатель, эмульгаторы и консервант при следующем соотношении компонентов, мас.%:
обработанный концентрат биомассы штамма IPM-36 – 79-89
стабилизатор (глицерин) – 5-10
прилипатель (минеральное или растительное масло) – 5-10
эмульгаторы (Brij 30 и Brij 58, или Surfynol 61 и Span 20 или аналогичные) – 0,5-1,0
консервант (фенол) – 0,1-0,3.

Подобранным сочетанием добавок обеспечивается биологическая и физическая стабильность препарата. Гарантийный срок хранения – не менее 1 года при температурах до +25^oС. В процессе хранения частицы действующего начала не агрегируются, что в совокупности с хорошей адгезией и высокой биологической активностью обеспечивает высокую эффективность препарата против колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata). Рекомендуемые дозы применения – 1-2 л/га.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выращивание культуры Р. putida IPM-36 с индуцированным синтезом -эндотоксина.

Вышеупомянутый штамм выращивают на питательной среде следующего состава:
глюкоза – 20 г/дм³
дрожжевой экстракт – 1г/дм³
К₂НРO₄3Н₂О – 3 г/дм³
КН₂РО₄ – 4 г/дм³
MgSO₄7H₂O – 0,3 г/дм³
FeSO₄7Н₂О – 0,02 г/дм³
NiCl₂ – 0,0005 г/дм³
лимоннокислый натрий – 0,4 г/дм³
мочевина – 2,0 г/дм³.

Посевной материал готовят в 3 колбах объемом 750 мл, содержащих по 100 мл среды. Колбы засевают смывом односуточной агаровой культуры и выращивают при температуре (291)^oС в течение 20 ч при скорости вращения платформы (22020) об/мин.

Приготовление культуральной жидкости осуществляют в ферментере NBS с рабочим объемом 8 дм³, коэффициент аэрации – 0,1-0,2мин^-1. Перемешивание увеличивают с 200 об/мин после посева до 600 об/мин через 6-8 ч. Через 4 ч после посева в культуру вводят индуктор – 3-метилбензоат натрия до концентрации 68 мг/дм³. Через 12 ч выращивания в указанном режиме получают культуру с концентрацией клеток и -эндотоксина – 410¹⁰ кл/мл и 0,5 г/л, соответственно.

Пример 2. Приготовление культуры Р. putida IPM-36 в условиях конститутивного синтеза инсектицидного белка.

Штамм Pseudomonas putida IPM-36 выращивают на среде и в условиях, описанных в примере 1, но без использования индуктора и с подпиткой культуры в процессе выращивания концентратом питательной среды. Для приготовления концентрата питательной среды к 750 мл 50%-ной глюкозы добавляют 200 мл 20%-ного раствора мочевины и 50 мл 15%-ного раствора сернокислого магния. Введение концентрата среды начинают через 6 часов после посева при достижении общей концентрации клеток 10¹⁰ кл/мл. Подачу концентрата производят со скоростью 30-60 мл/ч. Через 24 часа выращивания при расходе концентрата 80 мл/дм³ получают культуру с концентрацией клеток и -эндотоксина – 810¹⁰ кл/мл и 0,8 г/дм³, соответственно.

Пример 3. Получение концентрата инактивированных клеток Р. putida IPM-36.

Культуру штамма IPM-36 выращивают, как описано в примере 1 или 2. После завершения процесса культивирования в ферментер вносят инактиваторы: а) 0,5% хромокалиевых квасцов – KCr(SO₄)₂ и 0,05% формалина или б) 1% алюмокалиевых квасцов – КАl(SO₄)₂ и 0,1% формалина и перемешивают в течение 30 мин. Затем обработанную культуру концентрируют центрифугированием или сепарированием в 10 раз. Полученные концентраты, как описано в примере 3, а также концентрат необработанной биомассы штамма IPM-36 высевают по 0,1 мл в чашки Петри на МПА и инкубируют при 28^oС. Через сутки проводят учет выросших колоний (КОЕ/мл). Результаты представлены в табл.1. Как следует из таблицы, препараты на основе обработанной биомассы практически не содержат жизнеспособных клеток.

Пример 4. Определение защитных свойств оболочек клеток штамма Р. putida IPM 36 по отношению к УФ облучению.

Для определения защитных свойств клеточных оболочек 5 мл 1%-ной суспензии, обработанных по примеру 3, и необработанного концентрата биомассы штамма IPM-36 наносят на дно чашек Петри и высушивают в течение 10-15 мин при 40^oС продувкой воздуха. Чашки с высушенными препаратами облучают УФ светом бактерицидной лампы на расстоянии около полуметра от нее. Затем облученные препараты тщательно ресуспендируют в 10 мл дистиллированной воды. Инсектицидную активность полученных суспензий препаратов определяют, как описано в примере 6, не позднее, чем на следующий день после облучения. Данные по влиянию УФ облучения на инсектицидную активность концентратов биомассы штамма IPM-36 представлены в табл.1. Из данных таблицы следует, что обработка клеток с целью их инактивации не снижает эффективность защиты инсектицидного белка клеточной оболочкой от УФ излучения.

Пример 5. Приготовление препарата.

В концентрат биомассы клеток, обработанных раствором 0,5% хромокалиевых квасцов и 0,05% формалина (см. пример 3а), вносят до следующих конечных концентраций:
а) глицерин – 10%, минеральное масло (дизельное топливо) – 9,9%, Brij 30 (монолауриловый эфир триэтиленгликоля) – 0,5% и Brij 58 (моноцетиловый эфир полиоксиэтилена) – 0,5%, фенол – 0,1 % или
б) глицерин – 9,9%, растительное (подсолнечное) масло – 10%, Brij 30 – 0,5%, Brij 58 -0,5%, фенол-0,1%.

В концентрат биомассы клеток, обработанных раствором 1% алюмокалиевых квасцов и 0,1% формалина (см. пример 3б), вносят до следующих конечных концентраций:
в) глицерин – 5,2%, минеральное масло (дизельное топливо) – 5,0%, Surfinol 61 (оксиэтилированный тетраметилдециндиол) – 0,25%, Span 20 (сорбитан монолаурат) – 0,25%, фенол – 0,3% или
г) глицерин – 5,0%, растительное (подсолнечное) масло – 5,2%, Surfinol 61-0,25%, Span 20-0,25%, фенол – 0,3%.

Все компоненты тщательно перемешивают до однородной консистенции.

Пример 6. Определение инсектицидной активности препаратов против колорадского жука в лабораторных условиях.

Готовят 4-5 разведений препарата с шагом в 10 раз. Листья картофеля окунают в эти суспензии, подсушивают на воздухе и помещают в чашки Петри, в которые затем вносят личинок колорадского жука 1-2 возраста в количестве не менее 10 штук на чашку. Каждое разведение исследуется в не менее чем в трех повторностях. Учет погибших гусениц проводят с 3-х по 5-е сутки. По результатам учета гибели личинок на 5-е сутки вычисляют значения ЛК₅₀ по формуле Кербера. В одном опыте одновременно испытывали препараты, приготовленные по примеру 5, и Новодор. Их значения составили для препаратов по примерам 5а и 5в – 0,0035%, по примерам 5б и 5г – 0,003%, для Новодора – 0,005%.

Пример 7. Определение инсектицидной активности препарата против большого мучного хрущака (Tenibrio molitor)
Искусственный корм, состоящий из отрубей и пшеничной муки в соотношении 1: 1, смешивают с препаратами, приготовленными по примеру 5а и 5г и Новодором, используя 1 мл препарата на 3 г корма, и тщательно перемешивают. В чашки Петри раскладывают по 0,5 г обработанного корма и на него подсаживают не менее 20 личинок Tenibrio molitor 3-4 возраста. Результаты учета гибели личинок приведены в табл.2.

Как следует из таблицы, исследовавшиеся препараты вызывают полную гибель личинок одного из наиболее устойчивых к воздействию инсектицидов вредителя зерновых запасов.

Пример 8. Определение удерживаемости препаратов на модельной поверхности
В качестве модельной поверхности используют стекло, покрытое парафином. На парафинированное предметное стекло наносят 0,1 мл 1%-ной суспензии препаратов по примеру 5 и необработанного концентрата и высушивают на воздухе. Затем стекло промывают струей дистиллированной воды из делительной воронки, так чтобы объем смыва составил 100 мл. Иммуноферментным методом определяют содержание -эндотоксина в исходной суспензии и в смыве. Удерживаемость вычисляют как отношение содержания токсинов в смыве к исходной суспензии. Повторность опытов трехкратная. Результаты приведены в табл.3.

Как следует из табл.3, подобранные составы обладают хорошей физической стабильностью и высокими адгезивными свойствами. Использование добавок в составе препарата в концентрациях более низких, чем заявляемые, не обеспечивает нужного эффекта, а применение их в более высоких концентрациях повышает их стоимость.

Пример 9. Полевые испытания препаратов против колорадского жука на картофеле.

Испытания проводили во ВНИИ картофельного хозяйства на делянках площадью 25 м² (100 кустов) в четырехкратной повторности. Норма расхода рабочей жидкости – 400 л/га, опрыскиватель “Rapid”, сорт картофеля – Невский.

Было проведено два цикла обработок: в первом цикле испытывали БТБ и препарат, приготовленный по примеру 5а в дозе 0,8 кг/га. Популяция личинок перед опрыскиванием на 71% состояла из личинок 1-2 возраста. Во втором цикле испытывали препарат по примеру 5а в дозе 2 кг/га. Второй цикл проводили через две недели после первого, поэтому популяция личинок в основном состояла из личинок более старших возрастов. Результаты представлены в табл.4.

Как следует из табл.4, заявляемый препарат имел эффективность 93% при норме расхода 2 кг/га. Таким образом, предлагаемый препарат более чем в 2 раза эффективнее прототипа (Колорадо), который по литературным данным имел эффективность 80% при норме расхода 5 кг/га [5]. Кроме того, предлагаемый препарат является гораздо более экологически безопасным, так как не содержит живых клеток и спор.

Источники информации
1. Патент US 4695455, кл. 424/93, 435/68, 1987 г.

2. Патент JP 51-5047, кл. 424/93, 1981 г.

3. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в Российской Федерации (составители Д.А. Орехов, О.П. Картомышев, О.В. Морозов, Е.В. Кузьмичева). М., “Колос”, 1998, 238 с.

4. Патент RU 2033721, кл. A 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1995 г. Бюлл. 12.

5. Патент RU 2081583, кл. A 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1997 г.

6. Патент РФ 2103363, кл. С 12 N 15/32. 1998 г. Бюлл. 3.

Формула изобретения

1. Инкапсулированный биопрепарат для борьбы с колорадским жуком и другими жесткокрылыми насекомыми-вредителями, содержащий в качестве действующего начала Coleoptera-специфический инсектицидный белок, а также стабилизатор, прилипатель и эмульгаторы, отличающийся тем, что в качестве активного начала он содержит Coleoptera-специфический инсектицидный белок cry 3А-типа в виде концентрата инактивированных клеток штамма Pseudomonas putida IPM-36 и дополнительно включает консервант при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Концентрат инактивированных клеток штамма Pseudomonas putida IPM-36 – 79-89
Стабилизатор – 5-10
Прилипатель – 5-10
Эмульгаторы – 0,5-1,0
Консервант – 0,1-0,3
2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора он содержит глицерин.

3. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве прилипателя он содержит растительное или минеральное масло.

4. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве эмульгаторов он содержит Brij 30 и Brij 58, или Surfynol 61 и Span 20, или другие вещества с аналогичными физико-химическими свойствами.

5. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве консерванта он содержит фенол.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.04.2006

Извещение опубликовано: 27.03.2007 БИ: 09/2007