Патент на изобретение №2201256

(54) ЛАКТОСЫВОРОТКА ИММУННАЯ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОТИВ HELICOBACTER PYLORI И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, микробиологии и иммунологии. Лактосыворотка содержит антитела против Н.pylori, в том числе против его факторов патогенности – токсина и уреазы. Коров в стельном периоде иммунизируют смесью термоинактивированной культуры Н.pylori и антигенного экстракта из биомассы Н.pylori. Активную фракцию выделяют из молока в раннем периоде лактации путем обезжиривания, удаления казеина, осветления, диафильтрации и концентрирования. Лактосыворотка содержит в качестве активного начала антитела к суммарному антигену Н.pylori в титре не более 1:12800, к токсину – не ниже 1:6400 и к уреазе – не ниже 1:6400 при следующем соотношении компонентов (от общего содержания белка): иммуноглобулин G 25,951,15, иммуноглобулин А – 11,850,75, иммуноглобулин М – 16,950,05, иммуноглобулины других классов 0,750,3, альфа-лактоглобулин 10,650,55, бета-лактоглобулин – 18,350,25, сывороточный альбумин – 5,650,65, остаточные белки – остальное. Повышена специфическая активность препарата. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, микробиологии и иммунологии и может быть использовано в разработке средств лечения и профилактики заболеваний, ассоциированных с инфекцией Helicobacter pylori.

Helicobacter (H.) pylori – патогенный микроорганизм – поражает слизистые желудка и двенадцатиперстной кишки, является ведущим этипатогенетическим фактором массовых заболеваний гастродуоденальной сферы – гастритов, дуоденитов, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественной лимфомы желудка [1].

Известны специфические иммунные препараты – лактосыворотки, выделяемые из молозива или молока иммунизированных коров и направленные против патогенных микроорганизмов, поражающих желудочно-кишечный тракт: шигелл, сальмонелл, энтеровирусов, а также способы получения таких лактосывороток [2, 3, 4].

Известна специфическая иммунная лактосыворотка против патогенных бактерий рода Shigеlla и способ ее получения [3]. Указанная лактосыворотка представляет собой фракцию молока стельных коров, иммунизированных внутримышечно и диателически (введением антигена в молочные ходы вымени) взвесью инактивированных шигелл, лактосыворотка содержит следующие белки: иммуноглобулины – (56,271,5)%, бета-лактоглобулины – (21,02,07)%, альфа-лактоглобулин – (10,30,87)%, сывороточный альбумин – (6,01,04)%, обладает высокой активностью антител к 0-антигену шигелл Зонне. Лактосыворотку получают следующим способом: стельных коров иммунизируют внутримышечно и диателически антигенами шигелл Зонне за 6-8 недель до отела. Лактосыворотку получают из раннего молока иммунизированных коров путем его обезжиривания, удаления казеина, осветляющей фильтрации и концентрирующей ультрафильтрации, содержание специфических антител и шигеллам Зонне контролируют с помощью реакции непрямой гемаглютинации с эритроцитарным диагностикумом – 0 шигелл Зонне.

Специфические иммунные лактосыворотки против Н. pylori и способы их получения не известны.

Изобретение направлено на разработку лактосыворотки против Helicobacter pylori, в том числе против факторов его патогенности – токсина и уреазы, и способа ее получения, при этом повышена специфическая активность препарата.

Сущность изобретения сводится к следующему. Иммунная лактосыворотка специфическая против Helicobаcter pylori представляет собой фракцию молока стельных коров, иммунизированных антигенами H.pylori, содержит белок в концентрации (35 9,2) мг/мл и белковые фракции в следующем процентном соотношении: иммуноглобулин G – (26,3 + 9,2) мг/мл, иммуноглобулин А – (12,3 1,9)%, иммуноглобулин М – (17,9 2,2)%, бета-лактоглобулин – (20 2,5)%, альфа-глобулин – (10,5 1,1)%, сывороточный альбумин – (6,0 1,5)%; препарат содержит в качестве активного начала антитела к антигенам Н. pylori в следующих титрах: к суммарному антигену Н.pylori – не менее 1:12800, к вакуолизирующему токсину Н.pylori не менее 1:6400, к уреазе – не менее 1:6400.

Способ получения лактосыворотки иммунной специфической против Н.pylori предусматривает иммунизацию коров в стельном периоде, выделение лактосыворотки из молока в ранние сроки лактации путем обезжиривания, удаления казеина, осветления, диафильтрации и концентрирования. Специфическая активность получаемого препарата достигается за счет осуществления иммунизации коров смесью термоинактивированной культуры Н.pylori и антигенного экстракта из биомассы Н.pylori.

Специфическая активность препарата повышается еще больше, если для получения термоинактивированной культуры и антигенного экстракта использовать токсигенные уреазопозитивные штаммы Н.pylori, прошедшие предварительно не более 1 пассажа на искусственных питательных средах после выделения от больных гастродуоденальными заболеваниями.

Изобретение реализуют следующим образом.

Пример 1
Получение суммарного антигена Helicobacter pylori.

Готовят питательную среду для культивирования Helicobacter pylori (H. pylori): к расплавленному колумбийскому агару (Columbio Agar Base) стерильно добавляют лошадиную нормальную сыворотку до конечной ее концентрации 7% и раствор Iso Vitalex (Becton Dickinson Microbiology Systems) до конечной концентрации 1%. Агар разливают в чашку Петри и дают ему застыть.

Посев культуры 6 свежевыделенных штаммов H. pylori на поверхность агара производят бактериальной петлей (1 чашка с посевом на каждый штамм H.pylori) и распределяют нанесенный материал по поверхности агара стерильным шпателем. Чашки с посевом помещают в анаэростат системы GasPak 100 с газогенерирующим пакетом типа GasPak и выдерживают в термостате при 37^oС 6 суток. Выросшие H. pylori проверяют микроскопическим методом на чистоту культуры, снимают биомассу культуры стерильным стеклянным шпанделем и эмульсируют в 50 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,01 М фосфатно-буферного раствора рН 7,20,2 (забуференный физиологический раствор – ЗФР). В целях промывки биомассу осаждают центрифугированием (15 мин при 4^oС и скорости 6 тыс. об/мин), насадочную жидкость удаляют, а осадок биомассы ресуспендируют в 15,0 мл ЗФР, получают микробную взвесь с концентрацией 15,5 млрд. микробных тел в 1 мл по стандарту мутности. К ней добавляют 3,65 мл ЗФР, в результате получают взвесь с концентрацией 12 млрд. клеток в 1 мл. Затем полученную микробную взвесь прогревают на водяной бане при 60^oС в течение 60 мин. Для получения антигенного экстракта H.pylori посев со свежевыделенных уреазопозитивных токсигенных культур данного возбудителя выполняют, как описано выше, однако эмульгирование снятых шпаделем колоний производят в дистилированной воде. Микробную взвесь центрифугируют при 6 тыс. оборотов (15 мин, 4^oС), надосадочный слой удаляют, а осадок ресуспендируют в 15 мл 0,1 М глицинового буферного раствора рН 2,5, ресуспендированную микробную взвесь выдерживают на роторной мешалке 10 мин при (205)^oС и скорости вращения 5 об/мин, после чего центрифугируют, как указано выше, и надосадочную жидкость, содержащую антигенный экстракт, отсасывают (осадок удаляют), нейтрализуют 1 н. раствором NaOH, получают антигенный экстракт с концентрацией белка 1,45 мг/мл.

12,5 мл микробной взвеси Н.pylori с концентрацией 12 млрд. клеток в 1 мл смешивают с 12,5 мл антигенного экстракта, получают 25 мл антигена для иммунизации.

5 коров за 10 недель до ожидаемого отела иммунизируют внутримышечно, вводя каждому животному по 5 мл антигенной смеси, приготовленной указанным выше образом.

Через 4 недели и через 8 недель после внутримышечного введения антигена животных иммунизируют диателически, вводя в молочные ходы по 10 и 20 мл антигена соответственно.

Молоко для получения лактосыворотки берут на 3-и сутки лактации, обезжиривают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин, жировой слой удаляют, к 10 л обезжиренного молока добавляют 100 мл 10%-ного раствора СаСl, перемешивают, смесь нагревают на водяной бане до 37^oС и добавляют к ней 100 мл 10%-ного раствора пепсина и перемешивают 10 мин. После этого смесь оставляют на створаживание при температуре (203)^oС на 18-20 ч. Сгустки выпавшего казеина отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочный слой – лактосыворотку – отсасывают, осадок удаляют. К лактосыворотке добавляют 1 н. раствор NaOH до достижения рН 7,0 0,5. Лактосыворотку осветляют фильтрацией через волоконный фильтр для плазмафореза (фирмы Fresenins) и подвергают диализующей фильтрации через волоконный фильтр, концентрирующий АР-01 (производства Киришского завода ТМБ), используя для диафильтрации 30 л 0,001 М фосфатного буферного раствора рН 7,0. Диафильтрацию лактосыворотки завершают операцией концентрирования – диафильтрат рецикулируют через тот же фильтр АР-01 до тех пор, пока объем диафильтрата не уменьшится до 2 литров.

Концентрат стерилизуют фильтрацией через стерилизующую мембрану “Миллипор” A. G. с размером пор 0,45 мкм.

Полученный препарат лактосыворотки иммунной специфической против Н.pylori контролируют:
1) на содержание белка биуретовым методом;
2) содержание белковых фракций методом электрофореза в полиакриламидном геле;
3) содержание иммуноглобулинов класса G, класса А и класса М в реакции радиальной иммунодиффузии в геле агарозы;
4) концентрацию лактозы (методом иодометрии, по разнице между качеством, взятого и непрореагировавшего иода титрованием Na₂S₂О₂);
5) активность специфических антител против а) суммарного антигена Н. pylori; б) против токсина; в) против уреазы – в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА).

ИФА выполняют известными способами, в качестве антигена, сорбируемого на твердой фазе (в лунках полистирольного планшета для иммунологических реакций), используют: а) нейтрализованный антигенный экстракт из микробной массы Н. pylori, полученный, как описано выше, в концентрации 5 мкг/мл; б) ассоциированный с вакуолизирующим токсином рекомбинантный Cag A-ипотеин в концентрации 2 мкг/мл; в) рекомбинантную уреазу Н.pylori в концентрации 2 мкг/мл. В качестве детектора иммуноглобулинов используют меченные пероксидазой аффинно-очищенные антитела к иммуноглобулинам крупного рогатого скота в рабочем разведении (фирма Sigma).

Лактосыворотку иммунную специфическую, полученную, как указано выше, исследуют в ИФА параллельно с исследованием лактосыворотки из пула молока от 20 неиммунизированных коров (“нормальная лактосыворотка”). Иммунную и “нормальную” лактосыворотки предварительно разводят 1:800 ЗФР и исследуют в ИФА в последовательных разведениях: 1: 1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1: 25600. За титр антител в иммунной лактосыворотке принимают то ее наибольшее разведение, при исследовании которого показатель ИФА (оптическая плотность продукта реакции при длине волны 492 нм) в 2 раза и более превышает величину показателя ИФА “нормальной” лактосыворотки в том же разведении. Например: показатели ИФА иммунной лактосыворотки равны: в разведении 1:600 – 2,48; в разведении 1:3200 – 2,01; в разведении 1:6400 – 1,43; в разведении 1:12800 – 0,742; в разведении 1:25600 – 0,503. Показатели ИФА “нормальной” лактосыворотки: 1: 1600 – 0,485; 1:3200 – 0,438; 1:6400 – 0,386; 1:12800 0,308; 1: 25600 – 0,296. Наибольшее разведение, при котором соблюдается условие 2-кратного превышения показателя ИФА иммунной лактосыворотки над “нормальной” лактосывороткой – 1:12800. Это и есть титр антител иммунной лактосыворотки.

В результате контроля приготовленной по примеру 1 лактосывротки получают следующие данные, представленные в таблице. Процентное содержание белковых фракций иммунной лактосыворотки близко к таковому у известных аналогов и прототипа. Иммунная лактосыворотка содержит специфические антитела к антигенам Н.pylori в высоких титрах, сравнимых с титрами высокоактивных сывороток крови людей, инфицированных Н.pylori [5]. По содержанию лактозы препарат находится на уровне ареактогенных молочных смесей [2].

Пример 2
Молоко от иммунизированных коров (см. пример 1) собирают на 4-й день лактации и объединяют в пул (от 5 животных). 10 л пулированного молока используют для получения иммунной лактосыворотки в соответствии с условиями примера 1. Получают следующие результаты, предствавленные в таблице, которые принципиально близки к результатам контроля иммунной лактосыворотки из непулированного молока. Пример подтверждает возможность получения высокоактивного специфического препарата при выделении лактосыворотки из пула молока.

Пример 3
Индивидуальные образцы молока от иммунизированных коров, взятые на 2-, 6-, 8-, 10-е сутки лактации, фракционируют и получают из них лактосыворотку, как описано в примере 1.

Получают 20 образцов лактосыворотки, в которых определяют концентрацию белка и процентное соотношение белковых фракций, титры антител и концентрацию глюкозы. Максимальные уровни титров антител наблюдают на 2-е сутки лактации: к суммарному антигену Н. pylori 1:25600, к токсину 1:25600, к уреазе 1: 12800. Минимальные значения титров отмечают в лактосыворотках на 10-й день: 1:3200, 1:1600, 1:800 соответственно, что существенно ниже титров лактосыворотки от 8-го дня лактации: 1:12800, 1:6400, 1:6400 соответственно. Существенное падение титров после 8-го дня (в 4 и более раз) указывает на то обстоятельство, что использование молока после 8-го дня лактации для получения активного препарата нецелесообразно.

Исследование белкового состава иммунные лактосывороток, выделенных в период 2 – 8-й дни лактации, выявляет следующие колебания показателей: содержание общего белка (35 9) мг/мл; содержание иммуноглобулинов G – (26,3 2,1)%; иммуноглобулинов А – (12,3 1,9)%; иммуноглобулина М – (17,9 2,2)%; бета-лактоальбумин – (20 2,5)%; альфа-лактоальбумин – (10,5 1,1)%; сывороточного альбумина – (6,0 1,5)%.

Пример 4
Выполняют в соответствии с условиями примера 1 с тем отличием, что иммунизацию осуществляют термоинактивированной взвесью Н.pylori, без добавления антигенного экстракта. Получают препараты лактосывороток с низким содержанием антител к токсину и уреазе. Максимальные титры антител к этим антигенам отмечают в лактосыворотках от 2-го дня лактации: 1:1600 и 1:1600 соответственно, что существенно ниже, чем в предлагаемом изобретении.

Таким образом, представленные примеры реализации изобретения свидетельствуют о возможности получения нового препарата – лактосыворотки иммунной специфической против Helicobacter pylori, в отличие от прототипа и аналогов, обладающей биологической активностью и высокими титрами антител, против суммарного антигена Н.pylori, а также против токсина и уреазы данного микроба. Активность против двух последних антигенов имеет существенное значение в связи с тем, что они считаются основными факторами патогенности Н.pylori [6,7]. Предложенный способ получения иммунной лактосыворотки обеспечивает получение препарата с заявленными параметрами. При этом состав антигена для иммунизации коров имеет существенное значение для получения лактосыворотки с высокой специфической активностью антител. Предлагаемая для иммунизации смесь термоинактивированной культуры Н. pylori и антигенного экстракта из биомассы данного микроба обеспечивают высокие титры антител к токсину и уреазе, так же как и к суммарному антигену Н.pylori.

Источники информации:
1. Helicobacter pylori, Basio Mechanisnis to Clinical Cure. Edit. Hunt R.H., Tytgat G.N.J. Kluwer Acad, Publischers. Dordrecht/Boston/London, 1994.

2. Геннадьева Т. Я. , Колесникова Е.Н., Стрелкова М.Р. и др. Уровень сенсибилизации к белкам коровьего молока у детей при пероральном введении иммунных лактосывороток. В сб.: “Острые кишечные инфекции”, Л. – 1986, труды НИИЭМ им. Пастера, вып.10, с. 154-160.

3. Николаева Т. А., Геннадьева Т.Я., Капелюш Е.В. и др. Электрофоретическая характеристика противошигеллезных лактосывороток и влияние процесса ультрафильтрации на белковый состав препарата. В сб.: “Острые кишечные инфекции”, Л., 1987, Труды НИИЭМ им. Пастера, вып.11, с.67-70.

4. Brussow Y. e.a. J. Clin. Microbiol., 1987, v.25, 6, p.982-986.

5. Goodwin C.S. e.a. J. Infect. Dis., 1987, 3, 155: 488-494.

6. Figura N. and Crabtree J.E. In: “Helicobacter pylori, Basic Mechanisnis to Clinical Cure”. Kluwer Acad. Publaschcra Dordrecht/Boston/London, 1994, p.222-231.

7. Mobley H.T.L. and Foxall. Там же, стр.41-58.

Формула изобретения

1. Способ получения иммунной специфической лактосыворотки, включающий иммунизацию коров в период стельности, получение молока в ранние сроки лактации, обезжиривание молока, удаление казеина, осветление, диафильтрацию и концентрирование, отличающийся тем, что иммунизацию коров осуществляют смесью термоинактивированной культуры Н. pylori и антигенного экстракта из биомассы Н. pylori.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения термоинактивированной культуры и антигенного экстракта используют токсигенные уреазопозитивные штаммы Н. pylori, прошедшие предварительно не более 1 пассажа на искусственных питательных средах после выделения от больных гастродуоденальными заболеваниями.

3. Иммунная специфическая лактосыворотка, полученная по способу п. 1 или 2, отличающаяся тем, что содержит антитела к суммарному антигену Н. pylori в титре не ниже 1: 12800, к токсину – не ниже 1: 6400 и к уреазе – не ниже 1: 6400 при следующем соотношении компонентов, % от общего содержания белка:
Иммуноглобулин G – 25,951,15
Иммуноглобулин А – 11,850,75
Иммуноглобулин М – 16,950,05
Иммуноглобулины других классов – 0,750,3
Альфа-лактоглобулин – 10,650,55
Бета-лактоглобулин – 18,350,25
Сывороточный альбумин – 5,650,65
Остаточные белки – Остальное

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.12.2004

Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006