Патент на изобретение №2200950

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ ЛИПОПРОТЕИДОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

(57) Реферат:

Способ относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использован для диагностики в кардиологии. Способ разделения на фракции липопротеидов крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) включает электрофорез в геле агарозы, обработку пробы сыворотки крови пациента в течение часа в темноте раствором красителя судана Б, добавление раствора агарозы, внесение прогретой до 55^oС смеси в лунку геля агарозы, последующую фиксацию электрофореграмм, их высушивание и денситометрирование, при этом при обработке пробы сыворотки раствором красителя судана Б ее помещают в темный термостат при 40^oС, а прогретую смесь вносят в лунку объемом 4х20х10 мм. Технический результат: способ позволяет выявлять фракцию ЛА(а), что повышает его чувствительность и точность. 8 ил.

Изобретение относится к области медицины. Способ разделения липопротеидов (ЛП) крови на фракции может быть использован в кардиологии и терапии.

Известны способы разделения на фракции липопротеидов крови методом аналитического ультрацентрифугирования крови (А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева. “Липиды, липопротеиды и атеросклероз”, 1995, Питер, пресс, стр. 98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н.Н. Шацская. “Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы”. В кн. “Методы исследований в профпатологии”, М., 1988, стр. 95-97).

Описанные способы не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами.

Описан также способ разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (В.Н. Титов, М.Г. Кантарджан, И.К. Филиппов. “Фенотипирование гиперлипопротеидемий на основе электрофореза липопротеидов в геле агарозы”, Лаб. Дело, 1980, 5, стр. 287-290).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом). Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет выявить ЛП(а), кроме ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ХМ. Это связано с исследованием малого образца сыворотки крови. Концентрация ЛП(а) в крови очень низкая. В способе-прототипе лунка для внесения исследуемого образца сыворотки крови готовится в объеме металлического (стального) бруска с площадью основания 2х20 мм и высотой 10 мм, что не позволяет внести достаточно большой объем сыворотки крови для исследования.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение чувствительности способа.

Указанная задача достигается техническим решением, представляющим собой инкубацию сыворотки крови с красителем суданом Б при температуре 40^oС и исследование образца сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой по сравнению со способом-прототипом, с использованием лунки объемом 4х20х10 мм.

Новым в данном способе является то, что пробу вносят в лунку объемом 4х20х10 мм, дополнительно выделяют ЛП(а) и инкубируют пробу при температуре 40^oС.

При этом лунка изготавливается с помощью стального бруска с площадью основания 4х20 мм, а не 2х20 мм, как в способе-прототипе. Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения чувствительности способа: увеличение объема лунки в 2 раза с 2х20х10 мм до 4х20х10 мм, инкубация пробы крови при 40^oС и дополнительное выделение ЛП(а).

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения: “новизна”, “практическая применимость”, “изобретательский уровень”.

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеид крови. Он относится к апо-В-содержащим липопротеидам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен “тонущим” пре--ЛП (sinking pre--Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре--ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС – 14%, ФЛ – 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид – апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену – одному из факторов системы свертывания-противосвертывания крови. При росте концентрации ЛП(а) в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот, ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с -ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеид гетерогенен. Все это свидетельствует об особой роли ЛП(а) в атерогенезе.

ЛП(а) могут взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на активность ГМК-Ко А редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длинее, чем у ЛПНП, и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^a, II⁶ типами гиперлипопротеидемий. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а). Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а). Мировые популяционные исследования показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС – наиболее тяжелого проявления атеросклероза.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять ЛП(а).

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения ЛП(а). В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Лаб. Дело, 1980, 5, стр. 287-290).

Метод основан на электрофоретической подвижности липопротеидов крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных рисунков.

Способ осуществлялся следующим образом поэтапно:
1) приготовление раствора судана Б: 400 мг судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;
2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы “Sigma” растворяют в 20 мл воды для кипячения, затем помещают в термостат при 55^oС; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл вероналмединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 4х20 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;
3) по общепринятой методике вносят краситель в сыворотку крови: к 0,3 мл сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40^oС, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55^oС и подогретым вносят в желобок геля агарозы;
4) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4^oС при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;
5) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;
6) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

В группе контроля в случае использования способа-прототипа (n=10) и предлагаемого способа (n=12) выявлены ХМ, ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП (фиг. 1 и 2).

Нами обследованы 2 группы больных ИБС по 30 в каждой (для способа-прототипа) – I группа и 52 пациента – II группа для проведения электрофореза ЛП с помощью предлагаемого способа.

У пациентов I группы выявлены II^a, II^б и IV тип гиперлипопротеидемий (фиг. 3, 4 и 5).

У 11 пациентов II группы с наличием гиперхолестеролемии (ГХС) в пределах 7,5-14,6 ммоль/л холестерола в крови (среднее значение ХС 100,8 ммоль/л), кроме фракций ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП, в зоне между ЛПНП и ЛПОНП выявлена фракция ЛП(а). У остальных пациентов этой группы фракция ЛП(а) не выявлена.

Клинический пример
Пациент В. , 52 года. История болезни 291. Поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН с жалобами на колющие и сжимающие боли за грудиной и в области сердца, возникающие при физической нагрузке, снимающиеся нитроглицерином, с жалобами на головные боли, одышку при физической нагрузке. АД 220/110 мм рт. ст., пульс в покое 74 удара в минуту.

Диагноз: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения ФК II-III; артериальная гипертензия.

Результаты лабораторных исследований:
ХС общий – 9,1 ммоль/л,
Триацилглицериды – 1,4 ммоль/л,
ХС ЛПВП – 1,06 ммоль/л.

Результаты электрофоретического ЛП крови по способу-прототипу представлены на фиг. 6, а по предлагаемому способу – на фиг. 7. Выявлены следы ХМ, ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, ЛП(а).

В случае же использования дополнительно к способу-прототипу только добавочной инкубации исследуемого образца суданом Б 1 час в темном термостате при температуре 40^oС и внесении его в лунку 2х20 мм либо только увеличения объема лунки до 4х20 мм без дополнительной инкубации пробы фракции ЛПНП и ЛПОНП выявлялись несколько лучше, чем в контроле, а ЛП(а) определялась в виде следовой полосы, что не позволяло ее денситометрировать и, следовательно, оценивать количественно (фиг. 8).

Итак, фиг. 1 и 2 – это нормальная липидограмма: на линии старта следы хиломикронов (ХМ), затем выше следуют -ЛП (ЛПНП), далее пре-ЛП (ЛПОНП) и -ЛП (ЛПВП). На фиг. 3,4 и 5 представлены II^a тип гиперлипопротеидемии (ГЛП); II^б тип ГЛП с высоким содержанием -ЛП и пре-ЛП (ЛПНП и ЛПОНП) и IV тип ГЛП с высоким содержанием пре-ЛП (ЛПОНП). При исследовании ЛП сыворотки крови больного ишемической болезнью сердца (ИБС) по способу-прототипу (клинический пример) выявлены ХМ, -ЛП (ЛПНП), пре-ЛП (ЛПОНП) и -ЛП (ЛПВП), а при исследовании по предлагаемому способу выявлена дополнительная фракция ЛП в зоне между – и пре-ЛП (фиг. 6 и 7).

Использование предлагаемого способа позволило выявить у больных ИБС с выраженной гиперлипопротеидемией наличие ЛП(а) способом электрофореза ЛП в геле агарозы.

Применение предлагаемого способа разделения на фракции ЛП крови в отличие от способа-прототипа позволило вывить дополнительную фракцию ЛП(а), что повысило чувствительность и точность способа.

При этом предлагаемый способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов.

Формула изобретения

Способ разделения на фракции липопротеидов крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) с помощью электрофореза в геле агарозы путем обработки пробы сыворотки крови пациента в течение часа в темноте раствором красителя судана Б, добавления раствора агарозы, внесения прогретой до 55^oС смеси в лунку геля агарозы с последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием и денситометрированием, отличающийся тем, что при обработке пробы сыворотки раствором красителя судана Б ее помещают в темный термостат при 40^oС, а прогретую смесь вносят в лунку объемом 4x20x10 мм.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.01.2004

Извещение опубликовано: 10.03.2006 БИ: 07/2006