Патент на изобретение №2200318

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и касается приготовления хромосомных препаратов для анализа кариотипа клеток костного мозга при заболеваниях системы крови. Способ заключается в колхинизации и гипотонизации клеток костного мозга, после которых проводят 7-минутную префиксацию в 6% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре с последующей фиксацией и нанесением клеточной взвеси на предметное стекло. Технический результат: увеличение митотического индекса в получаемом препарате, что позволяет повысить точность анализа кариотипа клеток костного мозга у больных гемобластозами.

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и касается приготовления хромосомных препаратов из клеток костного мозга больных гемобластозами.

В основе развития гемобластозов лежат перестройки генетического аппарата клетки, которые, в частности, могут выражаться в виде изменений кариотипа или сопровождаться ими. Анализ кариотипа позволяет уточнить диагноз и вариант заболевания, проводить динамическое наблюдение за больным в период ремиссии и рецидива, оценивать прогноз (Acute Leukemias VI. Prognostic Factors and Treatment Strategies. /Buchner T. et al. (eds.).- 1997.- Springer-Verlag -Berlin – Heidelberg,- 997 P.).

В настоящее время для кариотипирования клеток костного мозга у больных гемобластозами приготовляют хромосомные препараты “прямым” методом и/или после кратковременного культивирования клеток (Human cytogenetics. A practical approach. /Rooney D.E., Czepulkowsky B.H. (eds.).-1992.- Oxford Univ. Press. – Vol. 1. – P.91-117). Успешность проведения цитогенетического исследования при заболеваниях системы крови во многом определяется митотическим индексом и качеством морфологии хромосом в препарате. Высокие требования к качеству (митотический индекс, морфология хромосом) хромосомных препаратов особенно актуальны при миелодиспластическом синдроме в связи с нередкой низкой клеточностью образцов костного мозга при данной патологии, что затрудняет, а порой делает невозможным адекватную оценку кариотипа.

Стандартный способ приготовления препаратов метафазных хромосом, избранный нами в качестве прототипа, описан в руководстве “Human chromosomes” (Venna R.S. and Babu A. Human chromosomes.- 1989.- Pergamon Press, In1. New York. – 240 P.). Прототип включает ряд последовательных этапов – колхицинизацию клеток, их гипотонизацию с последующей фиксацией и нанесение клеточной взвеси на предметное стекло. При приготовлении хромосомных препаратов в соответствии с прототипом происходит значительная потеря метафаз на этапе стандартной фиксации гипотонизированных клеток смесью метанол-уксусная кислота. Такая потеря метафазных пластинок отражается на скорости анализа кариотипа и в ряде случаев на адекватности самой оценки кариотипа анализируемых клеток, которая требует исследования не менее 20 метафаз. Для устранения этого недостатка мы впервые применили перед стандартной фиксацией 7-минутную префиксацию гипотонизированных клеток костного мозга в 6% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре.

Цель изобретения – ускорение и повышение точности анализа кариотипа клеток костного мозга у больных гемобластозами.

Поставленная цель достигается повышением митотического индекса в хромосомных препаратах благодаря применению 7-минутной префиксации гипотонизированных клеток костного мозга в 6% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре.

Способ применяют следующим образом. Для приготовления хромосомных препаратов “прямым” методом берется 1 – 2 мл образца костного мозга в гепаринизированный шприц. Добавляется 5-10 капель образца в центрифужную пробирку объемом 12-15 мл с 10 мл предварительно нагретой до 37^oС среды RPMI-1640 без добавок, и содержимое тщательно суспендируется. Клеточная взвесь центрифугируется при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатант сливается, а к осадку добавляется новая порция недополненной среды, в которой клетки вновь суспендируются и центрифугируются. Полученный осадок клеток заливается 10 мл культуральной смеси, состоящей из 8 мл среды RPMI-1640, 2 мл инактированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и L-глутамина с конечной концентрацией 292 мкг/мл. Далее в культуральную смесь добавляется колцемид (или колхицин) в концентрации 0,05 мкг/мл, и клетки инкубируются в течение 30 мин при 37^oС в водяной бане. После инкубации клетки осаждаются ценрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин (перед центрифугированием недиссоцированные клеточные агрегаты (или кусочки ткани) осторожно удаляются пипеткой или пинцетом). По окончании центрифугирования супернатант удаляется, при этом оставляется 0,3-0,5 мл культуральной смеси над осадком. Осадок разбивается энергичным встряхиванием, ресуспендируется в 5 – 7 мл нагретого до 37^oС гипотонического (0,075 М) раствора КСl, и клетки инкубируются в течение 5-10 мин при 37^oС. Затем клетки центрифугируются при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляется, а осадок тщательно разбивается встряхиванием в примерно 0,5 мл супернатанта. Далее клетки ресуспендируются при осторожном перемешивании в 5-7 мл 6% раствора уксусной кислоты, выдерживаются 2 мин при комнатной температуре и центрифугируются при 1000 об/мин в течение 5 мин. Общее время префиксации в 6% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре составляет 7 мин. По окончании центрифугирования осадок ресуспендируется в приблизительно 0,5 мл супернатанта, и к клеточной взвеси добавляется при осторожном перемешивании 5-7 мл свежеприготовленной стандартной фиксирующей смеси метанол-уксусная кислота в соотношении 3:1. После 10-минутной инкубации в фиксаторе при комнатной температуре клетки вновь осаждаются центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре и ресупендируются в 5 мл свежего фиксатора. Последняя процедура повторяется еще 3-4 раза. После последнего центрифугирования клетки ресуспендируются в небольшом объеме (приблизительно от 0,5 до 1 мл в зависимости от величины осадка) фиксатора. Затем на охлажденное, смоченное водой стекло наносятся 4 – 5 капель суспензии одна возле другой.

Для приготовления хромосомных препаратов из клеток костного мозга после их кратковременного культивирования пунктат костного мозга объемом 1 – 2 мл берется в гепаринизированный шприц и переносится в стерильную пробирку. К 1 мл образца добавляется 10 мл 0,85% стерильного раствора хлорида аммония и после суспендирования содержимое выдерживается в течение 2-3 час при комнатной температуре. Затем клетки осаждаются центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, дважды отмываются недополненной средой RPMI-1640. После последней отмывки клетки суспендируются в 2 мл культуральной смеси (см. выше) с антибиотиками (пенициллин – 100 ед/мл и стрептомицин – 100 мкг/мл), и определяется концентрация клеток. В зависимости от клеточности суспензии материал делится на один или несколько культур с конечной концентрацией (1-2)x10⁶/мл в культуральной смеси. Культивирование проводится в культуральной смеси объемом 5 мл в стерильных бакпечатках объемом 15 мл (или пенициллиновых флаконах) при 37^oС в течение 24 – 48 час. За 20 мин до окончания культивирования добавляется колцемид в конечной концентрации 0,05 мкг/мл. После инкубации с колцемидом дальнейшая обработка клеток проводится, как при “прямом” приготовлении хромосомных препаратов (см. выше).

Благодаря применению 7-минутной префиксации гипотонизированных клеток костного мозга в 6% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре удалось повысить митотический индекс в хромосомных препаратах в 1,5-2 раза, что ускоряет и повышает точность анализа кариотипа клеток костного мозга у больных гемобластозами.

Пример. Больная К. , 24 лет, наблюдалась в гематологической клинике с 14.04.2000. На основании комплексного обследования установлен диагноз: миелодиспластический синдром, рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации.

При поступлении состояние больной – тяжелое. Бледность кожи и слизистых. Фебрильная гипертермия, слабость, утомляемость. В анализе крови: Нb – 67 г/л, Эр. – 2.0510¹²/л, Лек.-2,410⁹/л, мбл – 3%, п/м – 1%, м – 1%, п/я – 3%, с/я – 19%, лф – 67%, мон – 8%, тромб. – 18010⁹/л, СОЭ – 80 мм/час. В миелограмме – клеточность костного мозга снижена – 1010⁹/л, костный мозг полиморфный, имеет место дисплазия всех ростков кроветворения, количество бластов повышено и составляет 25%.

Для оценки кариотипа у данной больной был получен пунктат костного мозга объемом 2 мл. Исходная концентрация ядерных клеток составила 10х10⁶/мл. Образец костного мозга разделили на две равные по объему части. Последующая обработка образцов проводилась двумя способами – с применением и без применения префиксации. Хромосомные препараты, приготовленные с применением (I) и без применения (II) префиксации, были проанализированы после стандартного дифференциального G-окрашивания. В препаратах I и II митотические индексы составили соответственно 0,008 и 0,004, а для кариотипирования оказались пригодными 39 и 16 метафаз, соответственно. Затрата времени на поиск 16 адекватных для анализа метафаз в препарате I была в примерно 2 раза меньше, чем в препарате II. При анализе кариотипа клеток в препарате I было выявлено 2 цитогенетических клона: 45, XX, -7, inv3 (18)/46, XX (1). В то время как при исследовании препарата II был обнаружен только один клон клеток – с аномальным кариотипом 45, XX, -7, inv3 (16).

Формула изобретения

Способ приготовления препаратов метафазных хромосом из клеток костного мозга больных гемобластозами, заключающийся в том, что после последовательных этапов – колхинизации и гипотонизации клеток костного мозга проводят 7-минутную префиксацию в 6% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре с последующей их фиксацией и нанесением клеточной взвеси на предметное стекло.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.06.2002

Извещение опубликовано: 20.08.2006 БИ: 23/2006