Патент на изобретение №2200195

(54) ШТАММ STAPHYLOCOCCUS WARNERI IEGM KL-1 – ПРОДУЦЕНТ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕПТИДНОГО СОЕДИНЕНИЯ, ИНГИБИРУЮЩЕГО РОСТ КЛЕТОК ГРАМПОЗИТИВНЫХ БАКТЕРИЙ

(57) Реферат:

Предложен новый штамм бактерий Staphylococcus warneri IEGM KL-1 (депонирован в коллекции ГНИИСКМБП им. Тарасевича под номером 260), способный продуцировать при росте на среде LB низкомолекулярное пептидное соединение, ингибирующее развитие грампозитивных бактерий различных родов и семейств. Выделяемый штаммом фактор воздействия на бактерии имеет пептидную природу, молекулярная масса менее 3000 дальтон. Ингибирующая активность сохраняется после 3-кратного кипячения в течение 10 мин. Штамм обеспечивает высокий уровень накопления антибактериального пептида и может служить источником получения антибиотика нового поколения. 1 ил., 1 табл.

Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-l, продуцент низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост клеток грампозитивных бактерий.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и касается получения штамма Staphylococcus warneri IEGM KL-l – продуцента низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост грампозитивных бактерий.

Продукция микроорганизмами биологически активных соединений в окружающую среду хорошо известна и давно используется человечеством в практических целях. Особое место среди микробных продуктов принадлежит белковым антибактериальным веществам – бактериоцинам, которые провоцируют антагонистические реакции между клетками, выделяющими эти соединения, а в более редких случаях и между клетками родственных внутривидовых штаммов.

В последние годы внимание исследователей привлечено к группе функционально подобных бактериоцинам низкомолекулярных пептидов. Секреция или введение в среду культивирования пептидов этого типа не оказывает какого-либо действия на клетки родительского штамма, но приводит к торможению роста и гибели чувствительных клеток других видов данного рода, а также бактерий других родов и даже семейств, что позволяет рассматривать низкомолекулярные антибактериальные пептиды в качестве природных антибиотиков нового поколения, перспективных для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний животных и человека [1].

Выделение антибактериальных соединений является распространенным признаком бактерий рода Staphylococcus, которые являются продуцентами как стафилоцинов (типичных бактериоцинов), так и бактериоциноподобных пептидных соединений невысокой молекулярной массы.

В литературе описаны штаммы стафилококков, которые могут представлять интерес для биотехнологии получения антибактериальных пептидов в коммерческих целях.

Известен штамм Staphylococcus epidermidis 5, секретирующий в окружающую среду пептидное соединение Пеп5 (Рер5) с мол. массой ниже 6 кДа. Спектр чувствительных к Пеп5 бактерий ограничен штаммами других видов рода Staphylococcus и некоторыми видами рода Micrococcus [2].

Синтез и продукция в среду небольшого антибактериального пептида Эпицидина 280 (Epicidin 280) с мол. массой 3133 Да характерны для штамма Staphylococcus epidermidis BN 280 при культивировании на богатых средах. Ингибирующее рост бактерий действие эпицидина 280 распространяется также, как и в случае Пеп5, только на другие штаммы стафилококков и микрококков [3].

Штамм-продуцент низкомолекулярного циклического пептидного антибиотика галлидермина (gallidermin) – Staphylococcus gallinarum Tu 3928, депонированный в Национальной коллекции Германии (DSM 4616), является источником нового антибактериального белкового соединения, которое обладает более широким спектром действия, включающим бактерии родов Staphylococcus, Micrococcus и Streptococcus. Продукция этого соединения происходит только на сверхбогатой питательной среде, содержащей следующие компоненты, г/л: мясной экстракт – 33; дрожжевой экстракт – 30; гидрат окиси кальция – 3,8; хлористый натрий – 60 и в условиях повышенной аэрации ферментеров при скорости мешалки не менее 900 об/мин, что делает малорентабельным использование данного штамма для промышленного получения антибактериального продукта.

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Staphylococcus aureus KSI 1829 [4], выделяющий в среду роста пептидное соединение с мол. массой 6,4 кДа, вызывающее ингибирование роста клеток других видов стафилококков, а также штаммов бактерий родов Streptococcus, Corynebacterium, Bordetella, Moraxella и Haemophilus. Секреция этого соединения происходит при культивировании на обогащенной питательной среде 2X-YT, имеющей состав, г/л: бактотриптон – 16, дрожжевой экстракт – 10, натрий хлористый – 5. В условиях интенсивной аэрации при скорости мешалки 180 об/мин уровень пептида в среде достигает максимума 72000 У.Е./л среды.

Таким образом, представленные известные штаммы обладают:
– относительно невысоким уровнем продукции антибактериальных пептидов;
– ингибирующее действие продуцируемых пептидов ограничено сравнительно узким кругом микроорганизмов;
– биосинтез антибактериальных пептидов происходит при культивировании на средах, обогащенных питательными компонентами, что значительно увеличивает материальные затраты на их производство;
– режим культивирования требует больших энергетических трат для обеспечения высокого уровня аэрации ферментеров.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение нового штамма микроорганизмов-продуцентов низкомолекулярного пептидного соединения, обладающего широким спектром антибактериального действия.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в повышенном выходе целевого соединения широкого спектра антибактериального действия на обычной питательной среде.

Сущность объекта изобретения – штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1, секретирующий при культивировании на обычных питательных средах – мясопептонном бульоне (МПБ) и среде LB повышенные количества низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост чувствительных грампозитивных бактерий различных родов и семейств.

Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1 выделен в 1996 г. из воздуха лабораторных помещений Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при проведении скрининга воздушной микрофлоры детекцией роста микроорганизмов, продуцирующих антибактериальные соединения, на открытых чашках Петри, содержащих газон тестерной культуры, выращенной на полноценной питательной среде – мясопептонном агаре [6].

Штамм депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича под номером 260 как продуцент низкомолекулярного антибактериального пептида широкого спектра действия, отличающийся от известных штаммов значительно более высоким уровнем продукции указанного соединения при культивировании на обычных питательных средах.

Условия хранения – в лиофилизированном состоянии (коллекция ГНИИСКМБП им. Тарасевича), на плотной агаризованной среде LB под вазелиновым маслом и на косяках со скошенным LB-агаром (в лабораторных условиях).

Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами.

Бактерии представляют собой клетки сферической формы, диаметром 0,8-1,2 мкм, грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, в фиксированных мазках расположены одиночно, парами, тетрадами, а в местах скоплений в виде типичных для стафилококков гроздьев.

Рост на мясопептонном агаре.

При высеве со скошенного агара штрихом растут в виде гладких, круглых с ровными краями светло-серых колоний, размер которых в аэробных условиях при 37^oС через 24 часа составляет 1,2-1,5 мм, через 48 часов – 1,6-1,8 мм и через 72 часа – 1,9-2,1 мм. На третьи сутки центральная часть колоний становится слегка шатрообразно приподнятой. Колонии легко снимаются с поверхности агара микробиологической петлей.

Рост на среде LB.

При инокулировании среды жидкой культурой в условиях перемешивания наблюдается быстрый рост в виде гомогенной взвеси, при отстаивании которой бактериальные клетки равномерно оседают на дно сосуда и легко переходят во взвешенное состояние при встряхивании. Оптическая плотность гомогенной жидкой культуры в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды, при выращивании на термостатируемом шейкере УВМТ-12-250 при 160 об/мин и 37^oС достигает к 8 часу роста 2,5-2,7 ЕД, а через сутки – 3,1-3,4 (детектор ФЭК-56, длина волны 540 нм, кювета 3 мм).

Рост на среде LB, содержащей 10% хлористого натрия.

Параметры роста практически совпадают с представленными для этой среды без хлористого натрия.

Рост на синтетической аминокислотной среде, предложенной для выращивания стафилококков [7].

При выращивании в условиях, представленных для среды LB, развитие происходит значительно медленнее – через 8 часов роста опт. плотность культуры составляет 0,35-0,4 Е. Д., а через сутки – лишь 0,61-0,64. В этих условиях культивирования антибактериальное соединение в среде роста ее обнаруживается.

Бактерии быстро лизируются под действием лизостафина и малочувствительны к действию лизоцима.

Биохимические признаки
Оксидазоотрицательны. Образуют кислоту при окислении в аэробных условиях галактозы, глицерина, мальтозы, трегалозы, рибозы, целлобиозы, маннита, сахарозы и глюкозы. Сбраживают маннит, глюкозу, сахарозу, рибозу, глицерин, трегалозу, мальтозу и галактозу. Не обладают нитратредуктазой, слабо образуют ацетоин, не вызывают гемолиза и не коагулируют кроличью сыворотку, чувствительны к новобиоцину.

Сопоставление перечисленных физиолого-биохимических особенностей депонируемого штамма с дифференцирующими признаками видов и подвидов рода Staphylococcus, приведенными в “Определителе бактерий Берджи” [8], а также с перечнем биологических признаков видов и подвидов рода Staphylococcus, наиболее важных для идентификации различных видов, и схемой видовой идентификации коагулазонегативных стафилококков, предложенными А.К. Акатовым и B.C. Зуевой [9] , позволяет классифицировать его в качестве одного из штаммов вида Staphylococcus warneri.

Продукт, синтезируемый штаммом
При культивировании в периодических условиях на богатой питательной среде LB бактерии выделяют в среду роста антибактериальное соединение, оказывающее ингибирующее действие на рост ряда грампозитивных бактерий – стафилококков, стрептококков, коринебактерии и бацилл, которое проявляется при внесении аликвот среды культивирования продуцента в среду роста чувствительных бактерий.

Ингибирующая активность центрифугатов (10000 g, 10 мин) сред культивирования сохраняется после 3-кратного кипячения в течение 10 мин.

Обработка активных препаратов нуклеазами – ДНК-азой и РНК-азой не сказывается на их биологической активности; в то же время активность в препаратах полностью исчезает после протеолиза трипсином. При ультрафильтрации в системе Centricon-3 (Amicon) антибактериальная активность препаратов полностью обнаруживается в ультрафильтрате.

Представленные факты подтверждают пептидную природу фактора, обладающего молекулярной массой менее 3000 дальтон.

Продуктивность штамма.

Продуктивность штамма исследована путем изучения динамики количества выделяемого продуцентом в среду роста соединения, ингибирующего развитие тест-бактерий Staphylococcus epidermidis. Выделение фактора в среду происходит в течение логарифмической фазы роста продуцента на LB, причем этот процесс, по-видимому, находится под контролем популяционных механизмов, так как при достижении определенной концентрации дальнейшего накопления его в среде не происходит. Типичным является проявление ингибирующего действия фильтратов в разведении 1: 32-1: 64 при плотности культуры 1,9-2,2 и при указанном выше методе изучения динамики биомассы в процессе роста бактериальной культуры. Таким образом, уровень продукции антибактериального соединения достигает 320000-640000 У.Е./л среды.

Способ определения активности штамма
Определение динамики антибактериальной активности в среде культивирования продуцента проводили в иммунологических планшетах, используя принцип двукратных разведений аликвот супернатантов культуры в среде LB. В лунки планшета вносили по 100 мкл среды LB. В первую лунку ряда добавляли 100 мкл выемок сред культивирования, которые предварительно подвергали центрифугированию (10000 g, 10 мин) в стерильных условиях и кипячению в течение 10 мин. Путем последовательного переноса 100 мкл содержимого первой лунки ряда в последующие готовили ряд разведений от 1:2 до 1:256.

В каждую лунку вносили 10 мкл тест-культуры S. epidermidis. В качестве инокулума использовали клетки логарифмической фазы роста, дважды промытые свежей средой культивирования центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин и суспендированные в ней до плотности 1,82,010⁴ КОЕ/мл. Эффективность ингибирующего действия оценивали через 12-16 часов культивирования при 37^oС.

О количестве антибактериального фактора в исследуемом препарате судили по последней лунке планшета, в которой наблюдалось полное отсутствие роста, принимая его равным величине, обратной разведению. Способ, условия и состав сред для хранения штамма
В лабораторных условиях штамм хранится после посева петлей на косяках МПА с пересевом каждые три месяца, либо под вазелиновым маслом в столбиках МПА при посеве уколом и пересеве каждые 6 месяцев.

Для лиофилизации штамма в качестве криопротектора использован сахарозо-желатиновый агар по прописи Файбича [10], содержащий 10% сахарозы, 1,5% желатина и 0,1% агара. Ежегодное исследование продукции антибактериального фактора лиофилизированным штаммом показало полное сохранение этого признака с момента лиофилизации в 1996 году.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма
Для культивирования штамма могут быть использованы обычные питательные среды, в частности МПБ и МПА. Культура бактерий интенсивно развивается при культивировании на термостатируемых шейкерах и в термостатах при 37^oС.

Отношение к фагам
Чувствительность бактерий данного штамма к фагам исследована в Пермском НПО “БИОМЕД” д.м.н. Н.П. Ефимовой. Штамм оказался не чувствительным к типовым диагностическим бактериофагам (Международный набор “4”, Великобритания) даже при использовании 1:000 ТР (тест-разведения), но хорошо лизировался лечебным фагом в разведении 1:10000.

Генетические особенности
Антибиотикочувствительность штамма исследована традиционным методом с использованием стандартных дисков [11], содержащих различные по механизму действия на бактерии антибиотики. Учет зон торможения роста проводили через 18 часов. Средний диаметр зоны торможения, мм: ампициллин -15,1; ристомицин -13,2; гентамицин -11,5; рифампицин -31,8; левомицетин – 25,2; стрептомицин – 14,5; линкомицин – 23,7; тетрациклин – 27,8; неомицин -11,3; цефалексин – 26,5; новобиоцин – 23,5; фузидин – 29,3; оксациллин – 27,3; эритромицин – 20,3.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1
При культивировании продуцента – бактерий Staphylococcus warneri IEGM KL 1 на среде LB, содержащей 1% триптона (Difco), 0,5% дрожжевого экстракта и 0,64% КСl, при перемешивании и температуре 37^oС выделение антибактериального соединения начинается, как это представлено на чертеже, в начале фазы логарифмического роста и достигает максимума к 7 часу роста культуры.

Пример 2
Антибактериальное действие супернатантов среды культивирования Staphylococcus warneri IEGM KL 1 представлено в таблице.

Таким образом, предлагаемый штамм является продуцентом низкомолекулярного антибактериального пептидного соединения, проявляющего ингибирующее действие в отношении широкого спектра грампозитивных микроорганизмов. Штамм характеризуется высоким уровнем продукции этого соединения, достигающим 620000 У.Е./л среды при культивировании на обычных питательных средах – мясопептонном бульоне и среде LB. Продукция пептидного соединения в режиме периодического культивирования в отличие от известных примеров начинается при переходе бактериальной культуры в стадию логарифмического роста и заканчивается при переходе в стационар.

Источники информации
1. Baba T. and Schneewind O. – Insstruments of microbial warfare: bacteriocin synthesis, toxicity and immunity. – Treuds in Microb., 1998, 6.66-71.

2. Sahl H.-G., Brandis H. – Production, purification and clinical properties of an antistaphylococcal agent produced by Staphylococcus epidermidis. – J. Gen. Microbiology, 1981, 127, 377-384.

3. Heidrich C., Pag U., Josten M., Metzger J., Jack R.W., Bierbaum G., Jung G. , Sahl H.-G. – Isolation, characterization and heterologous expression of the novel lantibiotic epicidin 280 and analysis of its biosynthetic gene cluster. – Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, 3140-3146.

4. Jung G., Kellner R., Zahner H., Gotz F., Horner T., Werner R., Allgaier H. – Polycyclic peptide antibiotic gallidermin. – US Patent, 5231013.

5. Jandolo J. and Crupper S. – Broad spectrum antibiotic peptide. – US Patent 5703040.

6. Коробов В.П., Лемкина Л.М. – Продукция антистафилококкового фактора культурой грамположительных кокков. – В кн.: Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы. – Тез.докл. Межд.конф., Пермь, 1996, с.50-51.

7. Игнатов В.В. Биохимия стафилококка. – Изд-во Саратовского университета, 1975, с.112-113.

8. Определитель бактерий Берджи. 9-е издание. Под редакцией Дж.Хоулта, Н. Крига, Р.Снита, Дж.Стэйли и С.Уилльямса. Перевод с англ. под редакцией Г. А. Заварзина. М.: Мир, 1997, тт.1-2, 800 с.

9. Акатов А.К. и Зуева В.С. – Стафилококки, М.: Медицина, 1983, 242 с.

10. Ившина И.Б., Каменских Т.Н. и др. – Микробиология, 1994, т.63, вып. 1, с.118-128.

11. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам, М.: Медицина, 1984, 272 с.

Формула изобретения

Штамм бактерий Staphylococcus wameri IEGM KL-1 (депонирован в коллекции ГНИИСКМБП им. Тарасевича под номером 260) – продуцент низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего развитие грампозитивных бактерий.

РИСУНКИ