Патент на изобретение №2199343

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных препаратов. Способ осуществляют путем солевой экстракции спиртового осадка сыворотки крови человека, очистки его от липопротеидов с использованием хлороформа, выделения целевого продукта спиртовым осаждением при центрифугировании, разведения осадка иммуноглобулинов в растворе глицина, стерилизующей фильтрации и лиофилизации, при этом разведение спиртового осадка плазмы крови человека проводят с использованием раствора хлорида натрия с ионной силой 0,01-0,015, 10-20 объемов по отношению к весу осадка, выделяют осадок иммуноглобулинов добавлением этилового спирта, центрифугируют, осадок разводят в 10-15 раз с использованием 0,05-0,07 М буферного раствора с рН 3,8-3,9, добавляют к полученному раствору хлорид натрия до конечной концентрации 0,075-0,1 М и хлороформ до 13-15%, отделяют полученный осадок липопротеидов центрифугированием, проводя эту процедуру не менее двух раз, к полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия и этиловый спирт, центрифугируют, фильтруют, осадок целевого продукта разводят в растворе глицина, устанавливают рН раствора 4,0-4,5. Технический результат – повышение качества целевого продукта за счет увеличения содержания иммуноглобулинов А и М в получаемом препарате.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата из осадка Б (III фракция Кона) (Патент RU 2060034, кл. А 61 K 39/395, опубликован 06.09.91).

Способ предусматривает солевую экстракцию спиртового осадка Б сыворотки крови (III фракция Кона) в 0,9% растворе хлорида натрия. Очистку от липопротеидов экстракта осадка Б ведут хлороформом (10% по объему) с последующим осаждением иммуноглобулиновой фракции в присутствии 12% полиэтиленгликоля. Полученный осадок иммуноглобулинов разводят в 0,9% растворе хлорида натрия, центрифугируют для удаления нерастворимых примесей. К раствору после центрифугирования добавляют глюкозу до конечной концентрации 2% и подвергают стерилизующей фильтрации.

Недостатком способа является то, что он предусматривает получение препарата, содержащего нежелательные примеси остаточного полиэтиленгликоля. Кроме того, полученный раствор иммуноглобулинов содержит значительные количества фибриногена и фибрина, соосаждающихся с иммуноглобулинами. Данные примеси существенно затрудняют стерилизующую фильтрацию и обуславливают нестабильность препарата при хранении в жидком виде. Следствием этого является необходимость немедленного розлива и лиофильного высушивания после фильтрации. Потери в конечном выходе препарата из-за затрудненной фильтрации и необходимости повторного проведения этой процедуры достигают 30%.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату является способ получения иммуноглобулинового препарата из осадка Б (III фракция Кона), защищенный патентом RU 2158137, кл. А 61 K 39/395, опубликованным 27.10.00).

Способ предусматривает разведение осадка Б в 0,9% растворе хлорида натрия. Очистку экстракта осадка Б проводят добавлением хлороформа до 10% по объему с последующим отделением балластного осадка центрифугированием. Выделение иммуноглобулиновой фракции проводят с использованием этилового спирта при рН раствора 6,90,5 проточно-зональным центрифугированием. Полученный осадок целевого продукта разводят в 0,9% растворе хлорида натрия с добавлением 20,5% глюкозы и 2-3% глицина. Раствор целевого продукта фильтруют через пористый стеклянный фильтр, затем подвергают стерилизующей фильтрации.

Недостатком способа является то, что суммарное содержание иммуноглобулинов классов А и М в получаемых препаратах не превышает 30% от общего количества иммуноглобулинов. Однократное проведение спиртового осаждения не обеспечивает полного удаления примесей липопротеидов, ухудшающих качество препарата после лиофилизации. Наличие в готовом продукте хлорида натрия способствует денатурации белков в процессе лиофилизации, а присутствие глюкозы иногда вызывает карамелизацию готового продукта.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, – совершенствование способа получения иммуноглобулинового препарата.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении качества целевого продукта за счет увеличения содержания иммуноглобулинов А и М в получаемом препарате.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения иммуноглобулинового препарата из крови человека путем разведения спиртового осадка сыворотки крови человека, очистки его от липопротеидов с использованием хлороформа, выделения целевого продукта спиртовым осаждением при центрифугировании, разведения осадка иммуноглобулинов в растворе, содержащем хлорид натрия, глюкозу и глицин, стерилизующей фильтрации и лиофилизации разведение спиртового осадка плазмы крови человека проводят с использованием раствора хлорида натрия с ионной силой 0,01-0,015, 10-20 объемов по отношению к весу осадка, выделяют осадок иммуноглобулинов добавлением этилового спирта до конечной концентрации 13-17% и центрифугированием, разводят в 10-15 раз с использованием 0,05-0,07 М буферного раствора с рН 3,8-3,9, добавляют к полученному раствору хлорид натрия до конечной концентрации 0,075-0,1 М и хлороформ до 13-15%, отделяют полученный осадок липопротеидов центрифугированием, проводя эту процедуру не менее двух раз, к полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия до рН 4,9-5,0 и этиловый спирт до конечной концентрации 4-6%, отделяют полученный балластный осадок центрифугированием, фильтруют центрифугат, осадок целевого продукта разводят в 2-3% растворе глицина, не содержащем хлорида натрия и глюкозы, устанавливают рН раствора 4,0-4,5.

Способ осуществляют следующим образом. Разведение спиртового осадка Б плазмы крови человека проводят с использованием солевого раствора с ионной силой 0,01-0,015 М, 10-20 объемов по отношению к весу осадка Б. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение объема экстрагирующего раствора затрудняет растворение осадка, а увеличение является технологически нецелесообразным. Снижение ионной силы раствора ниже указанной ухудшает растворение осадка, а превышение указанного предела ведет к снижению содержания иммуноглобулинов А и М в целевом продукте. После растворения осадка к раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13-17%. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение концентрации этилового спирта ухудшает формирование осадка, а увеличение приводит к нежелательному повышению содержания иммуноглобулина G в готовом продукте. Полученный спиртовой осадок отделяют центрифугированием и разводят в 10-15 раз с использованием 0,05-0,07 М буферного раствора, предпочтительно ацетатного, с рН 3,8-3,9. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение молярности буферного раствора, уменьшение объема раствора и увеличение рН раствора ведет к неполному растворению осадка, а увеличение молярности и уменьшение рН раствора ведет к потере иммуноглобулина А. Превышение указанного объема раствора является технологически нецелесообразным. К полученному раствору добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,075-0,1 М. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение концентрации соли затрудняет формирование балластного осадка, а ее увеличение ведет к потере иммуноглобулина А. В раствор добавляют хлороформ до конечной концентрации 13-15%. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение концентрации хлороформа приводит к неполному удалению балластных липопротеидов, а ее увеличение является технологически нецелесообразным. Полученный осадок липопротеидов отделяют центрифугированием, проводя эту процедуру не менее двух раз, что обеспечивает полное удаление балластных белков. К полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия до установления рН 4,9-5,0 и спирт до конечной концентрации 4-6%. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку уменьшение концентрации спирта ухудшает формирование осадка, а ее увеличение ведет к потере целевого продукта. Указанные параметры являются оптимальными, поскольку снижение рН раствора затрудняет формирование осадка, а его повышение ведет к потере иммуноглобулинов А и М. Полученный балластный осадок отделяют центрифугированием. Полученный центрифугат фильтруют. Проводят выделение целевого осадка иммуноглобулинов согласно методике прототипа. Устанавливают рН полученного фильтрата равным 6,9-7,5 добавлением гидроокиси натрия. К полученному раствору добавляют спирт до конечной концентрации 20-30%, одновременно снижая температуру раствора до -8^oС-12^oС. Образующийся осадок целевого продукта иммуноглобулинов отделяют центрифугированием. Полученный осадок разводят в 2-3% растворе глицина, не содержащем хлорида натрия и глюкозы, устанавливают рН раствора 4,0-4,5 добавлением соляной кислоты, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Указанные значения рН раствора целевого продукта являются оптимальными, поскольку снижение рН ухудшает потребительские свойства продукта, а превышение указанного предела рН ухудшает растворимость продукта. Снижение указанной концентрации глицина ведет к ухудшению растворимости целевого продукта, а увеличение является технологически нецелесообразным. После проведения лиофилизации не отмечается признаков карамелизации готового продукта и нарушений его растворимости.

Пример 1. 1 кг Спиртового осадка Б плазмы крови человека разводят в 10 литрах 0,01 М раствора хлорида натрия. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 13%. Полученный спиртовой осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин на центрифуге с проточно-зональным ротором ОТР-101. Полученный спиртовой осадок разводят в 10 раз 0,05 М ацетатным буфером с рН 3,8. В раствор добавляют хлорид натрия до концентрации 0,075 М, и хлороформ до 13%. Полученный раствор центрифугируют дважды при 15000 об/мин. Балластный осадок отбрасывают. К полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия, устанавливая рН 4,9, и этиловый спирт до конечной концентрации 4%. Образовавшийся балластный осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный центрифугат фильтруют. Устанавливают рН фильтрата равным 6,9, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 20%, снижая температуру до -8^oС. Формирующийся осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный осадок разводят в 2% растворе глицина, устанавливают рН раствора 4,0. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации с использованием глубинных целлюлозных фильтров “Cuno-60” и “Cuno-90” и лиофилизации с использованием аппарата ТГС-15.

Содержание иммуноглобулинов классов А, определяемое методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, в полученном препарате составляет 22,5% в отличие от препарата, полученного по методике прототипа, – не более 15%. Содержание иммуноглобулинов класса М, определяемое аналогичным методом, составляет 26%, тогда как в препарате, полученном по методике прототипа, оно не превышало 15%. Специфическая активность (титр антител), определяемая методом пассивной гемагглютинации, в полученном препарате выше, чем в препарате, полученном по методике прототипа: к шигеллам – 1:640 вместо 1:320, к сальмонеллам 1:1280 вместо 1: 320. Содержание иммунологически неактивных фракций, определяемое методом электрофореза на мембранах из ацетатцеллюлозы, не отличается от прототипа и составляет 2,6%.

Пример 2. 1 кг Спиртового осадка Б плазмы крови человека разводят в 20 литрах 0,015 М раствора хлорида натрия. К полученному раствору добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 17%. Полученный спиртовой осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин на центрифуге с проточно-зональным ротором ОТР-101. Полученный спиртовой осадок разводят в 15 раз 0,07 М ацетатным буфером с рН 3,9. В раствор добавляют хлорид натрия до концентрации 0,1 М и хлороформ до 15%. Полученный раствор центрифугируют дважды при 15000 об/мин. Балластный осадок отбрасывают. К полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия, устанавливая рН 5,0, и этиловый спирт до конечной концентрации 6%. Образовавшийся балластный осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный центрифугат фильтруют. Устанавливают рН фильтрата равным 7,5, добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 30%, снижая температуру до -12^oС. Формирующийся осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин. Полученный осадок разводят в 3% растворе глицина, устанавливают рН раствора 4,5. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации с использованием глубинных целлюлозных фильтров “Cuno-60” и “Cuno-90” и лиофилизации с использованием аппарата ТГС-15.

Содержание иммуноглобулинов классов А, определяемое методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, в полученном препарате составляет 24% в отличие от препарата, полученного по методике прототипа, – не более 15%. Содержание иммуноглобулинов класса М, определяемое аналогичным методом, составляет 28%, тогда как в препарате, полученном по методике прототипа, оно не превышало 15%. Специфическая активность (титр антител), определяемая методом пассивной гемагглютинации, в полученном препарате выше, чем в препарате, полученном по методике прототипа: к шигеллам – 1:640 вместо 1:320, к сальмонеллам 1:1280 вместо 1: 320. Содержание иммунологически неактивных фракций, определяемое методом электрофореза на мембранах из ацетатцеллюлозы, не отличается от прототипа и составляет 1,8%.

Использование в качестве экстрагирующего 0,01-0,015 М раствора хлорида натрия и проведение спиртового осаждения иммуноглобулинов до экстракции липопротеидов хлороформом позволяет отделить иммуноглобулин G и за счет этого повысить содержание иммуноглобулинов А и М. Проведение двукратного центрифугирования позволяет повысить очистку целевого продукта. Включение дополнительной стадии спиртового осаждения балластных белков повышает степень очистки препарата. Использование в качестве растворителя осадка целевого продукта 2-3% раствора глицина с рН 4,0-4,5 позволяет повысить стабильность молекул иммуноглобулинов и тем самым предотвратить денатурацию препарата.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата из крови человека путем солевой экстракции спиртового осадка сыворотки крови человека, очистки его от липопротеидов с использованием хлороформа, выделения целевого продукта спиртовым осаждением при центрифугировании, разведения осадка иммуноглобулинов в растворе глицина, стерилизующей фильтрации и лиофилизации, отличающийся тем, что разведение спиртового осадка плазмы крови человека проводят с использованием раствора хлорида натрия с ионной силой 0,01-0,015, 10-20 объемов по отношению к весу осадка, выделяют осадок иммуноглобулинов добавлением этилового спирта до конечной концентрации 13-17% и центрифугированием, осадок разводят в 10-15 раз с использованием 0,05-0,07 М буферного раствора с рН 3,8-3,9, добавляют к полученному раствору хлорид натрия до конечной концентрации 0,075-0,1 М и хлороформ до 13-15%, отделяют полученный осадок липопротеидов центрифугированием, проводя эту процедуру не менее двух раз, к полученному центрифугату добавляют гидроокись натрия до рН 4,9-5,0 и этиловый спирт до конечной концентрации 4-6%, отделяют полученный балластный осадок центрифугированием, фильтруют центрифугат, осадок целевого продукта разводят в 2-3%-ном растворе глицина, не содержащем хлорид натрия и глюкозу, устанавливают рН раствора 4,0-4,5.

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 19-2004

(73) Новое наименование патентообладателя:

Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.07.2004

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.07.2007

Извещение опубликовано: 27.02.2009 БИ: 06/2009