Патент на изобретение №2197735
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ СЭНДВИЧ МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
(57) Реферат: Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз. Способ предусматривает сенсибилизацию твердой фазы моноклональными антителами клона 08,3, обладающих специфичностью к антигенной детерминанте полипептида молекулярной массы 36-40 кДа вируса оспы овец штамма “НИСХИ”. Детекция образовавшегося комплекса моноклональное антитело – антиген проводится пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных реконвалесцентов. Способ позволяет повысить специфичность и чувствительность метода, а также позволяет экспрессно обнаруживать антигены вирусов оспы овец и оспы коз и дифференцировать их от возбудителей болезней, протекающих с клинически схожей картиной. 1 табл. Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз путем выявления специфических антигенов сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) на основе моноклональных антител, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях. Реакция диффузионной преципитации обладает невысокой чувствительностью и продолжительна по времени. Применение реакции как прямой, так и непрямой иммунофлюоресценции с использованием гипериммунных сывороток дает высокое фоновое неспецифическое окрашивание. Наиболее оптимальным является ИФА с использованием моноспецифической сыворотки, предложенный Carn V. M. (1995 г.), который в отличие от ранее описанного Sharma S. et al. (1988 г.) позволил избавиться от неспецифического фонового окрашивания. Суть метода, предложенного Carn V.M., состоит в следующем. Полистирол, используемый в качестве твердой фазы, сенсибилизируют поликлональными антителами, полученными при иммунизации кролика очищенным вирусом. Следующим шагом является контакт исследуемого антигена с антителами подложки. После чего для формирования “сэндвича” вносят моноспецифическую сыворотку, полученную к рекомбинантному белку “слияния” каприпоксвирусов на морских свинках. Детекцию образовавшегося комплекса антитело – антиген – антитело проводят антивидовым (анти – морская свинка) конъюгатом. Целью настоящего изобретения является разработка способа диагностики оспы овец и оспы коз сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. Указанная цель достигается тем, что для сенсибилизации твердой фазы используются моноклональные антитела клона 08,3, обладающие специфичностью к антигенной детерминанте полипептида молекулярной массы 36-40 кДа вируса оспы овец штамм “НИСХИ”. Детекция образовавшегося комплекса моноклональное антитело – антиген проводится пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных – реконвалесцентов. Пример конкретного выполнения При постановке сэндвич метода ТФ ИФА использовали 96-луночные панели для микрокультивирования. Перец началом постановки метода готовили тест-панели. Для этого лунки панели сенсибилизировали моноклональными антителами в рабочем разведении на 0,01 М карбонатно-бикарбонатном рН 9,5 в течение 18 часов при 4oС. После чего содержимое лунок удаляли, лунки трехкратно промывали отмывочным буфером (ЗФР; 0,05% Твин 20) и блокировали свободные сайты сорбции полистирола путем инкубирования в лунках блокирующего буфера (ЗФР; 0,05% Твин 20, 1% БСА) в течение 30 мин при 37(  0,5)oС. Затем содержимое лунок удаляли, двукратно промывали отмывочным буфером и вносили в лунки вертикальных рядов по 0,2 см3 двукратных разведений контрольных (нормального и специфического) и исследуемых антигенов на блокирующем буфере. Через 1 ч инкубирования при 37(0,5)oС и последующей трехкратной отмывки отмывочным буфером в лунки пластины вносили по 0,2 см3 специфического конъюгата в рабочем разведении на блокирующем буфере. Содержимое лунок инкубировали в течение 1 ч при 37(0,5)oС. Лунки семикратно промывали отмывочным буфером, однократно ЗФР и вносили по 0,2 см3/лунку хромогенного субстратного раствора ABTS. После 30 мин инкубирования при комнатной температуре проводили учет и оценку результатов.
Учет и оценка результатов реакции проводится фотометрически.
При фотометрическом учете измеряют оптическую плотность хромогенного субстратного раствора при длине волны 405 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали контрольный специфический и исследуемые антигены, в 2 и более раз превышает оптическую плотность в лунках, в которых предварительно инкубировали контрольный нормальный антиген.
В работе по определению чувствительности и специфичности данного метода использовали гомологичные культуральные и органные антигены (подкожную клетчатку с мест оспенного поражения и хоаны инфицированных животных), гетерологичные антигены вирусов болезней мелких жвачных (катаральной лихорадки овец, чумы мелких жвачных, лихорадки долины Рифт, болезни Акабане) и родственные антигены вирусов бугорчатки КРС, контагиозного пустулезного дерматита, осповакцины, оспы кур, миксоматоза. Результаты по определению чувствительности и специфичности данного метода представлены в таблице.
Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый способ твердофозного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител позволяет проводить диагностику оспы овец и оспы коз и дифференцировать данное заболевание от других представителей семейства Poxviridae и гетерологичных возбудителей, вызывающих развитие инфекции с клинически сходной картиной.
Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с существующими методами. Он экспрессен, прост в использовании и может быть применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.
Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 20.06.2003
Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
