Патент на изобретение №2197239

(54) ГЕСПЕРИДИН И ГЕСПЕРЕТИН В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА АЦИЛ СОА-ХОЛЕСТЕРИН-О-АЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ, ИНГИБИТОРОВ НАКОПЛЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ МАКРОФАГ-ЛИПИД НА СТЕНКАХ АРТЕРИЙ, И В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ

(57) Реферат:

Предложен новый активный ингредиент фармацевтической композиции, пищевой композиции или напитка для профилактики или лечения липодистрофии печени или цирроза печени у млекопитающих, в том числе человека. В качестве такого ингредиента служат известные флавоноиды гесперидин или гесперетин. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.

Изобретение относится к применению гесперидина или гесперетина для ингибирования активности адил СоА-холестерин-о-ацилтрансферазы (АСАТ), ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелии артерий и для профилактики или лечения заболеваний печени у млекопитающих.

Предпосылки изобретения
В последние годы коронарные кардио-циркуляторные заболевания, например атеросклероз и гиперхолестеринемия, все чаще становятся основной причиной смертности. Сообщалось, что повышенные уровни содержания холестерина в плазме вызывают отложение жира, макрофагов и пенистых клеток на стенках кровеносных сосудов, и что такие отложения приводят к образованию бляшек, а затем к атеросклерозу (Ross, R., Nature, 362, 801-809 (1993)). Одним из способов снижения уровней холестерина в плазме является алиментотерапия для уменьшения поглощения холестерина и лилидов. Другим способом является ингибирование абсорбции холестерина путем ингибирования участвующих в этом ферментов.

Ацил СоА-холестерин-о-ацилтрансфераза (АСАТ) промотирует образование сложного эфира холестерина в крови. Пенистые клетки образуются в результате действия АСАТ и содержат большое количество сложного эфира холестерина, который переносят липопротеины низкой плотности (ЛНП). Образование пенистых клеток на стенках артерий растет с повышением АСАТ активности, и соответственно ингибитор АСАТ может также служить средством для профилактики атеросклероза. Далее, сообщалось, что уровень содержания в крови ЛПН-холестерина можно понизить, ингибируя АСАТ активность (Witiak, D.T. and D.R. Feller (eds. ), Anti-Lipidemic Drugs; Medicinal, Chemical and Biochemical Aspects, Elsevier, pp 159-195 (1991)).

С другой стороны, ухудшение функций печени может происходить из-за избыточного поглощения алкоголя или пищи с высоким содержанием липидов, или в результате инфицирования вирусами гепатитов В или С, и это может развиться в гепатиты, привести к циррозу печени или к раку печени. В частности, избыточное потребление пищи с высоким содержанием жиров и спиртных напитков вызывает ожирение печени, когда большое количество липидов отлагается в тканях печени, и повышаются уровни сыворотчной GOT (глутамат-оксалоацетат трансаминазы), GPT (глутамат-пируват трансаминазы) и -GTP (-глутамил транспептидазы) (T. Banciu et al., Med. Interne., 20, 69-71 (1982); и A.Par et al., Acta. Med. Acad. Sci. Hung., 33, 309-319 (1976)).

Были предприняты многочисленные попытки разработать лекарства, которые ингибировали бы АСАТ активность; и в результате появились сообщения о выделении нескольких соединений из культур различных микроорганизмов. Примеры таких соединений включают пирипирофены, выделенные из культуры Aspergillus fumigatus (S. Omura et al., J. Antibiotics, 46, 1168-1169 (1993)) и акатерин, выделенный из Pseudomonas sp. (S. Nagamura et al., J. Antibiotics. 45, 1216-1221 (1992)).

Далее, в качестве средства для лечения гиперхолестеринемии был разработан ингибитор HMG-CoA редуктазы, названный ловастатином (Lovastatin^{), который поставляется на рынок Merck Co., U.S.A. Однако известно, что это лекарство вызывает вредный побочный эффект – повышает содержание креатин-киназы в печени.}

Соответственно продолжает существовать необходимость в создании нетоксичных ингибиторов АСАТ и ингибиторов накопления комплексов макрофаг-липид на эпителии артерий, и средств для профилактики или лечения заболеваний печени.

Авторы настоящего изобретения предприняли попытки разработать новый и эффективный ингибитор АСАТ, ингибитор накопления комплексов макрофаг-липид и средство для профилактики и лечения заболеваний печени из природных материалов, и в результате обнаружили, что гесперидин или гесперетин обладают потенциальной ингибирующей АСАТ активностью, ингибирующей накопление комплексов макрофаг-липид активностью и активностью в отношении профилактики или лечения заболеваний печени.

Гесперидин (C₂₈H₃₄O₁₅, M.B.: 610,55) и агликон гесперидина, гесперетин (C₁₆H₁₄O₆, M. B. : 302,27), являются флавоноидами, находящимися в лимонах, грейпфрутах, мандаринах, нитронах и апельсинах (Citrus sinensis)(Horowitz, Gentili, Tetrahedron, 19, 773 (1943)).

Сообщалось, что гесперидин или гесперетин обладают усиливающей капилляры, снижающей проницаемость, препятствующей агрегации тромбоцитов, противовоспалительной, противовирусной, снижающей кровяное давление и снижающей содержание холестерина активностями (Меуеr, О.С., Angiology, 45, 579-584 (1994); Struckmann, J.R., et al., Angiol, 45, 419-428 (1994); Matsubara, Y., et al. , Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal, 52, 318-327 (1994. Mar. ); Galati, E.M., et al., Farmaco., 51(3), 219-221 (1996, Mar.); Monforte, M. Т., et al., Farmaco., 50(9), 595-599 (1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Chung, M. I., et al., Chin. Pharm. J. (Taipei)., 46, 429-437 (1994, Nov.); Galati, E. M., et al., Farmaco., 40(11), 709-712 (1994, Nov.); and Emim, J.A., et al., J. Pharm. Pharmacol., 46.(2). 118-122 (1994)).

Кроме того, гесперидин применяли для профилактики и лечения церебральной анемии, ретинального (сетчаточного) кровоизлияния и пелиомы.

Однако до сих пор не сообщалось ни о АСАТ ингибирующей активности, ни о ингибирующей активности в отношении накопления комплексов макрофаг-липид, ни о профилактической или терапевтической активности в отношении болезней печени гесперидина или гесперетина.

Краткое содержание изобретения
Соответственно целью настоящего изобретения является новое применение гесперидина или гесперетина для ингибирования АСАТ активности у млекопитающих.

Другой целью настоящего изобретения является новое применение гесперидина или гесперетина для ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелиальных стенках артерий у млекопитающих.

Следующей целью настоящего изобретения является новое применение гесперидина или гесперетина для профилактики или лечения заболеваний печени у млекопитающих.

Краткое описание чертежей
Вышеуказанные и другие цели и особенности настоящего изобретения станут яснее из следующего описания изобретения вместе с прилагаемыми чертежами, в которых:
на фиг. 1А, 1В и 1С представлены артерии кроликов, которым вводили 1% холестерина; 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatin ^{и 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина соответственно;
на фиг. 2А, 2В и 2С представлены микроскопические особенности печеней кроликов, которым вводили 1% холестерина; 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatin и 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина соответственно.}

Подробное описание изобретения
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложено применение гесперидина или гесперетина для ингибирования активности ацил СоА-холестерин-о-ацилтрансферазы (АСАТ) у млекопитающих.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение гесперидина или гесперетина для ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелиальных стенках артерий у млекопитающих.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предложено применение гесперидина или гесперетина для профилактики или лечения заболеваний печени у млекопитающих.

Гесперидин или гесперетин можно экстрагировать из кожуры цитрусовых или синтезировать по способу, раскрытому Zemplen, Bognar, Ber., 75, 1043 (1943) и Seka, Prosche, Monatsh., 69, 284 (1936). Далее, гесперетин можно получить в результате гидролиза гесперидина.

Гесперидин или гесперетин демонстрируют ингибирующее действие на АСАТ активность и накопление комплексов макрофаг-липид на эндотелиальных стенках артерий, а также профилактическое или терапевтическое действие в отношении заболеваний печени в дозах 0,1 мг/кг/день или более, причем ингибирующее действие усиливается с увеличением дозы.

Более того, несмотря на высокую эффективность гесперидина или гесперетина, они демонстрируют низкую токсичность или митогенность в тестах на мышах. Более конкретно, гесперидин или гесперетин вообще не токсичны при пероральном введении мышам в дозе 100 мг/кг, что соответствует дозе при пероральном введении от 3 до 10 г/кг веса тела гесперидина или гесперетина для пациентов весом 50 кг. Кроме того, гесперидин и гесперетин не оказывают вредного действия на функции печени.

В настоящем изобретении предложена также фармацевтическая композиция для ингибирования АСАТ активности и ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелиальных стенках артерий, и для профилактики или лечения заболеваний печени, которая включает гесперидин или гесперетин в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемые эксципиенты, носители или разбавители.

Фармацевтическую композицию можно приготовить в соответствии с любой из обычных процедур. При приготовлении композиции активный ингредиент предпочтительно смешивают с носителем или разбавляют носителем, или заключают в носитель, который может быть в форме капсулы, облатки или в виде какого-либо другого контейнера. Если носитель служит разбавителем, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, и функционирует как носитель, эксципиент или среда для активного ингредиента. Так, композиция может быть в форме таблеток, пилюль, порошков, облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей, мягких и твердых желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекций, порошков в стерильной упаковке и т.п.

Примерами подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмалы, смола акации, альгинаты, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Композиции могут дополнительно включать наполнители, анти-агглютинизационные агенты, смазывающие агенты, смачивающие агенты, ароматизаторы, эмульгаторы, консерванты и т.п. Композиции настоящего изобретения можно приготовить так, чтобы обеспечить быстрое, замедленное или с задержкой выделение активного ингредиента после их введения млекопитающим, с использованием любого известного специалистам способа.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить различными способами, включая пероральное, чрезкожное, подкожное, внутривенное и внутримышечное введение. Для людей типичная дневная доза гесперидина или гесперетина может быть в интервале от около 0,1 до 100 мг/кг веса тела, предпочтительно от 3 до 10 мг/кг веса тела, и ее можно вводить в виде единичной дозы или в виде разделенных доз.

Однако следует понимать, что количество активного ингредиента, которое вводят реально, следует определять с учетом различных относящихся к делу факторов, включая подлежащее лечению состояние, выбранный способ введения, возраст, пол и вес пациента, и тяжесть симптомов; и поэтому вышеуказанные дозы никоим образом не должны ограничивать объем изобретения.

Более того, гесперидин или гесперетин можно включать в продукты или напитки в качестве дополнений или диетических добавок для ингибирования АСАТ активности, ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелиальных стенках артерий и/или для профилактики или лечения заболеваний печени. Продукты питания или напитки могут включать различные сорта мяса; соки, такие как овощные соки (например, морковный сок и томатный сок) и фруктовые соки (например, апельсиновый сок, виноградный сок, ананасовый сок, яблочный сок и банановый сок); шоколады; закуски; конфеты; пиццу; продукты, приготовленные из муки злаковых, такие как хлеб, кексы, крекеры, печенье, бисквиты, лапша и т.д.; жевательные резинки; молочные продукты, такие как молоко, сыры, йогурт и мороженое; супы; бульоны; пасты; кетчупы и соусы; чаи; алкогольные напитки; газированные напитки, такие как Кока-Кола и Пепси-Кола; комплексы витаминов и различную здоровую пищу.

В этом случае содержание гесперидина или гесперетина в продуктах питания или напитках может быть в интервале от 0,01 до 5 вес.%. В частности, напиток в соответствии с настоящим изобретением может содержать от 200 до 10000 мг гесперидина или гесперетина на 1000 мл напитка.

Как было указано выше, гесперидин или гесперетин можно использовать в качестве эффективного нетоксичного фармацевтического средства для ингибирования АСАТ активности, ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелии артерий и/или для профилактики или лечения заболеваний печени.

Приводимые далее примеры предназначены для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения без ограничения его объема.

Далее, приводимые ниже проценты для смесей твердое в твердом, жидкое в жидком и твердое в жидком даны в расчете на вес/вес, объем/объем и вес/объем соответственно; а все реакции проводят при комнатной температуре, если нет других специальных указаний.

Пример 1: Экстрагирование гесперидина из кожуры цитрусовых
Кожуру мандаринов (Cheju Island, Korea), цитронов (Jeollanamdo, Korea) и апельсинов, грейпфрутов и лимонов (California, CA, U.S.А.) сушат при комнатной температуре и измельчают в порошок с размером частиц от 100 до 200 мкм. 50 мл метанола добавляют к 500 мг каждого из порошков кожуры цитрусовых и экстрагируют в водяной бане при 50^oС в течение 6 часов. Полученный таким образом экстракт охлаждают и фильтруют, а затем метанол добавляют к фильтрату до объема 50 мл.

Для определения содержания гесперидина в полученных экстрактах 5,0 мкл полученного экстракта обрабатывают с помощью высокоэфффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя колонку Lichrosorb RP-8 (5 мкм, 4250 мм), которую предварительно уравновешивают 37% метанолом и поддерживают при температуре 30^oС. Экстракт элюируют 37% метанолом при скорости потока 1,0 мл/мин. Стандартные растворы приготавливают, растворяя гесперидин (Sigma Chemical Co., U.S.A.) в метаноле до конечных концентраций 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мг/мл и обрабатывая с помощью ВЭЖХ в таких же условиях, что указаны выше. Элюаты детектируют при 280 нм с помощью спектрофотометра, работающего в УФ-видимом диапазоне, и содержание гесперидина рассчитывают, сравнивая площади под кривыми ВЭЖХ экстрактов кожуры цитрусовых и стандартного раствора. Содержание (%) гесперидина в различных экстрактах кожуры цитрусовых представлено в таблице I.

Пример 2: Токсичность при пероральном введении гесперидина или гесперетина
7-8-недельных специфических без патогенов ICR самок мышей (6 штук), каждая весом от около 25 до 29 г, и самцов мышей (6 штук), каждый весом от около 34 до 38 г, выращивают в условиях 221^oС, влажность 555% и фотопериод 12 час свет/12 час темнота. Корм (Cheiljedang Co., корм для мышей и крыс) и воду стерилизуют и дают мышам.

Гесперидин и гесперетин растворяют в 0,5% Твин 80 до концентрации 100 мг/мл и этот раствор вводят перорально мышам в количестве 0,2 мл на 20 г веса тел мышей. Раствор вводят один раз и за мышами ведут наблюдение в течение 10 дней в отношении признаков вредного действия или гибели в соответствии со следующей схемой: через 1, 4, 8 и 12 часов после введения и каждые 12 часов после этого. Изменения веса мышей регистрируют каждый день для определения влияния гесперидина или гесперетина. Далее, на 10 день мышей умерщвляют и визуально исследуют внутренние органы.

Через 10 дней все мыши были живы, и гесперидин или гесперетин не продемонстрировали никакой токсичности в дозе 1000 мг/кг. Аутопсия показала, что у мышей не развилось каких-либо патологических отклонений, и за 10 дней тестового периода не наблюдалось потерь веса. Соответственно было сделано заключение, что гесперидин или гесперетин не токсичны при пероральном введении животным.

Пример 3: Введение гесперидина или гесперетина животным. 30 четырехнедельных крыс штамма Sprague-Dawley (Taihan laboratory animal center, Korea), каждая весом от 90 до 110 г, равномерно произвольно разделяют на три диетические группы. Крысам в этих трех группах дают три различных корма с высоким содержанием холестерина, то есть AIN-76 лабораторный корм для животных (ICN, Biochemicals, Cleveland, ОН, U. S. A. ), содержащий 1% холестерина (контрольная группа) и 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина или гесперетина соответственно. Состав кормов, которые давали этим трем группам, представлен в таблице II.

Крысы питались по желанию специальным кормом вместе с водой в течение 6 недель, поглощенное количество регистрировалось ежедневно и крыс взвешивали каждые 7 дней, а затем анализировали результаты. Все крысы продемонстрировали нормальную скорость роста, и никаких заметных различий между тремя группами с точки зрения потребляемого корма и привеса не наблюдалось.

Пример 4: Определение содержания полного холестерина, ЛВП-холестерина и нейтральных липидов в плазме.

Влияние введения крысам гесперидина или гесперетина на содержание в плазме холестерина и нейтральных липидов определяют следующим образом:
Образцы крови отбирают у крыс трех различных диетических групп и выделяют из них фракции плазменных ЛВП, используя ЛВП-холестериновый реагент (Sigma Chemical Co., Cat. 352-3), содержащий декстран-сульфат. Уровни содержания полного холестерина и ВПЛ-холестерина определяют, используя Sigma Diagnostic Kit Cat. 352-100 (Sigma Chemical Co., U.S.A.) (Allain et al., Clin. Chem. , 20, 470-475 (1974)). Уровень содержания нейтральных липидов определяют, используя Sigma Diagnostic Kit Cat. 339-50 (Bucolo, G. And David, H., Clin. Chem., 19, 476-482 (1973)). Полученные результаты представлены в таблице III, где уровни полного плазменного холестерина в группах крыс, в корме которых был гесперидин или гесперетин, снижены на 11% и 15% соответственно по сравнению с контрольной группой.

Пример 5: Активность гесперидина и гесперетина в отношении ингибирования АСАТ
(Стадия 1) Получение микросом
Для определения действия на крыс корма с гесперидином или гесперетином на активность АСАТ микросомы выделяют из тканей печени, чтобы использовать в качестве источника ферментов.

Вначале крыс трех групп, полученных в примере 3, умерщвляют декапитацией и вырезают печени. По 1 г из каждой печени гомогенизируют в 5 мл гомогенизационной среды (0,1 М КН₂РO₄, рН 7,4, 0,1 мМ EDTA и 10 мМ -меркаптоэтанола). Гомогенат центрифугируют при 3000 g в течение 10 минут при 4^oС и полученную надосадочную жидкость центрифугируют при 15000 g в течение 15 минут при 4^oС для получения надосадочной жидкости. Эту надосадочную жидкость помещают в ультрацентрифужную пробирку (Beckman) и центрифугируют при 100000 g в течение 1 часа при 4^oС, получая осадок микросом, который затем суспендируют в 3 мл гомогенизационной среды, и центрифугируют при 100000 g в течение 1 часа при 4^oС. Полученный таким образом осадок суспендируют в 1 мл гомогенизационной среды. Концентрацию протеинов в полученной суспензии определяют методом Лоури, а затем доводят до величины от 4 до 8 мг/мл. Полученную суспензию хранят при очень низкой температуре (Biofreezer, Forma Scientific Inc.).

(Стадия 2) АСАТ анализ
6,67 мкл 1 мг/мл раствора холестерина в ацетоне смешивают с 6 мкл 10% Triton WR-1339 (Sigma Co.,) в ацетоне, и затем ацетон удаляют из смеси выпариванием, используя газообразный азот. К полученной смеси добавляют дистиллированную воду в таком количестве, чтобы довести концентрацию холестерина до 30 мг/мл.

К 10 мкл полученного водного раствора холестерина добавляют 10 мкл 1 М KH₂PO₄ (pH 7,4), 5 мкл 0,6 мМ альбумина бычьей сыворотки (BSA), 10 мкл раствора микросом, полученного на стадии 1, и 55 мкл дистиллированной воды (всего 90 мкл). Две смеси предварительно инкубируют в водяной бане при 37^oС в течение 30 минут.

10 мкл раствора (1-¹⁴C) олеоил-СоА (0,05 мк Кюри, конечная концентрация: 10 мкМ) добавляют к предварительно инкубированной смеси и полученную смесь инкубируют в водяной бане при 37^oС в течение 30 минут. К этой смеси добавляют 500 мкл смеси изопропанол:гептан (4:1 (об/об)), 300 мкл гептана и 200 мкл 0,1 М КН₂РО₄ (pH 7,4) и полученную смесь интенсивно перемешивают, используя центрифугу, а затем оставляют отстаиваться при комнатной температуре в течение 2 минут.

200 мкл полученной надосадочной жидкости помещают в сцинтилляционную ампулу и к этому добавляют 4 мл сцинтилляционной жидкости (Lumac). Полученную смесь анализируют на радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика 1450 Microbeta (Wallacoy, Finland). ACAT активность рассчитывают как пикомоли холестеринолеата, синтезируемые в минуту на мг протеина (пмоль/мин/мг протеина). Полученные результаты представлены в таблице IV.

Как видно из данных таблицы IV, ACAT активности, наблюдаемые для групп крыс, в корм которых был добавлен гесперидин или гесперетин, ниже, нежели для контрольной группы на 19,2% и 23,5% соответственно.

Пример 6: Ингибирование образования бляшек, вызываемое комплексами макрофаг-липид, у животных, в корм которым добавлен гесперидин или гесперетин
(Стадия 1) Введение животным гесперидина или гесперетина
24 трехмесячных Новозеландских белых кролика (Yeonam Horticulture and Animal Husbandry College, Korea), каждый весом от около 2,5 до 2,6 кг, выращивают в условиях 202^oС и относительной влажности 555%, и фотопериоде 12 час свет/12 час темнота. Кроликов делят на группы по 6 кроликов и кроликов четырех групп кормят четырьмя различными по составу кормами, т.е. RC4 корм (Oriental Yeast Co., Japan), содержащий 1% холестерина (контрольная группа); 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatine ^{(Merck, U.S.A.) (сравнительная группа); 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина; и 1% холестерина плюс 0,1% гесперетина соответственно. Корм RC4 содержит 7,6% влаги, 22,8% сырого белка, 2,8% сырого жира, 8,8% неочищенной золы, 14,4% сырой целлюлозы и 43,6% растворимых веществ, не содержащих азота. Кроликов кормят таким образом в течение 6 недель при свободном доступе к корму и воде.}

(Стадия 2) Анализ полосок жира в главной артерии
Кроликов, которых кормили по схеме стадии 1, умерщвляют и вырезают грудную глетку. Из нее вырезают главную артерию примерно на 5 см в прямом направлении от точки, расположенной на 1 см над клапаном аорты, и жир, окружающий главную артерию, удаляют. Главную артерию разрезают посередине вдоль длинной оси и помещают в чашку. Влажную артерию фотографируют, а затем производят окрашивание полосок жира по способу Esper, E., et al., (J. Lab. Clin. Med., 121, 103-110 (1993)) следующим образом.

Часть иссеченной главной артерии трижды промывают по 2 мин безводным пропиленгликолем и окрашивают в течение 30 мин насыщенным раствором Oil Red О (ORO, Sigma Co.) в пропиленгликоле. После этого артерию дважды промывают по 3 мин 85% пропиленгликолем для удаления остатков красящего раствора, а затем промывают физиологическим раствором. Артерию фотографируют и фотографию исследуют. Площадь окрашенного участка (участок с полосками жира) определяют с помощью анализатора изображений (LEICA, Q-600), Germany) и рассчитывают его долю (%) от полной площади артерии.

С другой стороны, другую часть главной артерии окрашивают в соответствии со способом гематоксилин-эозин (Н& Е) и способом трехцветного окрашивания Masson и наблюдают под микроскопом для подтверждения того факта, что комплексы макрофаг-липид накапливаются во внутренней оболочке, Internus, эластичной мембране и среде.

Далее у кроликов отбирают образцы крови и определяют уровни содержания полного холестерина и триглицеридов по способу примера 4. Полученные результаты представлены в таблице V.

Как видно из результатов таблицы V, площадь накопления комплексов макрофаг-липид на эндотелии артерий значительно снижается для групп с 1 мг/кг Lovastatin ^{и групп с 0,1% гесперидина и 0,1% гесперетина по сравнению с контрольной группой. Соответственно было подтверждено, что гесперидин и гесперетин ингибируют накопление комплексов макрофаг-липид на эндотелии артерий. В частности, примечательно, что активность гесперидина или гесперетина в отношении ингибирования накопления комплексов макрофаг-липид проявляется при уровнях холестерина в крови более 1100 мг/дл, что гораздо выше, нежели у здоровых кроликов, т.е. около 50 мг/дл. Этот результат позволяет предположить возможность нового механизма профилактики наступления атеросклероза, который отличается от блокирования синтеза холестерина за счет ингибитора HMG-CoA редуктазы, блокирования абсорбции холестерина за счет АСАТ ингибитора, или блокирования переноса холестерина за счет СЕТР ингибитора.}

На фиг.1А, 1В и 1С представлены артерии кроликов, которым вводили 1% холестерина (контрольная группа); 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatin ^{(сравнительная группа); 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина соответственно. Как видно на фиг.1А, 1В и 1С, наблюдается толстый слой комплекса макрофаг-липид на эндотелии артерий кроликов, которым вводили 1% холестерина, тогда как очень тонкие слои или вовсе отсутствие комплексов макрофаг-липид наблюдаются на эндотелии артерий кроликов, которым вводили 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatin и 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина соответственно.}

Соответственно был сделан вывод, что гесперидин или гесперетин сильно ингибируют накопление комплексов макрофаг-липид на эндотелии артерий.

Пример 7: Профилактика болезней печени с помощью гесперидина
(Стадия 1) Введение крысам гесперидина
20 четырехнедельных крыс штамма Sprague-Dawley (Taihan laboratory animal center, Korea), каждая весом от 90 до 110 г, равномерно произвольно разделяют на две диетические группы. Крысам в этих двух группах дают два различных корма с высоким содержанием холестерина, то есть AIN-76 лабораторный корм для животных (ICN, Biochemicals, Cleveland, ОН, U.S.A.), содержащий 1% холестерина (контрольная группа) и 1% холестерина плюс 0,04% гесперидина соответственно. Состав кормов, которые давали этим двум группам, представлен в таблице VI.

Крысы питались по желанию специальным кормом вместе с водой в течение 6 недель, поглощенное количество регистрировалось ежедневно и крыс взвешивали каждые 7 дней, а затем анализировали результаты. Все крысы продемонстрировали нормальную скорость роста, и никаких заметных различий между двумя группами с точки зрения потребляемого количества корма и привеса не наблюдалось.

(Стадия 2) Определения уровней содержания GOT и GPT в сыворотке
Влияние введения крысам гесперидина на функции печени исследуют следующим образом.

Образцы крови отбирают у крыс двух диетических групп и определяют уровни содержания в сыворотке GOT (глутамат-оксалоацетат трансаминаза) и GPT (глутамат-пируват трансаминаза) по способу Reitman и Frankel (Reitman, S and J.S.Frankel, Am. J. Clin. Pathol., 28, 56 (1956)). GOT и GPT синтезируются в печени и сердце и выделяются в поток крови при повреждении этих органов. Соответственно GOT и GPT являются представительными маркерами функций печени, и высокие уровни содержания GOT и GPT в сыворотке свидетельствуют о серьезном поражении печени.

Полученные результаты показывают, что GOT и GPT уровни для группы гесперидина были ниже уровней для контрольной группы примерно на 30% и 10% соответственно.

(Стадия 3) Эксперимент на кроликах
Повторяют процедуру стадии 1, за исключением того, что вместо крыс используют 30 трехмесячных Новозеландских белых кроликов (Yeonam Horticulture and Animal Husbandry College, Korea), каждый весом от около 2,5 до 2,6 кг, и кроликов кормят в течение шести недель тремя различными по составу кормами, т. е. RC4 корм, содержащий 1% холестерина (контрольная группа); 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatin ^{(сравнительная группа) и 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина соответственно.}

После этого у кроликов извлекают печень и проводят гистопатологические наблюдения следующим образом.

Кроликов анестезируют внутримышечной инъекцией кетамина (75 мг/кг) и разрезают брюшную полость. Цвет и степень склерозирования печени определяют на глаз и печень, удаленную из кролика, фиксируют в 10% нейтрально буферированном формалине более чем на 24 часа. Отфиксированную печень промывают достаточным количеством воды, поэтапно обезвоживают 70%, 80%, 90% и 100% этанолом, а затем заключают в парафин. Заключенную в парафин печень нарезают на слои толщиной 4 мкм с помощью микротома и окрашивают гематоксицилином и эозином. Окрашенные образцы печени делают прозрачными ксилолом, помещают в фокус и наблюдают под микроскопом для подтверждения присутствия поражений.

На фиг. 2А, 2В и 2С представлены микроскопические особенности печеней кроликов, которым вводили 1% холестерина (контрольная группа); 1% холестерина плюс 1 мг/кг Lovastatin ^{(сравнительная группа) и 1% холестерина плюс 0,1% гесперидина соответственно. Как видно на фиг.2А и 2В, клетки печени контрольной группы и сравнительной группы нерегулярны и увеличены, и на них отложилось большое количество жира. Напротив, как видно на фиг.2С, клетки печени гесперидиновой группы остались нормальными, и на них не наблюдается отложения жира. Этот результат показывает, что гесперидин сильно ингибирует ожирение печени без каких-либо вредных воздействий на клетки печени.}

(Стадия 4) Эксперимент на человеке
Гесперидин перорально вводят 55-летнему человеку в дневной дозе 10 мг/кг в течение 68 дней и определяют уровни в сыворотке GOT и GPT и GTP непосредственно перед введением (день 0) и через 45 и 68 дней после введения (дни 45 и 68) соответственно. Уровни GOT в сыворотке на 45 день и 68 день снизились на 17% соответственно по сравнению с днем 0. Уровни GPT в сыворотке на 45 и 68 день снизились на 15% и 19% соответственно по сравнению с днем 0. Далее, уровни GTP в сыворотке на 45 день и 68 день снизились на 25% и 51% соответственно по сравнению с днем 0. Неожиданно снижение уровня GTP в сыворотке на день 68 оказалось более чем на 50%, и этот результат позволяет предположить, что гесперидин или гесперетин обладает высокой защищающей печень активностью, а также профилактической активностью в отношении заболеваний печени, таких как гепатиты, ожирение печени и алкогольное ожирение печени.

В другом случае, гесперидин перорально вводили 56-летнему мужчине, который постоянно употреблял алкогольные напитки в количестве 100 см³ в день, в дневной дозе 6 мг/кг в течение 30 дней, и уровень GTP в сыворотке определяли непосредственно перед введением (день 0) и через 30 дней после введения (день 30). Соответственно начальный уровень GTP в сыворотке в день 0 был 129 междунар. ед/л, тогда как на 30 день он снизился до 69 междунар. ед./л, что соответствует нормальному значению. Этот результат показывает, что гесперидин или гесперетин обладают высокой активностью в отношении профилактики алкогольного ожирения печени и гепатоцирроза.

Пример 8: Продукты, содержащие гесперидин или гесперетин
Продукты, содержащие гесперидин или гесперетин, приготавливают следующим образом:
(1) Приготовление томатного кетчупа и соуса
Гесперидин или гесперетин добавляют к томатному кетчупу или соусу в количестве в интервале от 0,01 до 5 вес.% для получения улучшающего здоровье томатного кетчупа или соуса.

(2) Приготовление продуктов из пшеничной муки
Гесперидин или гесперетин добавляют к пшеничной муке в количестве в интервале от 0,01 до 5 вес.% и приготавливают хлеб, кексы, печенье, крекеры и лапшу, используя эту смесь, для получения улучшающих здоровье продуктов.

(3) Приготовление супов и подливок
Гесперидин или гесперетин добавляют к супам и подливкам в количестве в интервале от 0,01 до 5 вес. % для получения улучшающих здоровье супов и подливок.

(4) Приготовление говяжьего фарша
Гесперидин или гесперетин добавляют к говяжьему фаршу в количестве в интервале от 0,01 до 5 вес.% для получения улучшающего здоровье говяжьего фарша.

(5) Приготовление молочных продуктов
Гесперидин или гесперетин добавляют к молоку в количестве в интервале от 0,01 до 5 вес. % и из этого молока приготавливают различные молочные продукты, такие как масло и мороженое.

Однако при приготовлении сыров гесперидин или гесперетин добавляют к коагулированному молочному белку; а в случае приготовления йогурта гесперидин или гесперетин добавляют к коагулированному молочному белку после ферментации.

Пример 9: Напитки, содержащие гесперидин или гесперетин
(1) Приготовление овощного сока
От 200 до 10000 мг гесперидина или гесперетина добавляют к 1000 мл томатного или морковного сока для получения улучшающих здоровье овощных соков.

(2) Приготовление фруктового сока
От 200 до 10000 мг гесперидина или гесперетина добавляют к 1000 мл яблочного или виноградного сока для получения улучшающих здоровье фруктовых соков.

(3) Приготовление газированных напитков
От 200 до 10000 мг гесперидина или гесперетина добавляют к 1000 мл Кока-Колы или Пепси-Колы для получения улучшающих здоровье газированных напитков.

Хотя настоящее изобретение было описано в отношении вышеуказанных конкретных воплощений, следует понимать, что специалисты могут осуществить различные модификации и изменения изобретения, которые попадают в объем изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Формула изобретения

1. Применение гесперидина или гесперетина в качестве активного ингредиента композиции для профилактики или лечения липодистрофии печени или цирроза печени у млекопитающих.

2. Применение по п. 1, где млекопитающим является человек.

3. Применение по п. 1, где указанную композицию выбирают из группы, состоящей из фармацевтической композиции, пищевой композиции и напитка.

4. Применение по п. 3, где эффективное количество гесперидина или гесперетина, содержащееся в фармацевтической композиции, находится в интервале от 0,1 до 100 мг/кг веса тела/день.

5. Применение по п. 3, где содержание гесперидина или гесперетина в пищевой композиции составляет 0,01 – 5 вес. %.

6. Применение по п. 3, где пищей является мясо, шоколады, закуски, конфеты, пицца, продукты, приготовленные из муки хлебных злаков, жвачки, молочные продукты, супы, бульоны, пасты, кетчупы, соусы, витаминные комплексы или продукты для здоровья.

7. Применение по п. 6, где продуктами, приготовленными из муки хлебных злаков, являются хлеба, кексы, крекеры, печенье, бисквиты или лапша.

8. Применение по п. 3, где композиции напитков представляют молочные продукты, овощные соки, фруктовые соки, чаи, спиртные напитки или газированные напитки.

9. Применение по п. 3, где содержание гесперидина или гесперетина в композициях напитков находится в интервале от 200 до 10000 мг на 1000 мл напитка.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.10.2004

Извещение опубликовано: 20.04.2006 БИ: 11/2006