Патент на изобретение №2196820
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ТЕСТИКУЛ (СЕМЕННИКОВ), МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК, СПЕРМАТОГОНИЙ, СПЕРМАТОЦИТОВ И СПЕРМАТОЗОИДОВ
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии. Способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов включает их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляют в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для размножения зародышевых клеток, внедрения (вшивания) генетического вектора нужной направленности и получения сперматозоидов с дополнительной генетической информацией для последующего получения трансгенных животных. Известен способ получения мышиных сперматогоний в течение четырех месяцев в культуре клеток in vitro, с последующим продолжением сперматогенеза после трансплантации этих клеток в семенные канальцы реципиента (Nagano M., Avarbock MR, Leonida ЕВ, Brinster C.J., Brinster RL, “Culture of mouse spermatogonial cells”. 1: Tissue Cell 1998 Aug, 30 (4): 389-97). Однако указанный способ не обеспечивает однотипность сперматогоний и сформировавшихся сперматозоидов, поскольку они смешиваются со сперматозоидами реципиента, требует предварительного подавления иммунологической реактивности организма реципиента для профилактики отторжения донорских клеток, а также указанный способ не позволяет получать в промышленных масштабах указанные клетки. Целью заявляемого изобретения является накопление пула зародышевых клеток, внедрения генетического вектора нужной направленности в процессе их размножения и получения сперматозоидов с дополнительной генетической информацией для последующего получения трансгенных животных. Указанная цель достигается тем, что размножение клеток осуществляют в биреакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота (КРС), энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ осуществляют следующим образом. Пример 1. Берут семенники у эмбрионов и/или у молодых, и/или половозрелых особей с соблюдением асептики. Ткани семенников и придатков измельчают и диспергируют в солевом буферном растворе без кальция и магния и помещают в культуральные флаконы или биореакторы с культуральной средой следующего состава (в об%): фетальная сыворотка КРС – 5,0; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) – 0,015; фактор роста (ИФР-1) – 0,015; соматомедин – А 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) – 0,001; аденазинтрифосфат (АТФ) – 0,015; соматомедин В – 0,001; соматомедин С – 0,001; глюкоза – 0,1; 20% – водно-спиртовой экстракт тканей семенников, взятых в период наступления половой зрелости – 3,0 и среда 199 – остальное до 100. Культивируют смесь тестикулярных клеток эмбрионов, молодых и половозрелых особей и параллельно ведут раздельное культивирование клеток тестикул этих особей. Культивирование проводят при температуре 34  38oС; рН 7,07,4 ед.; рО2 3050% насыщения и еН 180-220 мВ. Продолжительность первого этапа культивирования зависит от начала появления сперматогоний в популяции клеток. Обычно на это уходит 72-96 часов. Деление мужских зародышевых клеток может происходить как в полисистеме (смесь тестикулярных клеток эмбрионов, молодых и половозрелых особей), так и в моносистеме (раздельное культивирование клеток тестикул этих особей).
Пример 2. На втором этапе культивирование осуществляют в обогащенной питательной среде следующего состава (в об%): среда Игла – 40,0; фетальная сыворотка КРС – 10,0; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) – 0,03; фактор роста (ИФР-2) – 0,03; инсулин 40 м. ед. на 1 л среды, глюкоза 0,15; лактоза 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) – 0,02; аденозиндифосфат (АДФ) – 0,02 и среда 199 – остальное до 100. Обеспечивают поверхность субстрата для опорозависимых клеток путем добавления макро- и/или микроносителей. Культивирование проводят при температуре 3438oС; рН 7,07,4 ед. ; рО2 3050% насыщения и еН 140180 мВ. В процессе культивирования проводят микроскопический контроль состава клеточной популяции. Продолжительность второго этапа культивирования зависит от степени репродукции и накопления сперматогоний.
При достижении концентрации сперматогоний не менее 0,2 млн. в 1 мл среды и появлении сперматоцитов проводят интеграцию (вшивание) генетического вектора нужной направленности путем адсорбации вектора на поверхность сперматогоний и сперматоцитов с последующим проникновением в клетки.
Пример 3. На третьем этапе культивирования используют среду следующего состава (в об%): среда 199-50; среда RPMJ – 1640-20; фетальная сыворотка КРС – 20; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) – 0,015; фиторостовой фактор (ФРФ) – 0,015; фактор роста-2 (ИФР 2) – 0,015; фетуин – 0,015; трансферин – 0,015; глюкоза – 0,15; лактоза – 0,05; сахароза – 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) – 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) – 0,001; сыворотка крови самцов соответствующего вида в период наступления половой зрелости 4,0; среда Игла – остальное до 100,0. Культивирование проводят при температуре 3335oС; рН 7,0-7,4 ед; pО2 30-50% насыщения и еН 140-180 мВ. Культивирование осуществляют в течение 15-45 суток.
Регулярно через 48 часов проводят микроскопический и генетический контроль популяции клеток. При достижении концентрации сперматоцитов не менее 0,2 млн. в 1 мл среды и при обнаружении генетического вектора нужной направленности не менее чем у 90% клеток переходят к четвертому этапу культивирования.
Пример 4. Сперматоциты концентрируют не менее чем в 10 раз и культивируют до полной дифференции клеток в зрелые сперматозоиды. Культивирование проводят в питательной среде следующего состава (в об%): среда 199-50; среда RPMJ-1640-20; фетальная сыворотка КРС – 20; эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) – 0,015; фиторостовой фактор (ФРФ) – 0,015; фактор роста 2 (ИФР-2) – 0,015; лактоза – 0,05; сахароза – 0,05; аденозинтрифосфат (АТФ) – 0,001; аденозиндифосфат (АДФ) – 0,001; сыворотка крови самцов соответствующего вида в период наступления половой зрелости – 4,0; триптозофосфатный бульон – 0,5; эмбриональный экстракт – 0,5; среда Игла – остальное до 100.
Культивирование проводят при температуре 33-35oС; рН 7,0-7,4 ед.; рО2 30-50% насыщения и еН 140-180 мВ.
В процессе четвертого этапа культивирования проводят микроскопический контроль популяции клеток. При морфологической зрелости спрематозоидов не менее чем в 90% случаев их концентрируют не менее чем в 10 раз и используют для формирования криобанка спермы с генетическим вектором.
Сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности можно использовать для получения трансгенных животных.
Преимущества заявляемого способа:1. Заявляемый способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма. 2. Заявляемый способ позволяет получить однородные популяции сперматозоидов с генетическим вектором нужной направленности и избежать феномена иммунологического отторжения донорских сперматогоний в организме реципиента. Формула изобретения
|
||||||||||||||||||||||||||
