Патент на изобретение №2196421
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ IN VITRO
(57) Реферат: Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений. Трансформированную кукурузу in vitro получают кокультивированием эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, предварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков. Кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус. Добавляют антибиотики поэтапно, сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений. Способ обеспечивает увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 8,1 до 21,6 для незрелых зародышей и от 14,5 до 40,1 для эмбриогенного каллуса при стабильной воспроизводимости результатов, а также улучшение его технологичности по сравнению с баллистическим методом за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала. 1 табл. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений. Известен способ получения трансформированных растений (Драйпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (Ред.) Генная инженерия растений. – М.: Мир. – 1991. – 408 с.). Этот способ заключается в кокультивировании эксплантов растений с агробактериями в жидкой питательной среде, с последующим культивированием на твердой питательной среде, содержащей антибиотики, один – элеминирующий рост агробактерий и другой – селективный агент, в частности антибиотик канамицин. Недостаток этого способа заключается в том, что при применении его к культуре тканей кукурузы происходят ингибирование морфогенеза и подавление регенерации. Недостатком этого способа является малый выход трансформированной кукурузы, нестабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов только незрелых зародышей и нетехнологичность процесса, а именно его трудоемкость. Задачей настоящего изобретения является создание такого способа получения трансформированных растений кукурузы, который бы обеспечивал увеличение выхода канамициноустойчивых растений, стабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов как незрелых зародышей, так и эмбриогенного каллуса и улучшение его технологичности. Эта задача решается новым способом получения трансформированной кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, преварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков, причем кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус, а добавление антибиотиков проводят поэтапно: сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений. Заявляемые пределы концентрации цефотаксима определяются следующим образом: использование концентрации ниже 100 мг/л не элиминируют агробактерии, а при использовании концентрации выше 300 мг/л подавляется регенерационная способность эмбриогенного каллуса. Сущность изобретения, по мнению авторов, заключается в том, что в предлагаемом способе кокультивирования эксплантов осуществляют на газоне агробактерий, который выращивают на твердой питательной среде для роста кукурузы, что не ингибирует активность морфогенеза и регенерацию растений, а поэтапное добавление пониженных доз цефатоксима вызывает не только элиминацию агробактерий, но и стимуляцию регенерации. При поэтапном добавлении антибиотиков происходит разделение процесса элиминации с одновременной стимуляцией регенерации и последующей селекцией уже полученных регенерантов. Изобретение иллюстрируется следующими примерами, причем результаты, представленные в примерах 1-6, являются воспроизводимыми и математически усредненными, они приведены в таблице. Трансфекция генов подтверждена молекулярными анализами, такими как ПЦР и гибридизация по Саузерну. Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют Сх – 200 мг/л. Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют Сх – 300 мг/л. Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксплантов используют эмбриогенный каллус трех линий 91, А 188 и гибрид между ними (А188х91), а концентрация Сх – 100 мг/л. Пример 5. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что концентрация Сх – 200 мг/л Пример 6. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют Сх – 300 мг/л. В результате настоящего способа обеспечено увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 8,1 до 21,6 для незрелых зародышей и от 14,5 до 40,1 для эмбриогенного каллуса при стабильной воспроизводимости результатов, а также улучшение его технологичности по сравнению с баллистическим методом за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 29.06.2003
Извещение опубликовано: 10.02.2005 БИ: 04/2005
|
||||||||||||||||||||||||||
