Патент на изобретение №2196334
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРОГРЕДИЕНТНОГО ТЕЧЕНИЯ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
(57) Реферат: Способ может быть использован в области медицины, в частности в клинической неврологии. Методом ИФА определяют уровень цитокинов ФНО-  и ИЛ-4 в сыворотке крови больного в конце восстановительного периода. И при уровне цитокинов ФНО- выше 16,8 пкг/мл, а цитокина ИЛ-4 ниже 97,88 пкг/мл диагностируют прогредиентное течение травматической болезни головного мозга (ТБГМ). Способ обеспечивает диагностику прогредиентного течения ТБГМ на ранних этапах развития заболевания, обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий. 2 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической неврологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики прогредиентности течения травматической болезни головного мозга /ТБГМ/. Известен способ диагностики прогредиентности ТБГМ по динамичной оценке состояния иммунной системы больных, перенесших черепно-мозговую травму /ЧМТ/, при помощи иммунологических тестов I уровня (определение количества лейкоцитов и лимфоцитов, иммуноглобулинов М, A, G, фагоцитарного индекса и показателя фагоцитоза), реже – II (определение Т-супрессоров, Т-хелперов, NK-лимфоцитов, антител к антигенам и циркулирующих иммунных комплексов) [В. И. Горбунов и И.В. Ганнушкина (Клиническое руководство. Часть I. “Черепно-мозговая травмам. – М.: “АНТИДОР”, 1998 год, 550 с.]. Ни один из используемых тестов не дает возможности оценить степень выраженности воспалительного процесса, с его воспалительным и противовоспалительным компонентами. Недостатками используемых методов диагностики является то, что ни один из используемых тестов не дает возможности оценить многоуровневый иммунный воспалительный процесс, с его воспалительным и противовоспалительным компонентами. А также необходимость проведения исследований в динамике, что увеличивает сроки постановки диагноза и проведения терапии. Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что у больного в конце восстановительного периода ЧМТ методом иммуноферментного анализа /ИФА/ определяют в сыворотке крови уровень цитокинов: фактора некроза опухоли- и интерлейкина-4 /ФНО- и ИЛ-4/, и при уровне провоспалительного цитокина ФНО- выше 16,8 пкг/мл, а противовоспалительного цитокина ИЛ-4 ниже 97,88 пкг/мл у больных диагностируется прогредиентное течение ТБГМ.
ФНО- является маркером воспалительного процесса, а ИЛ-4 – противовоспалительного. В oпpеделенных условиях, у ряда пациентов иммунные реакции приобретают патогенный характер (высокий уровень провоспалительного цитокина и низкий – противовоспалительного сохраняется длительное время), что усугубляет течение ТБГМ, способствуя тем самым прогредиентности ее течения и ухудшению исходов ЧМТ. Высокий уровень провоспалительного цитокина в сыворотке крови больных с обострением посткоммоционного синдрома указывает на наличие неспецифического воспалительного процесса в центральной нервной системе /ЦНС/. А низкий уровень противовоспалительного цитокина – на несостоятельность защитных иммунологических реакций.
Способ диагностики прогредиентности течения ТБГМ осуществляют посредством определения уровней цитокинов: ФНО- и ИЛ-4 в сыворотке крови методом ИФА. У больного в конце восстановительного периода ЧМТ (по окончании 2 месяцев от начала заболевания), утром, натощак производится забор 5 мл крови из кубитальной вены, затем из крови, путем центрифугирования получают сыворотку, которую используют в ИФА для определения уровней ФНО- и ИЛ-4. Методика определения уровня ФНО-: концентрацию ФНО- в сыворотке крови определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. На поверхность пластиковых планшетов с иммобилизированными антителами вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку (буфера С, стандартов ФНО-, исследуемые образцы). Сорбция антител осуществляется путем инкубирования планшета в течение 1 ч при 37oС, сопровождается непрерывным встряхиванием. Несорбированные антитела удаляются из лунок троекратным промыванием отмывочным буфером и однократным – дистиллированной водой. Затем аспирируется оставшаяся жидкость. После этого в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора вторых антител и плату инкубируют 2 ч при 18-20oС при непрерывном встряхивании. Затем удаляют жидкость троекратным промыванием буфера и однократным – дистиллированной водой. Оставшееся содержимое полностью аспирируют. В последующем в лунки вносят конъюгат, меченный пероксидазой хрена со стрептавидином, имеющим очень высокое сродство к биотину, разбавленный буфером (100 мкл). Затем инкубируют планшеты 30 мин при 18-20oС при постоянном встряхивании. Удаляют жидкость из ячеек, троекратно промывают буфером, аспирируют оставшуюся жидкость. Затем двукратно промывают планшеты дистиллированной водой. После чего планшет обсушивают. Затем в лунки вносят окрашивающий раствор ортофенилендиамина (5 мг на планшету) и 1 каплю 30%-ного пергидроля. Платы инкубируют в течение 10-20 мин при комнатной температуре в защищенном от прямых солнечных лучей месте, после чего останавливают реакцию, добавляя в каждую лунку 50 мкл раствора серной кислоты. Строят калибровочную кривую “оптическая плотность/концентрация”, пользуясь известными данными о количестве внесенного стандарта. По полученной кривой подсчитывают концентрацию ФНО- в образцах. Методика определения уровня ИЛ-4 в сыворотке крови аналогична методике определения ФНО-, за исключением используемых антител. Установлено, что уровень провоспалительного цитокина ФНО- у здоровых доноров колеблется от 8,9 до 16,8 пкг/мл, а у больных с прогредиентным течением ТБГМ от 72,6 до 287,3 пкг/мл. Уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-4 у здоровых доноров колеблется от 97,88 до 504,5 пкг/мл, а у больных с прогредиентным течением ТБГМ содержание этого цитокина от 10,98 до 170,2 пкг/мл.
Пример.
Больной П. С. В. (и/б 1264), 30 лет, поступил 14.01.99. Жалобы при поступлении на приступообразную, диффузную, интенсивную головную боль в утренние часы, выраженное головокружение несистемного характера, тошноту, трижды рвоту на высоте головной боли. Отмечал 5 приступов утраты сознания (за последние 4 месяца) с выраженной общей слабостью и сонливостью по выходе из них; 2 месяца тому назад – генерализованный судорожный припадок. Кроме того пациент отмечал снижение работоспособности, расстройства сна, снижение памяти.
Из анамнеза заболевания: год назад перенес ЧМТ, которая нейрохирургом была расценена как СГМ, больной в течение 2-х недель получал стационарное лечение. Вышеперечисленные жалобы появились через 3 месяца после выписки из стационара, по поводу чего обращался за медицинской помощью амбулаторно, когда ему и было проведено иммунологическое исследование, включавшее определение уровня цитокинов: ФНО- и ИЛ-4. До травмы головного мозга хроническими заболеваниями не страдал, приступов утраты сознания не отмечалось.
Объективно: кожные покровы бледные, сухие, видимые слизистые – розового цвета. Пульс 72 удара в минуту, ритмичный, удовлетворительных качеств: АдD 120/60 мм рт.ст., АдS 110/60 мм рт.ст., ЧДД 16 в минуту.
Неврологический статус: глазные щели симметричны, D=S; зрачки обычной формы и размеров, D=S; фотореакция сохранена; горизонтальный установочный нистагм в обе стороны, ярче влево. Корнеальные рефлексы сохранены. Движения глазных яблок в стороны в полном объеме. Конвергенция не нарушена. Точки выхода тройничного нерва безболезненны. Живой нижнечелюстной рефлекс. Выявляется недостаточность левой носогубной складки, S 82,129; ИЛ-4 22,5 (при норме ФНО- 8,9-16,8; ИЛ-4 97,88-504,5).
Диагноз. Травматическая болезнь головного мозга. Прогредиентное течение. Судорожный синдром.
По полученным результатам исследования цитокинового статуса видно, что у данного больного уровень провоспалительного цитокина ФНО- гораздо превышает его уровень у здоровых доноров, а уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-4 – ниже, на основании чего можно сделать заключение о том, что изучаемые цитокины являются маркерами прогредиентного течения ТБГМ.
Способ диагностики прогредиентного течения ТБГМ был апробирован на 36 больных мужчинах в период обострения посткоммоционных синдромов в возрасте от 17 до 40 лет. У 19 (53%) человек посткоммоционные синдромы сформировались после перенесенной одной травмы. У 17 (47%) – в медицинской документации зарегистрировано несколько нетяжелых (легкой и средней степени тяжести) травм (от 2 до 4). У данного контингента больных были выделены следующие ведущие клинические синдромы: вегетативно-сосудистый у 13 (36%) человек, гипертензионно-гидроцефальный – у 13 (36%), судорожный – у 9 (28%). В наблюдаемой группе больных (основная группа) длительность травматической болезни головного мозга составила: до 3-х лет – 19 (53%) человек; от 3-х до 6-и лет – 17 (47%). Также обследовалось 15 здоровых доноров (контрольная группа). Обследованные в группах сопоставимы по полу и возрасту.
Всем обследованным производился забор крови и определение уровней цитокинов перечисленным выше способом.
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных с обострениями посткоммоционных синдромов (вегетативно-сосудистого, гипертензионно-гидроцефального и судорожного) при сравнении со здоровыми донорами (пкг/мл). И в таблице 2. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных с обострениями посткоммоционных синдромов, с последствиями одной и повторных травм при сравнении со здоровыми донорами (пкг/мл).
Для статистического анализа полученных данных вычисляли медиану. Сравнение в исследованных группах проводилось при помощи непараметрических методов сравнения с использованием критериев Уилкоксона (сравнение медиан) и Колмагорова-Смирнова (сравнение кумулятивных функций распределения). Уровень достоверности оценивался значением р. Данный метод статистического анализа позволяет получить истинное представление о совокупностях, не подчиняющихся нормальному закону распределения, содержащих достаточно малое количество наблюдений и имеющих выбросы.
Проведенные исследования показали, что у всех больных (основная группа) в период обострения посткоммоционного синдрома независимо от его клинических проявлений и от кратности ЧМТ, при сравнении с контрольной группой секреция воспалительных и противовоспалительных цитокинов изменена. А именно, статистически достоверно определено повышение уровня ФНО- и понижение уровня ИЛ-4.
Следовательно, период обострения посткоммоционных синдромов сопровождается иммунными реакциями, которые вызывают выраженное и длительное течение воспаления, способное привести к нарушению метаболизма клеток, вызывая тем самым деструкцию ткани и неся ответственность за прогредиентность течения заболевания.
Суммируя все вышесказанное, становится возможным сделать предположение о том, что изучаемые цитокины являются предикторами прогредиентности течения ТБГМ. Таким образом, принципиально важно выявление больных с риском развития прогредиентного течения данного заболевания для их активного диспансерного наблюдения и проведения рациональной во временном отношении терапевтической стратегии, нацеленной как на ранние, так и на поздние хронические процессы у больных в группе риска прогредиентного течения ТБГМ и у больных с уже сформировавшимися посткоммоционными синдромами.
Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:1. Данный метод более специфичен в оценке факторов воспаления и противовоспалительного компонентов воспалительного процесса. 2. Определение воспалительного и противовоспалительного цитокинов имеет высокую точность в описании неспецифических воспалительных процессов при прогредиентном течении ТБГМ. 3. Возможность на ранних этапах развития заболевания диагностировать прогредиентное течение ТБГМ. 4. Своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий. 5. Забор крови для данного исследования может осуществляться одновременно при взятии крови для общеклинических исследований. 6. Процедура забора крови достаточно проста и может осуществляться как в стационарных, так и в амбулаторных (поликлинических) условиях. Формула изобретения
и ИЛ-4, и при уровне цитокина ФНО- выше 16,8 пкг/мл, а цитокина ИЛ-4 ниже 97,88 пкг/мл диагностируют прогредиентное течение ТБГМ.
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 21.02.2003
Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
