Патент на изобретение №2196175

(54) ИНГИБИТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению индолсодержащих производных малеимида общей формулы I, где если R=R¹ – H, то R² – H или низший алкил и R³ –-D-ксилопиранозил (D-Xyl), -D-галактопиранозил (D-Gal), -L-арабинопиранозил (L-Ara), -D-лактопиранозил (D-Lac) или – ОСН₂ОСН₂СН₂ОН, или если R+R¹ – простая связь, то R² – Н или низший алкил и R³ –-D-ксилопиранозил, -D-галактопиранозил, -L-арабинопиранозил или – ОСН₂ОСН₂СН₂ОН, в качестве ингибитора растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ). Изобретение может быть использовано в биохимии для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия рГЦ. Соединения настоящего изобретения являются более эффективными ингибиторами активности рГЦ (степень ингибирования 31,4-86,1% в концентрации 50 мкМ), чем их наиболее близкий структурный аналог – доксорубицин (19,5%). 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению известных индолсодержащих производных малеимида общей формулы I

где если R=R¹ – H, то R² – Н или низший алкил и R³ –-D-ксилопиранозил (D-Xyl), -D-галактопиранозил (D-Gal), -L-арабинопиранозил (L-Аrа), -D-лактопиранозил (D-Lac) или -ОСН₂OСН₂СН₂OН, или если R+R¹– простая связь, то R² – Н или низший алкил и R³ – -D-ксилопиранозил, -D-галактопиранозил, -L-арабинопиранозил или -OCH₂OCH₂CH₂OH, в качестве ингибиторов растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Изобретение может быть использовано в биохимии для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия рГЦ.

Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2. ; гуанозин-5′-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3′, 5′-циклофосфата (цГМФ) – универсального регулятора внутриклеточного метаболизма (Hobbs, A. J. “Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling” Trends in Pharm. Sci., 1997, v.l8, 12, p.487-491[1]). ГЦ существует в двух формах – мембранной и растворимой и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Основным эндогенным активатором рГЦ является оксид азота, который в результате взаимодействия с атомом железа гема, входящего в состав фермента, образует комплекс нитрозил-гем. Известны также соединения, способные активировать рГЦ по гем-независимому механизму: например протопорфирин IX, ионы Мn²⁺, арахидоновая кислота и др.

В настоящее время для изучения возможного участия рГЦ в различных физиологических процессах применяют ингибиторы данного фермента, в частности 3,7-бис(диметиламино)фенотиазинийхлорид (метиленовый синий), 6-(фениламино)-хинолин-5,8-дион (LY 83583) и 1Н-[1,2,4]-оксадиазоло[4,3-а]хиноксалин-1-он (ОДХ) [1]. Данные соединения являются ингибиторами NO-зависимой активации рГЦ. Кроме того, они в аэробных условиях способствуют образованию супероксид-аниона (кроме ОДХ), а также действуют на другие биологические объекты.

Известно применение для ингибирования базальной активности рГЦ различных модификаторов тиольных групп, а именно: N-этилмалеимида и 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (Tsai, S.-C., Adamik, R., et al. “Reversible inactivation of soluble liver guanylate cyclase by disulfides” Biochem. Biophys Res. Commun., 1981, v.100, 2, p.637-643).

Недостатками вышеуказанных соединений являются неспецифичность и низкая эффективность ингибирующего действия.

Известно ингибирование базальной активности рГЦ динитрилом 3,4-дигидроксибензилиденмалоновой кислоты формулы II

Действие данного соединения на гем-зависимую и гем-независимую активацию рГЦ не изучено (Wolbring, С.. Hollenberg M.D., Schnetkamp, P.P.M., “Inhibition of GTP-utilizing enzymes by tyrphostins” J.Biol.Chem., 1994, v. 269, 36, p.22470-22472).

Известен бис(N, N-диметиламид)азодикарбоновой кислоты (диамид) формулы III

оказывающий ингибирующее действие на базальную и NO-зависимую активацию рГЦ (Craven, P.A., DeRubertis, F.R. “Effects of thiol inhibition on hepatic guanylate cyclase activity. Evidence for the involvement of vicinal dithiols in the supression of basal and agonist-stimulated activity” Biochim. Biophys. Acta, 1978, v.524, p.231-244).

Основным недостатком данного соединения является низкая эффективность ингибирующего действия на фермент (IС₅₀=0,5-20 мМ).

Известно ингибирование базальной активности рГЦ макроциклическими производными азофуразана, в частности циклическим тетрамером азофуразана формулы IV

(патент РФ 2151799 (C 12 N 9/99, 9/88) 1999).

Данное соединение практически не влияет на гем-зависимую активацию рГЦ под действием известного NO-донора – нитропруссида натрия.

Известно уменьшение базальной и NO- зависимой активностей рГЦ под действием ингибиторов цитохром Р-450-содержащей монооксигеназы, в частности метирапона (2-метил-1,2-бис(пиридил-3)-1-пропанона) формулы V и 2,3,5-триметил-6-(12-гидроксидодека-5,10-диинил)-1,4-бензохинона (АА 861) формулы VI


(Forstermann, U. , Alheid, U., et al. “Mechanisms of action of lipoxygenase and cytochrome P-450-mono-oxygenase inhibitors in blocking endothelium-dependent vasodilatation” Br. J. Pharm., 1988, v.93, p.569-578).

Недостатками данных соединений являются неспецифичность и низкая эффективность ингибирующего действия на фермент (IС₅₀=0,1-3 мМ).

Известно, что соединения общей формулы I, где R-R³ имеют вышеуказанные значения, обладают антипролиферативными свойствами (Мельник С.Я., Бахмедова А.А. и др. “Синтез и антипролиферативные свойства гликозидов бис(индолил)фуран-2,5-диона и бис(индолил)-1H-пиррол-2,5-диона” Биоорг. химия. 1996, т.22, 6, с.458-467 [7]; Бахмедова А.А, Гараева Л.Д. и др. “N-Гликозиды производных индоло[2,3-а]карбазола” Биоорг. химия, 1997, т.23, 8, с.667-674 [8]).

Способность данных соединений ингибировать активность рГЦ до настоящего времени не изучена.

Наиболее близким к соединениям общей формулы I в ряду полициклических гликозильных производных является противоопухолевый антибиотик доксорубицин (адриамицин) формулы VII

ингибирующий базальную и NO-зависимую активность рГЦ (Lehotai, D.C., Levey, В.А., et.al. “Inhibition of cardiac guanylate cyclase by doxorubicin and some of its analogs: possible relationship to cardiotoxicity” Cancer Treat. Rep., 1982, v.66, 2, p.311-316; Vesely, D.L., Levey, G.S., “Inhibition of nitroso chemical carcinogen activation of rat hepatic cyclase by anticancer reagent” Oncology, 1979, v.36, 3, p.122-126 – прототип).

Недостатком данного соединения является низкая эффективность ингибирующего действия на фермент (IC₅₀=0,26-1 мМ).

Цель изобретения – поиск и выявление новых ингибиторов рГЦ, обладающих более выраженными ингибирующими свойствами.

Указанная цель достигается применением известных индолсодержащих производных малеимида общей формулы I, где R-R³ имеют вышеуказанные значения, в качестве ингибиторов рГЦ.

Индолсодержащие производные малеимида общей формулы I, где R=R¹, были получены известным способом, основанным на реакции соответствующего N-гликозида индола в виде пер-O-ацетата с оксалилхлоридом в среде хлористого метилена с последующей циклоконденсацией промежуточного производного индол-3-илглиоксилилхлорида с 1-алкилиндол-3-илуксусной кислотой при нагревании в дихлорэтане в присутствии триэтиламина, обработкой промежуточных производных 3,4-бис(индол-3-ил)фуран-2,5-диона водным аммиаком в N,N-диметилформамиде при повышенной температуре [7]; и, при необходимости, фотоциклизацией (при синтезе соединений формулы I, где R+R¹ – простая связь) [8].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ингибирующее действие индолсодержащих производных малеимида общей формулы I на Мn²⁺-зависимую активность препарата частично очищенной рГЦ из легких быка.

Гемсодержащий фермент из легких быка выделяли по известному способу. Легкие измельчали при 4^oС, гомогенизировали в пяти объемах буфера А (50 мМ триэтаноламингидрохлорид (рН 7,6), содержащий 5 мМ дитиотреитол и 75 мМ NaCl), и центрифугировали при 100000g в течение 1 ч. Супернатант наносили на колонку ДЭАЭ-Тойоперл 650М (Toyosoda, Япония), уравновешенную буфером А, и проводили элюцию линейным градиентом NaCl (от 0,075 до 0,5 М) в буфере А. Пик активности фермента элюировался при ионной силе, соответствующей концентрации NaCl 0,22 М. Фракции, содержащие максимальную активность, концентрировали и подвергали гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-300 (Pharmacia, Швеция), уравновешенной буфером А. Активные фракции объединяли, концентрировали и проводили хроматографию на колонке с голубой агарозой CL-4B (Таллиннский ХФЗ, Эстония), уравновешенной буфером В (50 мМ триэтаноламингидрохлорид (рН 7,6), содержащий 10 мМ дитиотреитол и 10 нМ гемин). Белок элюировали линейным градиентом NaCl (от 0,05 до 1 М). Активные фракции объединяли, концентрировали и хроматографировали на колонке с Q-сефарозой (Fast Flow, Pharmacia, Швеция), уравновешенной буфером А. Фермент элюировали линейным градиентом NaCl от 0,075 до 1,5 М. рГЦ хранили в атмосфере азота в буфере С (50 мМ триэтаноламингидрохлорид (рН 7,6), содержащий 30% глицерин, 10 мМ дитиотреитол и 1 М NaCl) при -70^oС. Выход фермента (активность в присутствии 5 мМ МnСl₂) составлял 12%, а степень очистки – 120 раз. Фермент в 12,5 раз активировался 0,1 мМ нитропруссидом натрия в присутствии 10 мМ дитиотреитола.

Активность фермента определяли по количеству образовавшегося цГМФ известным радиоизотопным способом с использованием [–³²P]ГТФ в качестве субстрата рГЦ.

Инкубационная смесь для определения активности (общий объем пробы 100 мкл) содержала 50 мМ Трис-НСl (рН 7,6), 5 мМ MnCl₂, 0,2 мМ ГТФ (200000 имп/мин [–³²P]ГTФ на пробу), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ креатинфосфат, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 2 мМ цГМФ, ферментный препарат. Концентрация соединения в пробе составляла 110^-4 М, ДМСО – 0,2 об. %. В пробы вносили последовательно белок, инкубационную смесь и индолсодержащие производные малеимида общей формулы I, инкубировали 10 мин и затем начинали реакцию. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали в термостате при 37^oС в течение 15 минут. Реакцию останавливали перенесением проб на 2 минуты в кипящую водяную баню. После соосаждения непрореагировавшего ГТФ под действием карбоната цинка и центрифугирования в полученном супернатанте определяли количество образовавшегося [³²Р]ГМФ вышеуказанным способом с использованием хроматографии на колонках с кислой окисью алюминия. Определение белка проводили по способу Лоури, в качестве стандарта использовали человеческий сывороточный альбумин.

Индолсодержащие производные малеимида общей формулы I оказывали ингибирующее действие на Мn²⁺-зависимую активность препарата частично очищенной рГЦ из легких быка. Так, эффективность ингибирующего действия ЛХС-959, ЛХС-969, ЛХС-976 и ЛХС-983 в концентрации 50 мкМ при инкубации в присутствии 10 мМ дитиотреитола составляла 64; 74,7; 94,7 и 84% соответственно.

Пример 2. Ингибирующее действие индолсодержащих производных малеимида общей формулы I на активацию препарата очищенной рГЦ из легких быка под действием 3-(4-морфолино)сиднонимина (SIN-1).

Активность рГЦ измеряли так же, как описано в примере 1, но в инкубационную смесь, не содержащую МnС1₂, через 10 мин инкубации в присутствии индолсодержащих производных малеимида общей формулы I добавляли раствор SIN-1 до конечной концентрации 100 мкМ.

Индолсодержащие производные малеимида общей формулы I оказывали ингибирующее действие на активацию препарата очищенной рГЦ из легких быка под действием SIN-1. Результаты представлены в таблице.

Как вытекает из примеров 1 и 2 и приведенных известных данных, соединения настоящего изобретения являются более эффективными ингибиторами активности рГЦ, чем их структурный аналог – доксорубицин.

Таким образом, применение индолсодержащих производных малеимида общей формулы I, ингибирующих рГЦ, расширяет ассортимент эффективных модуляторов активности данного фермента.

Формула изобретения

1. Применение индолсодержащих производных малеимида общей формулы

где если R= R¹ – H, то R² – H или низший алкил и R³ –-D-ксилопиранозил, -D-галактопиранозил, -L-арабинопиранозил, -D-лактопиранозил или – ОСН₂OСН₂СН₂ОН, или если R+R¹ – простая связь, то R² – H или низший алкил и R³ –-D-ксилопиранозил, -D-галактопиранозил, -L-арабинопиранозил или – ОСН₂OСН₂СН₂OН,
в качестве ингибитора растворимой формы гуанилатциклазы.

2. Применение индолсодержащего производного малеимида по п. 1, где R= R¹= R² – H и R³ – -D-ксилопиранозил, в качестве селективного ингибитора Мn²⁺-зависимой активации растворимой формы гуанилатциклазы.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.01.2003

Номер и год публикации бюллетеня: 16-2004

Извещение опубликовано: 10.06.2004