Патент на изобретение №2195669

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АТРОФИИ ЗРИТЕЛЬНОГО НЕРВА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии и неврологии. Способ обеспечивает получение надежного критерия диагностики атрофии зрительного нерва. Выделяют из ткани мозга тестовые антигены, инкубируют их с тестируемой сывороткой пациента, определяют белковые фракции с мол. м. 7 кД и/или 34 кД и при выявлении антител к этим белковым фракциям диагностируют атрофию зрительного нерва. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и к способам анализа материалов, содержащих антигены и антитела, а именно к способу диагностики с использованием тестовых антигенов.

Способ позволяет диагностировать патологию зрительного тракта и может найти применение в офтальмологии и неврологии.

Диагностика патологии зрительного тракта производится, как правило, по данным клинического, неврологического и офтальмологического обследования пациентов и включает методы: ангиографию, рентгеноскопию, ядерный магнитный резонанс и т.д. (RU 2130612 C1, 20.05.1999).

Известен способ диагностики глаукомы [1], который заключается в выявлении аутоантител к денатурированной ДНК. В предлагаемом способе денатурированная ДНК используется как антиген-маркер, например, для иммуноферментного анализа сыворотки крови пациента. Диагностика относится к повреждениям тканей глазного яблока.

Недостатком способа является принцип использования мономаркера, т.е. реакции антиген – антитело к одному тестовому антигену -денатурированной ДНК. Кроме того, он не позволяет диагностировать внутриглазную патологию и патологию нервной ткани – зрительного тракта.

Известен способ мониторинга биологических жидкостей – ликвора и крови больных с церебральными инсультами [2], позволяющий анализировать изменения спектра нейроспецифических белков (НСБ) в этих жидкостях. В данном способе для выявления НСБ применены антисыворотки к ограниченному числу НСБ, что исключает возможность выявления реакций с иными белками, антисыворотки к которым отсутствуют.

Известен способ выявления сочетанных аутоиммунных реакций к антигенам центральной нервной системы (ЦНС) и глаза при патологии, не являющейся офтальмологической – рассеянном склерозе [3]. В публикации приводится факт присутствия аутоантител к антигенам сетчатки глаза в сыворотке крови пациентов с рассеянным склерозом, но не ставится задача дифференцировать специфические составляющие аутоиммунных реакций зрительного тракта и ЦНС.

Известен способ диагностики канцер-ассоциированной ретинопатии, включающий выделение морфологической структуры ткани – сетчатки глаза, разделение на фракции путем центрифугирования, хроматографического фракционирования с последующим твердофазным иммуноферментным анализом аутоантител в сыворотке крови пациента. Очищенный антиген (белок с молекулярной массой 26 кД) используют для идентификации присутствующих в сыворотке крови больного аутоантител к этому антигену. По наличию аутоантител в сыворотке крови обследуемых больных диагностируется канцер-связанная ретинопатия [4].

Недостатком данного способа является то, что применен принцип использования мономаркера, вследствие этого способ, включающий использование одного антигена, менее точен. Кроме того, этот способ предназначен для диагностики внутриглазной патологии – ретинопатии, ассоциированной с раком, и не позволяет диагностировать патологию зрительного тракта – атрофию зрительного нерва.

Задачей изобретения является получение надежного критерия диагностики атрофии зрительного нерва.

Поставленная задача в предлагаемом способе диагностики атрофии зрительного нерва решается тем, что выделяют антигены из морфологической структуры ткани путем очистки известными приемами с последующим проведением иммуноферментного анализа с определением аутоантител в сыворотке крови больного, а в качестве источника тестовых антигенов используют ткани гомологичного мозга плода и путем сравнения опытных и контрольных полос определяют специфические белковые фракции – антигены – и при получении их в виде двух белковых фракций с молекулярной массой 7 и/или 34 кД диагностируют атрофию зрительного нерва.

В качестве источника тестовых антигенов используют ткани гомологичного эмбрионального мозга, из которого путем очистки выделяют те фракции – антигены, которые присутствуют только в сыворотках крови больных с атрофией зрительного нерва.

Существенным отличием заявляемого способа от известного является то, что в качестве источника тестовых антигенов использованы ткани гомологичного мозга, что позволяет включить в материал пробы ткани, максимально вовлеченные в патологию зрительного тракта и тем самым повысить достоверность идентификации аутоиммунных реакций, специфичных для атрофии зрительного нерва.

Кроме того, путем сравнения опытных и контрольных полос определяют специфические белковые фракции – антигены и при получении их в виде двух белковых фракций с молекулярными массами 7 и/или 34 кД диагностируют атрофию зрительного нерва.

Именно эти конкретные значения, а не любые другие, отличные от указанных значений, определяют специфичность антител при данной патологии. При иных значениях мМ (при положительных реакциях сывороток крови пациентов с антигенами иных молекулярных масс) эта патология не диагностируется.

Эти отличительные признаки в известных способах не обнаружены, что позволяет сделать вывод о соответствии способа критериям “существенные отличия” и “новизна”.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве исходного материала используют ткани гомологичного мозга плода, который замораживают при температуре -60-65^oС. Образец ткани в дальнейшем обрабатывают при температуре +4^oС. Образец ткани помещают в 0,05 М фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,4 и гомогенизируют до получения суспензии. Гомогенат разделяют на фракции путем центрифугирования при скорости вращения 2000 об/мин.

В аликвоту полученного супернатанта, содержащего экстракт цитозольной фракции клеток, добавляют 25% объема стандартного буфера по Laemmly, представляющего собой 3-кратный концентрированный форезный ТРИС-глициновый буфер с добавлением додецилсульфата натрия (ДСН), меркаптэтанола и бромфенолового синего красителя, рН 7,4 и нагревают в кипящей водяной бане в течение 5 минут.

Полученный раствор фракционируют путем центрифугирования при 8000 об/мин в течение 15 минут.

Супернатант помещают в установку для электрофореза, представляющую собой плоскую прямоугольную стеклянную ячейку с расстоянием между стеклами 1-2 мм, герметизированную вдоль вертикальных сторон прокладками и заполненную полиакриламидным гелем, содержащим ДСН, имеющим градиент плотности 7-15%. Верхняя и нижняя (торцевые) стороны геля открыты для контакта с форезным буфером. На верхней стороне геля имеются две ячейки, в одну из которых длиной, например, 70-200 мм, помещают аликвоту супернатанта, в другую, например, длиной 4-8 мм, помещают 5-10 мкл маркерной смеси из нескольких белков с заранее известными молекулярными массами. В данной работе использованы белки – маркеры с диапазоном молекулярных масс 14-98 кД. Оптимальное количество супернатанта в ячейке – около 20 мкл на 1 см длины ячейки при толщине геля 1 мм и концентрации белков в супернатанте около 1 мг/мл.

В качестве форезного буфера используют ТРИС-глициновый буфер, содержащий 0,1% ДСН, рН 8,3.

Всю систему охлаждают до температуры не более 14^o-16^oС.

Электрофорез проводят при напряжении 100-120 вольт и начальной силе тока 25-30 мА.

После окончания электрофореза стеклянные пластины разнимают. Гель накладывают на нитроцеллюлозную мембрану. Проводят электроблоттинг – перенос белков, разделенных на геле на фракции – на мембрану при близком к оптимальному режиме с плотностью тока около 0,8 вольт-ампер/см², в ТРИС-глициновом буфере, содержащем 20% метанола, рН 8,3.

Полосу мембраны, содержащую разделенные маркерные белки, отрезают и окрашивают известными красителями для нитроцеллюлозной мембраны.

Основной лист мембраны, содержащий фракции пробы, разрезают на полоски шириной 2-5 мм.

Полоски, содержащие фракции пробы, инкубируют с тестируемыми сыворотками пациентов, разведенными фосфатно-солевым буфером, в течение 60 минут при температуре 37^oС.

После инкубации полоски отмывают фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% TWEEN-20 в качестве детергента, сменяя раствор 4-5 раз в течение 5 минут при покачивании.

После отмывки полоски инкубируют с конъюгатами IgG, меченными пероксидазой хрена, при температуре +37^oС.

Повторяют отмывку, как указано выше.

Под визуальным контролем инкубируют полоски при комнатной температуре в субстрате, представляющем собой раствор диамино-бензидина с хлорнафтолом в цитратном буфере рН 5,0 в присутствии перекиси водорода.

Инкубацию останавливают после появления на полосках поперечных штрихов, которые являются продуктами реакции аутоантител сыворотки крови с белками – антигенами, фракционированными на геле и перенесенными на полосы мембраны. При появлении признаков потемнения общего фона промывают полосы дистиллированной водой.

Сравнивают полоски, инкубированные в сыворотках крови опытной и контрольной групп, и определяют специфические белковые фракции, которые присутствуют на полосках мембраны, инкубированных с сыворотками крови опытной группы, и отсутствуют на полосках, инкубированных с сыворотками крови контрольной группы.

С помощью графика, построенного на основе измерения положения маркерных белков, находят значения молекулярных масс найденных белков, которые соответственно равны 7 и/или 34 кД, и диагностируют атрофию зрительного нерва.

Предлагаемый способ диагностики обоснован клинико-экспериментальными исследованиями сывороток крови 10 пациентов с атрофией зрительного нерва и 30 больных контрольной группы, страдающих различными формами детского церебрального паралича.

Способ апробирован в Научном центре здоровья детей Российской АМН в отделе восстановительного лечения детей с церебральными параличами на сыворотках крови 10 больных с атрофией зрительного нерва и дал положительные результаты.

Способ иллюстрируется следующими конкретными клиническими примерами.

Пример 1. Больная Ч-ка Е., 2 года 10 мес, поступила в стационар с предположительным диагнозом: ретинопатия недоношенных. После обследования предлагаемым способом в сыворотке крови выявлены аутоантитела к белковой фракции с молекулярной массой 7 кД. На основании полученных данных было сделано заключение о наличии патологии – атрофии зрительного нерва у данной больной, что было подтверждено клиническими и параклиническими данными.

Примеры с 2 по 13 приведены в таблице.

В примерах 9-13 диагноз атрофии зрительного нерва не подтвержден.

Предлагаемый способ диагностики представляется неочевидным для специалистов и позволяет с использованием оригинального комплекса показателей адекватно оценивать патологию зрительного тракта, в частности – атрофию зрительного нерва.

Предлагаемый способ позволяет специфически диагностировать патологию зрительного тракта, тогда как прототип направлен на диагностику патологии сетчатки глаза, ассоциированной с раком.

Вместе с тем предлагаемый способ позволяет повысить вероятность достоверной диагностики патологии зрительного нерва.

Поэтому очевидна медико-социальная значимость совершенствования ранней диагностики данного заболевания, создающего предпосылки для своевременного проведения лечебных и профилактических мероприятий.

Источники информации
1. Патент RU 2115928, G 01 N 33/53, 05.09.98.

4. Патент US 5753522, 1998 г.

Формула изобретения

Способ диагностики атрофии зрительного нерва, отличающийся тем, что выделяют из ткани мозга тестовые антигены, инкубируют их с тестируемой сывороткой пациента, определяют белковые фракции с мол. м. 7 кД и/или 34 кД и при выявлении антител к этим белковым фракциям диагностируют атрофию зрительного нерва.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.03.2008

Извещение опубликовано: 10.04.2010 БИ: 10/2010