Патент на изобретение №2194761

(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК МЕТОДОМ КОНКУРЕНТНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа определения внутреннего стандарта для количественного определения ДНК методом конкурентной полимеразной цепной реакции. Сущность изобретения: клонирование ДНК, отличающейся по размеру от выявляемой и амплифицирующейся с теми же праймерами, что и определяемая ДНК, в плазмиду, которая может быть выделена из Е. coli, при этом ПЦР проводят при пониженной температуре отжига, что приводит к образованию неспецифических продуктов реакции, отличных по длине от определяемой ДНК, которые используют в качестве внутреннего стандарта в ПЦР. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа и создании универсального стандарта. 2 ил.

Изобретение относится к областям молекулярной биологии и медицины, в которых возникает задача количественной оценки определенной последовательности ДНК, в частности к созданию медицинских диагностикумов для количественного определения выявляемой методом ПЦР последовательности ДНК в биологических жидкостях и тканях. Нами разработан способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК в конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Внутренний стандарт, добавленный в тестируемую пробу, позволяет оценить концентрацию искомой последовательности ДНК и избежать возможности получения ложноотрицательного результата. Внутренний стандарт представляет фрагмент ДНК, имеющий длину, отличную от длины ампликона (участка ДНК, выбранного для амплификации), но общие с ним районы, связывающие праймеры в ПЦР. Таким образом, внесенный в пробу внутренний стандарт и выявляемая последовательность конкурируют за связывание с праймерами и амплификацию в ПЦР. Равные количества продуктов будут амплифицированы в том случае, когда начальные концентрации и того и другого равны. Следует отметить, что при разработке подобных диагностикумов основную трудность представляет конструирование внутреннего стандарта. Ниже приведена работа авторов Ballagi-Pordany A., Belak S. (1), в которой предложен, на наш взгляд, наиболее простой способ конструирования внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта в ПЦР-системе для определения вируса бычьей лейкемии авторы использовали модифицированный фрагмент ДНК гена человеческого -актина, в который были введены участки, комплементарные праймерам, для определения вируса бычьей лейкемии. Для этого были синтезированы олигонуклеотиды, 3′ концы которых являлись праймерами к -актину, а 5′ концы содержали последовательности, комплементарные праймерам для выявления вируса бычьей лейкемии. С синтезированными олигонуклеотидами из ДНК -актина была проведена ПЦР. В результате реакции был получен продукт, который в дальнейшем мог амплифицироваться как со своими праймерами, так и с праймерами для выявления вируса бычьей лейкемии, что позволило использовать его в качестве внутреннего стандарта для количественного определения последнего.

Метод, предлагаемый нами, не требует, в отличие от прототипа, длительной генно-инженерной работы по модифицированию исходной последовательности ДНК, на базе которой конструируется внутренний стандарт. Мы предлагаем новый способ конструирования внутреннего стандарта для разработки количественных ПЦР- диагностикумов, основанный на том, что при температуре, существенно меньшей, чем оптимальная температура отжига в ПЦР, специфичность взаимодействия “праймер-матрица” снижается, и при этих низких температурах в реакции с произвольной ДНК и праймерами, разработанными для определяемой ДНК, образуется множество неспецифических ПЦР-продуктов, амплифицирующихся с данными праймерами, и, следовательно, коамплифицирующихся с выявляемой ДНК. Полученные ПЦР-продукты, являющиеся фрагментами ДНК, отличными по длине от выявляемого ампликона, после выделения и очистки можно использовать в качестве внутреннего стандарта для выявления искомой ДНК.

Описание предлагаемого способа конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК.

Для конструирования внутреннего стандарта мы предлагаем использовать произвольную ДНК и праймеры, разработанные для выявления искомой ДНК. С произвольной ДНК и праймерами проводят ПЦР, причем в первых пяти циклах температура отжига на 15-20^oС ниже температуры, оптимальной для данной пары праймеров, а во всех последующих циклах отжиг осуществляется при оптимальной температуре. Таким образом, в первых пяти циклах образуются неспецифические фрагменты ДНК различной длины, амплифицирующиеся с данными праймерами. При дальнейшей ПЦР эти фрагменты нарабатываются в количестве, достаточном для визуализации в агарозном геле. Полученный ПЦР-продукт представляет собой смесь фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых может служить внутренним стандартом в конкурентной ПЦР для определения наличия и количества данного патогена. Далее выбирают фрагмент, наиболее удобный по длине для использования в качестве внутреннего стандарта. Выбранные фрагменты впоследствии могут быть клонированы в плазмиду, соответствующая плазмида выделена из Е. coli, и после подсчета количества копий плазмидной ДНК в миллилитре водного раствора такие растворы могут быть использованы в качестве внутреннего стандарта для определения концентрации искомой ДНК методом конкурентной полимеразной цепной реакции.

Пример 1: разработка диагностикума для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сывортоке крови человека
В качестве исходной пробы при конструировании внутреннего стандарта для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови человека была взята кДНК, полученная из мононуклеарных клеток крови человека.

ПЦР к ДНК, мкл – 5
10Буфер (100mМ Tris, pH8.3, 50mМ КСl, 20mМ MgCl2, 40% формамид) – 2,5
dNTP, 2mM, мкл – 2,5
Праймер Нbа, 1мкМ, мкл – 2,5
Праймер Hbs, 1мкМ, мкм – 2,5
TAQ полимераза, ед – 5
Деионизованная вода, мкл – До 25
Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате при следующем температурном режиме:
Первые 5 циклов, ^oC/с:
94 – 15
37 – 15
72 – 15
Последующие 30 циклов,^oC/с:
94 – 15
56 – 15
72 – 15
Анализ ПЦР-продукта осуществляли с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Далее полученный ПЦР-продукт высаживали 96% этиловым спиртом, осадок растворяли в 20 мкл Н₂О и легировали в плазмиду pGem-T Easy с последующей трансфекцией в E-coli путем электропорации. Селекцию клеток проводили на чашках Петри с питательной средой в присутствии ампициллина, 5-бром-4-хлор-3-индолил--D-галактозида и изопропилтиогалактозида. Была отобрана колония клеток, содержащих вектор со вставкой длиной 500 пар оснований. Отобранные клетки были протестированы в ПЦР с праймерами для выявления вируса гепатита В. Полученный в реакции амплификат имел, как и ожидалось, длину 500 пар оснований. Далее, отобранные клетки были размножены в среде 2YT с ампициллином, плазмидная ДНК была выделена, очищена и растворена в воде в концентрации 10¹⁰ копий плазмиды в 1 мл. Таким образом, в результате был получен внутренний стандарт – раствор плазмидной ДНК, имеющей район, коамплифицирующийся в ПЦР с определяемой ДНК, в данном случае ДНК вируса гепатита В.

Был проведен количественный анализ сывороток крови человека на наличие вируса гепатита В. Пробы для анализа были приготовлены по методике, запатентованной нами ранее (2). Коротко: 50 мкл сыворотки были разведены в буфере, содержащем детергент NP-40 и диметилсульфоксид, смесь была прогрета при 95^oС в течение 10 мин, после чего образовавшийся сгусток был осажден центрифугированием, а супернатант разлит по 2,5 мкл в пробирки для PCR, за исключением первой пробирки, куда было добавлено 5 мкл Н₂О (отрицательный контроль). Во вторую пробирку к сыворотке было добавлено 2,5 мкл Н₂О, а в пробирки с 3-й по 10-ю к сыворотке последовательно добавляли по 2,5 мкл внутреннего стандарта в концентрациях от 10⁹ до 10³ копий/мл. Электрофореграмма продуктов ПЦР в агарозном геле, содержащем бромистый этидий, приведена на фиг. 1.

Из электрофореграммы видно, что на дорожке N5 – равные количества наработанных в процессе ПЦР продуктов, что означает равенство начальных концентраций матриц. Поскольку концентрация внутреннего стандарта в данном случае 10⁷ копий/ мл, следовательно, концентрация вируса в крови больного тоже 10⁷ копий/ мл.

Пример 2:
Получение внутреннего стандарта для ПЦР-определения рибосомной ДНК грибов.

При конструировании внутреннего стандарта для определения рибосомной ДНК грибов в крови человека, как и в предыдущем примере, взята кДНК, полученная из мононуклеарных клеток крови человека. Использованы следующие универсальные пангрибковые праймеры:
Fu-S – 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC – 3′
Fu-aS – 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3′.

Вся последующая работа описана в предыдущем примере.

В результате получен фрагмент ДНК длиной 500 пар нуклеотидов, содержащий на концах последовательности комплементарные праймерам Fu-S и Fu-aS соответственно. Фрагмент использован в качестве внутреннего положительного стандарта при амплификации участка рибосомной ДНК Candida albicans (см. фиг. 2).

Список литературы
1. Mol Cell Probes 1996 Jun; 10(3): 159-64 The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR.

2. Февралева И.С., Судариков А.Б. Способ определения парвовируса Б 19. Патент на изобретение 2146372, Государственный реестр изобретений Российской Федерации, 10 марта 2000 г., Москва.

Формула изобретения

Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК в конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий амплификацию в ПЦР и клонирование ДНК с измененным по сравнению с выявляемой ДНК размером и амплифицирующейся с теми же праймерами, что и выявляемая ДНК, и выявление плазмидной ДНК, имеющей район, коамплифицирующийся с выявляемой ДНК, отличающийся тем, что ПЦР проводят с использованием в качестве матрицы произвольной ДНК при температуре отжига ниже оптимальной для используемых праймеров и неспецифический продукт амплификации, отличный по длине от выявляемого продукта, используют в качестве внутреннего стандарта.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 33-2003

(73) Патентообладатель:

Судариков Андрей Борисович (RU)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 21.07.2003 № 17175

Извещение опубликовано: 27.11.2003

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

ООО “АКЦЕНТ”

Извещение опубликовано: 10.09.2004 БИ: 25/2004

BF4A – Аннулирование более ранней публикации

Аннулируемые сведения: В бюллетене № 25 за 2004 год в разделе “Извещения” ошибочно опубликовано извещение PD4A – Изменение наименования обладателя патента на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 25-2004

Извещение опубликовано: 10.11.2004 БИ: 31/2004