Патент на изобретение №2194759

(54) ШТАММ AZOTOBACTER CHROOCOCCUM – ПРОДУЦЕНТ ПОЛИ--ОКСИБУТИРАТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новому штамму. Новый штамм Azotobacter chroococcum 7Б является продуцентом поли--оксибутирата (ПОБ). Штамм выращивают на питательной среде, содержащей сахара в качестве источника углерода. Выход ПОБ составляет 70-95%. Изобретение позволяет синтезировать высокомолекулярный ПОБ не только в лабораторных, но и в производственных условиях.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый штамм Azotobacter chroococcum, используемый для получения термопластичного, биодеградабельного и биосовместимого полимера поли--оксибутирата (ПОБ), который может найти применение в медицине, сельском хозяйстве и промышленности.

Известны продуценты ПОБ, принадлежащие к различным родам бактерий Azotobacter, Alkaligenes, Methylobacterium (1, 2). Они обладают высокотехнологическими показателями, такими как высокое содержание ПОБ в клетках, выход биомассы, скорость синтеза биомассы и накопления ПОБ. Однако они растут преимущественно на газообразных источниках углерода, большинство штаммов получено генетическим путем, что может приводить к потере способности синтезировать целевой продукт, максимальный выход полимера составляет обычно 75-80%.

В качестве прототипа выбран штамм Azotobacter vinelandii ATCC 53799, способный использовать в качестве источника углерода углеводы. Выход целевого продукта 60-70% (3).

Задачей изобретения является получение нового устойчивого штамма бактерий, способного с высоким выходом синтезировать высокомолекулярный ПОБ (1200-1500 кДа) не только в лабораторных, но и в производственных условиях.

Данная задача решается новым штаммом Azotobacter chroococcum 7Б, который является сверхпродуцентом ПОБ. Штамм хранится в коллекции Института им. А.Н. Баха РАН. Штамм выделен из ризосферы пшеницы дерново-подзолистой почвы Московской области.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки
Крупные клетки овальной формы, грамотрицательные, размером 2,0-2,5 х 3,5-5,0 мкм с мелкозернистой цитоплазмой и компактным нуклеоидом. Молодые клетки имеют перитрихиальные жгутики, а также фимбрии, способны к движению. С возрастом культура становится полиморфной, клетки соединяются в цепочки, образуют нитчатые формы и сарциноподобные пакеты. В цитоплазме клеток появляется зернистость, связанная с накоплением гранул резервного соединения поли--оксибутирата. В этой стадии клетки агрегируются и в жидкой среде легко осаждаются, образуя плотный осадок. Стадия покоя характеризуется образованием цист и слизистых капсул. Колонии на агаризованной среде Эшби – полупрозрачные, беловатые, слизистые, со временем приобретают черный или темно-бурый цвет.

Физиолого-биохимические признаки
Отношение к источникам углерода – использует глюкозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маннит, крахмал, метанол, этанол, уксусную, лимонную и пропионовую кислоты.

Облигатный аэроб.

Отношение к источникам азота – фиксирует атмосферный азот, использует нитратный азот.

Желатину не разжижает, нитраты не восстанавливает.

Растет при температуре от +10 до +40^oС, оптимум роста в диапазоне 28-32^oС.

Диапазон рН, при котором возможен рост от 5,0 до 8,6 с оптимумом 7,2-7,6.

Штамм продуцирует до 95% ПОБ.

Оптимум биосинтеза ПОБ при 30^oС и рН 7,2.

Для получения ПОБ штамм Azotobacter chroococcum 7Б выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода и минеральные соли. Через двое суток выход биомассы составляет 6-12 г/л (сух.в.), а содержание ПОБ – 70-95%.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Штамм Azotobacter chroococcum 7Б поддерживают на питательной среде Эшби, содержащей, г/л: К₂НРO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; NaCl – 0,2; Na₂MoO₄2Н₂О – 0,006; СаСО₃ – 5,0; сахароза – 20; агар – 20. Культивирование осуществляют в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 28-30^oС в течение 48 часов. Состав питательной среды, г/л: MgSO₄7Н₂О – 0,4; FeSO₄7H₂O – 0,01; Na₂MoO₄2H₂O – 0,006; цитрат Na – 0,5; СаСl₂ – 0,1; K₂HPO₄3H₂O – 1,05; КН₂РO₄ – 0,2; сахароза – 40. В конце культивирования концентрация биомассы составляет 10 г сух. в. /л, а содержание ПОБ, определенного методом (4), составляет 86%.

Пример 2.

Способ осуществляется по примеру 1, но вместо сахара используют сахаросодержащие отходы пищевой промышленности, а именно мелассу – 50 г/л. В конце культивирования концентрация биомассы составляет 7 г сух. в./л, а содержание ПОБ, определенного методом (4), составляет 78%.

Источники информации
1. Патент РФ N2051967, кл. С 12 Р 1/04, 1992 г.

2. Патент РФ N2123048, кл. С 12 Р7/62, 1993 г.

3. Патент США N5096819, 1992.

4. Law J.H., Slepecky A. Assay of poly-

Формула изобретения

Штамм бактерий Azotobacter chroococcum 7Б – продуцент поли- -оксибутирата.