Патент на изобретение №2193598

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE KM 200 – ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИН – КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в производстве для получения вакцин и диагностических тест-систем. Задачей изобретения является получение штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава с высокой продукцией холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, не синтезирующего растворимую гемагглютинин/протеазу). Получен штамм Vibrio cholerae KM 200, не синтезирующий гемагглютинин/протеазу – продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии. Штамм получен методом отбора из природного токсигенного штамма М29, не синтезирующего растворимую гемагглютинин/протеазу. Штамм не синтезирует растворимую гемагглютинин/протеазу, обладает высоким уровнем продукции (14 мкг/мл) холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающим в 2-3 раза уровень продукции этого антигена у известных производственных штаммов, и может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген-анатоксин путем обогащения ее новыми протективными антигенами (ТСР), приготовления очищенных антигенов холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые могут быть использованы для разработки дешевых диагностических тест-систем с целью выявления природных штаммов холерного вибриона с продукцией СТ и ТСР, для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава, эффективно продуцирующего основные протективные антигены – холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и не синтезирующего в среду выращивания растворимую гемагглютинин/протеазу. Штамм может быть использован в производстве для создания высокоэффективных химических холерных вакцин нового поколения, для получения очищенных препаратов холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, предназначенных для дальнейшего изготовления диагностических тест-систем, а также для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Известен штамм классического биовара Vibrio cholerae 569(B) серовара Инаба, который используется в зарубежной и отечественной медицине в качестве производственного для получения вакцин (патент РФ 2076734, А 61 К 39/00, 35/76; Ketley J. et all. Infect. Immun., 1990, v.141, p.893-899).

Однако указанный штамм по данным GM₁ ELISA продуцирует лишь 8-10 мкг/мл холерного токсина (СТ) в среду выращивания и небольшое количество токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP), выявляемых лишь высокочувствительным методом иммуноблота, но не в реакции самоагглютинации. Данный штамм, как и большинство штаммов холерного вибриона, продуцирует растворимую гемагглютинин/протеазу с наличием токсических свойств, у которой и способностью к разрушению клеточных рецепторов для прикрепления холерных вибрионов связывают остаточную реактогенность и меньшую приживаемость вакцинных препаратов.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Vibrio cholerae 2414 серовара Огава (патент РФ N2169187 С12 N1/20), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин, В-субъединица которого является основным иммуногеном (по данным GM₁ ELISA 48-60 мкг/мл), синтезирует на поверхности клеток токсин-корегулируемые пили адгезии.

Однако указанный штамм содержит плазмиду, несущую гены устойчивости к антибиотикам, и для эффективной экспрессии протективных антигенов выращивание этого штамма необходимо производить на средах с добавлением тетрациклина или канамицина. Штамм V. cholerae 2414 продуцирует растворимую гемагглютинин/протеазу.

Для создания более эффективных химических вакцин необходимо освобождение от неиммуногенных, непротективных антигенов, одним из которых является растворимая гемагглютинин/протеаза, и использование штаммов холерного вибриона с высокой продукцией основных протективных антигенов – холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии
Задача изобретения – получение штамма холерного вибриона с высокой продукцией холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и отсутствием растворимой гемагглютинин/протеазы.

Штамм V. cholerae KM 200 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение этой среды. Штамм является ауксотрофным, несет мутацию в гене Pur^–.

Патогенные свойства – слабовирулентный, для кроликов-сосунков вирулентен в дозе 10⁷ м.т./мл.

Физиологические свойства
Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу С. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

– Высокий уровень продукции холерного токсина в среду выращивания (14 мкг/мл) и поверхностных токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающий в 2-3 раза уровень продукции этого белка у известных производственных штаммов.

– В хромосоме регистрируется наличие гена hap, но синтез продукта, кодируемого этим геном – гемагглютинин/протеазы, отсутствует.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Штамм Vibrio cholerae KM 200 серовара Огава классического биовара получен путем отбора клонов с высокой продукцией TCP из природного штамма V. cholerae M29, продуцирующего только холерный токсин и не синтезирующего растворимую гемагглютинин/протеазу. Штамм V. cholerae KM 200 серовара Огава депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ “Микроб” под номером КМ 200.

Пример 1, иллюстрирующий высокую продуктивность штамма
Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae KM 200 засевают на агар Хоттингена рН 7.6 и инкубируют 18 ч при 37^oС. Выросшую культуру рассевают на LB-агар для получения изолированных колоний и последующей проверки наличия токсин-корегулируемых пилей адгезии методом самоагглютинации культуры в бульоне [Chiang S. L. et al. Molecular Microbiology, 1995, v.17, p. 1133-1142] . Через 18 ч ресуспендируют одну выросшую колонию в 1 мл LB бульона и как инокулят вносят 7 мкл этой суспензии в 10 мл казаминового бульона, содержащего 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта, рН 7,6. Культуру выращивают 17-18 ч в шейкере при 30^oС. Степень агглютинации учитывают визуально. Штамм V. cholerae KM 200 вызывает видимую самоагглютинацию всех бактериальных клеток в бульоне, что указывает на синтез значительного количества находящихся на поверхности токсин-корегулируемых пилей адгезии. При сравнении со штаммом V. cholerae 569B, используемом при производстве химической холерной вакцины холероген-анатоксин, штамм V.cholerae KM200 превышает уровень синтеза белка TCP в 2-3 раза.

Бульон после самоагглютинации клеток используют для определения холерного токсина иммуноферментным методом [Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol. , 1983, v.17, р.596-601]. Пробы инкубируют в течение двух часов при 37^oС в лунках микроплат, блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37^oС. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных конъюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата – 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере рН 4,0 с 0,1% ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)] . Чувствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток. Штамм Vibrio cholerae KM 200 продуцирует 14 мкг/мл холерного токсина.

Пример 2, подтверждающий отсутствие растворимой гемагглютинин/протеазы
Для определения продукции растворимой гемагглютинин/протеазы культуру выращивают на агаре, содержащем 10% обезжиренного молока. Бактерии, синтезирующие указанный фермент, образуют зону лизиса вокруг колонии на фоне мутного агара. Штамм Vibrio cholerae KM 200 не синтезирует растворимую гемагглютинин/протеазу и не образует зон просветления вокруг макроколонии в отличие от положительного контроля, что подтверждает отсутствие растворимой гемагглютинин/протеазы.

Таким образом, штамм Vibrio cholerae KM 200 не синтезирует растворимую гемагглютинин/протеазу и обладает высоким уровнем продукции холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающим в 2-3 раза уровень продукции этих антигенов у известных производственных штаммов. Штамм может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген-анатоксин путем обогащения ее новыми протективными антигенами (TCP); приготовления очищенных антигенов холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые могут быть использованы для разработки дешевых диагностических тест-систем с целью выявления природных штаммов холерного вибриона с продукцией СТ и TCP; для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae KM 200 – продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.07.2003

Извещение опубликовано: 27.09.2004 БИ: 27/2004