Патент на изобретение №2192643

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К АНТИОКСИДАНТНОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, общей патологии и клинической патофизиологии. Разведенную стандартным буферным раствором 1:20-1:50 плазму крови пациента окисляют водным раствором CuSO₄5Н₂О с концентрацией CuSO₄ 10-20 мкмоль, через 4 и 24 ч инкубации при 37^oС регистрируют накопленное количество продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой в пересчете на 1 мл неразведенной плазмы, и при значениях соответственно выше 70 и 100 нмоль/мл констатируют высокий риск осложненного течения ИБС и необходимость дополнительной антиоксидантной терапии. Способ позволяет повысить эффективность терапии путем дифференцированного подхода к лечению больных с различными формами ИБС, выделения функциональных классов стенокардии в качестве одного из значимых факторов риска осложненного течения ИБС и учета его наличия и степени выраженности при избирательном назначении дополнительной антиоксидантной терапии. 10 ил., 8 табл.

Изобретение относится к медицине – области кардиологии, общей патологии, клинической патофизиологии.

Согласно современным представлениям о механизмах атерогенеза, все большее значение в развитии атеросклероза придается свободнорадикальной атерогенной модификации липопротеинов (ЛП) [1-3]. Показано, что все стадии атерогенеза связаны с окислительной модификацией ЛП низкой плотности (ЛПНП). В научных исследованиях последнего десятилетия определение уровня окислительной устойчивости выделенных ЛПНП уже заняло прочное место. Активно исследовалась окислительная устойчивость ЛПНП у больных ишемической болезнью сердца (ИБС). Она снижена по сравнению со здоровыми лицами [4-6]. Появились первые сообщения, в которых данный метод применялся для оценки антиатерогенной активности и клинической эффективности препаратов группы ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента и антиоксидантов [7,8].

Однако сложный и дорогой метод выделения отдельных фракций ЛП и их окисления in vitro не позволяет внедрить его в широкую клиническую практику. Кроме того, оценка готовности к окислению выделенных ЛПНП является односторонней и не учитывает окисляемость ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП), а также ЛП высокой плотности (ЛПВП). Известно, что окисленные ЛПВП уменьшают способность акцептировать холестерин из клеток, что способствует его накоплению в сосудах [9,10] . Окисление плазмы является более адекватным и в большей степени приближено к условиям in vivo, поскольку позволяет учитывать функциональные изменения как ЛПНП, так и ЛПВП и ЛПОНП.

В настоящее время клиницисты ограничиваются лишь количественной оценкой липидного спектра крови, не учитывая его качественных изменений. Количественная оценка составляющих липидного спектра крови важна, доказана и не вызывает сомнений. Однако в клинической практике группа больных ИБС крайне неоднородна, тяжесть течения заболевания и темпы прогрессирования атеросклероза у больных ИБС имеют большие различия и далеко не у всех больных липидный спектр крови имеет выраженную атерогенность. Особенность ИБС состоит и в том, что в основе патогенеза многих из ее клинических проявлений и осложнений лежит повышенная активация свободнорадикальных процессов (СРП). В связи с этим актуальна проблема дополнительной антиоксидантной терапии при ИБС. Отношение клиницистов к применению антиоксидантов неоднозначно. Несмотря на многочисленные исследования, в повседневную клиническую практику не внедрены методы оценки СРП; нет простых, не требующих дорогих реактивов и дорогостоящего оборудования тестов для их оценки, разработанных критериев для определения показаний к назначению антиоксидантной терапии и контроля ее эффективности. Объясняется это прежде всего незавершенностью проводимых в настоящее время первых многолетних многоцентровых исследований эффективности антиоксидантной терапии при ИБС, а также отсутствием избирательного подхода к назначению антиоксидантной терапии.

Цель предложенного способа – повышение эффективности терапии и профилактики ИБС и атеросклероза путем дифференцированного (с учетом активности СРП – окислительной устойчивости плазмы) подхода к оценке их степени тяжести, прогнозу и лечению, в том числе превентивному.

С этой целью мы изучили соотношение степени тяжести стенокардии, ее стабильности, роли факторов риска (сопутствующих артериальной гипертензии, сахарного диабета, нарушений липидного спектра крови) с окислительной устойчивостью плазмы крови.

Материалы и методы исследования
Обследовано 253 больных ИБС со стабильной стенокардией напряжения II-III функциональных классов (ФК). Из них 141 больной – с сопутствующей артериальной гипертензией (АГ), 23 больных – с сопутствующими АГ и компенсированным сахарным диабетом II типа (СД); у 14 больных III ФК за год наблюдения имели место госпитализации по поводу нестабильной стенокардии; уровень ХЛ-ЛПНП >130 мг/дл отмечался у 103 больных; уровень ТГ>200 мг/дл – у 51 больного; ХЛ-ЛПВП <35 мг/дл – у 56 больных. Аналогичные показатели изучались у 11 больных ИБС с нестабильной стенокардией, 30 больных с постинфарктным кардиосклерозом и без стенокардии напряжения (ПК) и 40 здоровых лиц (доноров).

Диагноз ИБС ставили на основании критериев ВОЗ. ФК стенокардии определяли по классификации Канадской ассоциации кардиологов. Больные получали терапию, включавшую нитраты, бета-адреноблокаторы, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента.

Окислительная устойчивость плазмы крови определялась по накоплению вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), реагирующих с тиобарбитуровой кислотой – ТБК-рtактивных продуктов (ТБК-РП). [Метод патентуется. Заявка направлена в ФИПС.]
Метод выполняется следующим образом:
Для исследований проводили забор крови утром натощак в интервале между 8.00 и 9.00 часами. 5,0 мл крови из локтевой вены вносили в пластиковый контейнер, содержащий 1 мл 1% раствора нитрата натрия (для определения продуктов ПОЛ) и в стеклянную пробирку без консерванта – 10 мл (для определения липидного спектра).

Плазму разводили стандартным буферным раствором, в состав которого входили 150 мМ NaCl и 10 мМ NaH₂PO₄ (на 400 мл H₂O 3,42 г NaCl, 0,48 г NaH₂PO₄, pH 7,2-7,4) в интервале 1:20-1:50. В качестве инициатора окисления использовали водный раствор CuSO₄ 5H₂O. С целью сохранения точного соотношения между плазмой и медью разведению подвергали заранее подготовленный раствор: к 2 мл плазмы добавляли 0,1 мл 20 мкмоль раствора CuSO₄. Свободнорадикальное окисление и аутоокисление проводили в стеклянных сосудах с завинчивающимися крышками емкостью 6 мл. Общий объем растворов во всех пробах соответствовал 2 мл. Инкубацию проб проводили при 37^oС (условия, близкие к физиологической температуре тела), периодически перемешивая. Через 4 ч и через 24 ч брали аликвоты для определения концентрации ТБК-РП, объем которых составлял 0,1-0,2 мл.

ТБК-активные продукты определяли, опираясь на методику [11]. К 1,5 мл 1% раствора фосфорной кислоты добавляли аликвоты проб. Для прекращения процесса свободнорадикального окисления добавляли 0.025 мл 510^-4 М спиртового раствора ионола, затем 0,5 мл 0,5 % раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Полученные растворы инкубировали в термостате при 100^oС в течение 45 мин. В охлажденные до комнатной температуры растворы добавляли 2 мл бутанола и интенсивно встряхивали в течение нескольких минут. После центрифугирования отделяли верхний слой и измеряли спектры поглощения бутанольной фракции. Спектры снимали в диапазоне 450-650 нм. Из спектров рассчитывали оптическую плотность в максимуме поглощения 532 нм при коэффициенте молярной экстинкции для продуктов реакции ТБК с альдегидными группами равным 1,5610⁵ М^-1см^-1. В качестве контрольного раствора использовали бутанол. Концентрацию ТБК-РП выражали в нмоль/ на1 мл неразведенной плазмы. Дополнительно с целью подтверждения результатов, рассчитанных на 1 мл плазмы, делался перерасчет на 1 мг белка плазмы [12] и на 1 мг общих липидов [13].

Для контроля антиоксидантной терапии рекомендуется дополнительная регистрация показаний концентрации ТБК-РП через 4 ч инкубации плазмы. Данный временной интервал объясняется разной скоростью накопления продуктов ПОЛ на начальных и последующих этапах окисления. При исследовании кинетики накопления продуктов ПОЛ выявлено, что на начальных этапах окисления скорость их образования мала из-за присутствия в крови эндогенных антиоксидантов. Резкий скачок в накоплении продуктов окисления происходит лишь после расходования эндогенных антиоксидантов. Регистрируя накопления продуктов окисления на начальном этапе, можно получить информацию о влиянии присутствующих антиоксидантов как эндогенных, так и дополнительно назначаемых экзогенных. Применительно к разработанным нами условиям окисления низкая скорость накопления продуктов окисления наблюдалась во временном промежутке – от 0 до 6 ч инкубации. Для большинства больных скачок в накоплении продуктов окисления отмечался после 4 ч инкубации. Поэтому для оценки влияния экзогенных антиоксидантов на окисление плазмы нами было выбрано время окисления – 4 ч.

Паралельно с измерением окислительной устойчивости плазмы проводилось определение общих липидов, общею холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), холестерина ЛП низкой плотности (ХС-ЛПНП) и холестерина ЛП высокой плотности (ХС-ЛПВП). Общие липиды выделяли путем экстрагирования плазмы хлороформметанольной смесью по Фолчу [13].Содержание ХС, ТГ и ХС-ЛПВП в сыворотке крови определяли на автоанализаторе “Centrifichem – 400” после ферментативного гидролиза с разным набором реагентов, готовых к использованию (фирма “Boechringer Mannheim GmbH”, Германия). Определение ХС-ЛПВП проводили после осаждения апо-В-содержащих ЛП фосфорно-вольфрамовой кислотой и MgCl₂ [14]. ХС-ЛПНП рассчитывали по формуле W.Friedewald и соавт. [15].

Математическая обработка данных производилась на персональном компьютере с использованием программы “Statistica”. Результаты представлены в виде средней арифметической и ее средней ошибки (Мт), различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования
1. Взаимосвязь между окислительной устойчивостью плазмы и степенью тяжести стенокардии у больных ИБС
Окисляемость плазмы у больных ИБС достоверно выше (т.е. окислительная устойчивость плазмы ниже), чем у здоровых лиц, причем степень окисляемости плазмы нарастает со степенью тяжести стенокардии (табл.1, фиг.1), что прослеживается при анализе уровней ТБК-РП в пересчете на 1 мл плазмы (наиболее простой и удобный вариант расчета).

У больных с ПК и без стенокардии напряжения концентрация ТБК-РП была достоверно выше показателя доноров па 15%. Далее уровень ТБК-РП последовательно увеличивался с нарастанием степени тяжести стенокардии. У больных II ФК концентрация ТБК-РП достоверно превышала показатель больных с ПК на 28% и на 46% была выше показателя группы доноров. При III ФК концентрация ТБК-РП оказалась достоверно выше, чем у доноров, на 77%. Достоверное различие с группой больных II ФК составило 21%. У больных со стенокардией III ФК и нестабильными состояниями в анамнезе и в группе больных с нестабильной стенокардией выявлена максимальная степень окисляемости плазмы или наименьшая окислительная устойчивость плазмы. У больных со стенокардией III ФК и нестабильными состояниями в анамнезе концентрация ТБК-РП достоверно превышала показатель группы больных III ФК на 18,5%. У больных с нестабильной стенокардией достоверное различие с группой больных III ФК составило 25%. При этом в рассматриваемых группах больных не обнаружено достоверных различий по показателям липидного спектра крови (табл.1, фиг.2). У больных с нестабильной стенокардией липидный спектр крови не определялся, поскольку при остром коронарном синдроме инициируются воспалительные реакции, которые существенно влияют на липидный обмен. Поэтому определение составляющих липидного спектра крови у больных с острым коронарным синдромом некорректно.

Кроме данных, полученных при расчете на 1 мл плазмы, использовался вариант пересчета концентрации ТБК-РП на 1 мг белка плазмы и на 1 мг липидов. Такие варианты пересчета провести целесообразно, поскольку белки плазмы могут влиять на процессы ПОЛ – некоторые фракции сами подвергаются окислению, другие выступают в роли антиоксидантов. Вместе с тем основным субстратом окисления в ЛП являются липиды. Поэтому логичной представляется попытка расчета образования ТБК-реактивных продуктов и на 1 мг липидов. Такой расчет позволяет уравнять качественные и количественные аспекты окисляемости ЛП плазмы. Выставляя в знаменателе общее количество липидов, можно получить показатель, иллюстрирующий накопление продуктов ПОЛ, образующихся из 1 мг липидов, что позволяло бы нивелировать различия в содержании ЛП плазмы у того или иною больного.

При анализе уровней ТБК-РП в пересчете на 1 мг белка плазмы и на 1 мг липидов у больных с различной степенью тяжести ИБС прослеживалась аналогичная данным пересчета на 1 мл плазмы взаимосвязь: концентрация ТБК-РП нарастала со степенью тяжести стенокардии (табл.1).

Взаимосвязь окисляемости плазмы с тяжестью течения стенокардии подтверждена результатами корреляционного анализа. Выявлена достоверная (р<0,000001) прямая связь между уровнем ТБК-РП и функциональным классом стенокардии (коэффициент корреляции Спирмена R=0,54 при расчете ТБК-РП/мл плазмы, R =0,45 при расчете ТБК-РП на 1 мг белка, R =0,56 при расчете ТБК-РП на 1 мг липидов). Это подтверждает достоверность выявленной тенденции: чем тяжелее течение стенокардии напряжения, тем выше уровень ТБК-РП в плазме. Поскольку продукты ПОЛ образуются в основном из полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав ЛП плазмы, представляется целесообразной проверка взаимосвязи этих показателей с данными липидного спектра крови. Выявлена прямая зависимость между показателем ТБК-РП/мл плазмы и уровнем ХС (R=0,296 при р=0,01), с уровнем ТГ (R=0,43 при р=0,0003) и с уровнем ХС-ЛПНП (R=0,27 при р= 0,02). Уровень ХС-ЛПВП достоверно с показателем ТБК-РП/мл плазмы не связан, что согласуется с данными работ по патогенезу атеросклероза, в которых обнаружена минимальная степень окисляемости ХС-ЛПВП: незначительное окисление этой фракции дает минимальное количество продуктов окисления.

При расчете ТБК-РП на 1 мг липидов подобные взаимосвязи оставались достоверными, хотя их сила несколько снижалась: достоверная прямая зависимость с ХС (R=0,28 при р=0,05), с ТГ (R=0,26 при р=0,05) и с ХС-ЛПНП (R=0,33 при р=0,01). При пересчете ТБК-РП на 1 мг белка сохранялась достоверная, но менее сильная зависимость с уровнем ХС (R=0,29 при р=0,01) и ТГ (R=0,39 при р= 0,001). Достоверной корреляции с уровнем ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП не выявлено, что свидетельствует о меньшей надежности и информативности такого варианта расчета. Следует особо отметить, что достоверной зависимости между показателями липидного спектра крови (ХС, ТГ, ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП) и степенью тяжести стенокардии (функциональным классом) выявлено не было.

Известно, что основными механизмами развития “нестабильности” стенокардии являются морфологические изменения атеросклеротической бляшки (разрывы), тромбоз на поверхности бляшки и развитие динамического компонента (спазм стенки артерии) в результате нарушения функции эндотелия. Вероятно, активация СРП, увеличивая окисляемость (тем самым уменьшая окислительную устойчивость плазмы крови), является не только причиной атерогенеза, но и оказывает влияние на стабильность атеросклеротической бляшки и функцию эндотелия, определяя стабильность и тяжесть течения стенокардии. Это может объяснять выявленную в нашем исследовании взаимосвязь между степенью тяжести стенокардии, ее стабильностью и уровнем окислительной устойчивости плазмы. Чем тяжелее течение стенокардии, тем выше окисляемость плазмы крови и ниже ее окислительная устойчивость.

Такой вывод позволяет рассматривать наличие стенокардии как фактора риска осложненного течения ИБС и риска прогрессирования атеросклероза. В качестве подтверждения этой гипотезы нами проведено исследование взаимосвязи между окислительной устойчивостью плазмы и степенью тяжести стенокардии у больных с различными факторами риска ИБС.

II. Взаимосвязь между окислительной устойчивостью плазмы и степенью тяжести стенокардии у больных с различными факторами риска ИБС
Были изучены особенности окисляемости плазмы при наличии следующих основных факторов риска ИБС: сопутствующих артериальной гипертензии (АГ); сахарного диабета II типа (СД); гиперхолестеринемии (ГХС – уровень ХС-ЛПНП >130 мг/дл): гипертриглицеридемии (ГТГ – уровень ТГ>200 мг/дл); ХС-ЛПВП <35 мг/дл,
Как видно из представленных (табл. 2, фиг.1) данных, у больных ИБС со стабильной стенокардией сопутствующие СД и АГ увеличивают окисляемость плазмы, тем самым уменьшая ее окислительную устойчивость. В группе больных ИБС без АГ концентрация ТБК-РП в пересчете на 1 мл плазмы достоверно превышала показатель доноров на 41%. У больных с сочетанием ИБС и АГ концентрация ТБК-РП в пересчете на 1 мл плазмы оказалась достоверно выше, чем у доноров, и на 63% и на 15% превышала показатель группы больных без АГ.

Еще более высокой оказалась окисляемость плазмы у больных с сочетанием ИБС, АГ и СД, где концентрация ТБК-РП в пересчете на 1 мл плазмы превышала аналогичный показатель доноров на 94%, и была достоверно выше, чем у больных ИБС без сопутствующих АГ и СД, на 37%. Достоверное различие с группой больных с АГ составило 19%.

Полученные результаты показывают, что сопутствующая АГ увеличивает окисляемость плазмы крови больных ИБС и особенно значительно это увеличение при сочетании АГ и СД. Вместе с тем при сопоставлении показателей ТБК-РП/мл плазмы у больных II ФК и III ФК выявлено достоверное различие как в группе больных без АГ -14%, так и в группах с АГ -17,6% и АГ с СД -17% (табл.3). При этом достоверные различия между данными II ФК и III ФК в уровне ХС, ТГ и ХС-ЛПНП отмечались только в группе больных ИБС с сопутствующей АГ(табл.2,3 и фиг.2).

Достоверное влияние ФК стенокардии на окисляемость плазмы выявлено и при сопоставлении показателей ТБК-РП/мл плазмы в группах больных с различными вариантами дислипидемии (табл. 4,5, фиг.3). У больных с ХС-ЛПНП >130 мг/дл уровень окисляемости плазмы при стенокардии III ФК был выше, чем у больных II ФК, на 21% (табл. 4). В группе больных с содержанием ХС-ЛПНП<130 мг/дл это различие между II ФК и III ФК составило 24,5%. При этом уровень ТГ при III ФК у больных из группы с ХС-ЛПНП>130 мг/дл был достоверно выше, чем у больных II ФК, на 23%. По остальным показателям липидного спектра крови различий между группами больных II ФК и III ФК не выявлено.

Аналогичные результаты получены и при анализе влияния ФК стенокардии на окисляемость плазмы в группах больных с ХС-ЛПВП>35 мг/дл и ХС-ЛПВП<35 мг/дл (табл. 5). У больных с уровнем ХС-ЛПВП>35мг/дл и ХС-ЛПВП<35 мг/дл различие между ПФК и ШФК составило 20 и 29% соответственно при сопоставимых показателях уровней ХС и ХС-ЛПНП и достоверном различие в уровне ТГ на 30%. В группах больных с уровнем ТГ>200 мг/дл и ТГ<200 мг/дл различие между II ФК и III ФК составило 23 и 18% соответственно, при сопоставимых показателях остальных составляющих липидного спектра крови.

Поскольку максимальная окисляемость, т.е. наименьшая окислительная устойчивость плазмы выявлена у больных с сочетанием ИБС, АГ и СД, можно предположить, что наблюдаемое в клинической практике быстрое прогрессирование ИБС у больных СД, возможно, определяется и высокой окислительной модификацией ЛП на фоне интенсификации IIОЛ, а также выраженного снижения антиоксидантного потенциала плазмы у этой категории больных [16]. Минимальную степень окислительной устойчивости плазмы у больных СД можно объяснить следующими причинами: а) атерогенностью липидного профиля, которая сочетается со снижением синтеза простациклина в сосудистой стенке и увеличением тромбогенного потенциала крови [17] ; б) глубокими и необратимыми изменениями ЛП в результате “двойной” модификации – гликозилирования и пероксидации [18,19]; в) гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью, которые увеличивают окислительную модификацию ЛПНП [20] . При этом у больных СД формируется совокупность (кластер) факторов риска, где число нарушений у одного больного достигает 6-8 видов и они взаимосвязаны друг с другом подобно “порочному кругу”, когда изменения одного из составляющих приводят к усугублению другого. Суммарный результат всей совокупности факторов риска приводит, по нашим данным, к увеличению окисляемости плазмы (т.е. увеличению уровня окислительной модификации всех ее составляющих, прежде всего всех фракций ЛП) и ускоренному развитию атеросклероза.

Подтверждением влияния совокупности нескольких факторов риска на окисляемость плазмы, течение и стабильность стенокардии является наличие трех и более факторов риска у больных с нестабильными состояниями в анамнезе. Прогноз этих больных наиболее неблагоприятен и они находятся в состоянии повышенного риска осложнений. Поэтому такие больные подлежат наиболее агрессивному специфическому лечебному и профилактическому воздействию препаратами с антиоксидантным действием.

Таким образом, выявлено достоверное влияние не только общепризнанных основных факторов риска ИБС на окислительную устойчивость плазмы, но и влияние на нее степени тяжести стенокардии. Применение метода определения окислительной устойчивости плазмы позволяет выявить достоверные различия между больными II ФК и III ФК в окисляемости плазмы при всех вариантах сочетания сопутствующих факторов риска, что позволяет выделить ФК стенокардии (степень ее тяжести) в качестве одного из значимых факторов риска осложненного течения ИБС и учитывать его наличие и степень выраженности при назначении дополнительной антиоксидантной терапии.

III. Еще одним аргументом в пользу эффективности практического применения предлагаемого метода являются данные о его высокой чувствительности при оценке эффективности дополнительной антиоксидантной терапии антиоксидантом коэнзимом Q₁₀ (убихиноном).

Через 2 месяца после включения в комплексную терапию стенокардии перорально 150 мг/сут CoQ10 (у 32 больных) или 90 мг/сут его солюбилизированной формы Кьюджель-форте (у 26 больных) концентрация ТБК-РП достоверно снижалась до уровня показателей группы доноров (табл.6, фиг.4).

У больных II ФК концентрация ТБК-РП в пересчете на 1 мл плазмы достоверно снизилась (относительно показателей после курса плацебо) на 21,5%,а у больных III ФК – на 27,3%. Одновременно отмечалось достоверное клиническое улучшение: у всех больных II ФК и у 82% больных III ФК. Изменения окислительной устойчивости плазмы сопровождались положительной динамикой клинических показателей: урежением приступов стенокардии – у больных II ФК с 2,50,87 до 1,1 0,6 приступов/сутки – в 2,27 раза; у больных III ФК – с 4,10,32 до 1,60,25 приступов/сутки, т.е. в 2,56 раза (р<0,01); уменьшением количества принимаемых таблеток нитроглицерина – у больных II ФК с 2,250,83 до 1,10,78 таблеток/сутки – в 1,6 раза; у больных III ФК – с 4,10,5 до 1,50,86, т.е. в 2,7 раза (р<0,05).

Достоверно увеличилась (по данным ВЭМ) толерантность к физической нагрузке: пороговая мощность нагрузки на 19,6% и 24,3%, общий объем выполненной нагрузки на 50,2 и 78,6% и общее время работы на 36,6 и 51,5% у больных II ФК и III ФК соответственно (табл.7, фиг.5-7).

Традиционная терапия не приводит к нормализации показателей окислительной устойчивости плазмы. Дополнительная антиоксидантная терапия повышает окислительную устойчивость плазмы, что сопровождается клиническим улучшением течения стенокардии. Взаимосвязь между окисляемостью плазмы и клиническими характеристиками коронарного синдрома, а также толерантностью к физической нагрузке свидетельствует о том, что не только окислительная модификация составляющих плазмы крови является причиной прогрессирования ИБС, но и сама степень тяжести стенокардии влияет на окисляемость плазмы и является риск-фактором прогрессирования ИБС и ее осложненного течения. Клинический пример:
Больной С. , 66 лет, был включен в исследование 10.12.96 г. Ранее (в январе 1996 г.) пациент проходил курс терапии в отделении ИБС ФТК ММА им. И. М. Сеченова с клиническим диагнозом: ИБС. Стенокардия напряжения III ФК.

Атеросклеротический и постинфарктный (1991г.) кардиосклероз. Атеросклероз аорты, коронарных и церебральных артерий. Больному была рекомендована терапия, включавшая 80 мг/сут нитросорбида, 120 мг/сут обзидана, аспирин 1/4 т/сут. На фоне принимаемой в последующие 10 месяцев терапии у больного сохранялись приступы стенокардии (до 4-5 приступов в сутки), по поводу которых он дополнительно принимал 4-5 т/сут нитроглицерина.

Объективно: состояние удовлетворительное. Больной повышенного питания, видимых отеков нет. При аускультации легких – дыхание везикулярное. Перкуторные границы сердца в пределах нормы. Тоны сердца приглушены, ритм сердечных сокращений правильный, ЧСС -76 уд/мин, АД – 140/80 мм рт. ст., пульсация на артериях голеней и стоп сохранена. Живот мягкий, при пальпации безболезненный во всех отделах. Печень – по краю реберной дуги.

Данные анализов крови и мочи в пределах нормы. ЭКГ: ритм синусовый с ЧСС 70 уд/мин, горизонтальное положение эл. оси сердца, зубец Q и изоэлектричный зубец Т в III и в AVF отведениях. Рентгенологическая картина органов грудной клетки – в пределах возрастной нормы. При мониторировании ЭКГ по Holter выявлены 2 эпизода депрессии сегмента ST на 0,25 мВ в отведении типа V5-V6 при ходьбе. Показатели ВЭМ: пороговая мощность нагрузки 100 Вт, общий объем выполненной работы 575 кДж, общее время работы 8 мин. Исследование окислительной устойчивости плазмы выявило: концентрация ТБК-РП через 24 ч инкубации с ионами меди 116,9 нмоль/мл плазмы; концентрация ТБК-РП через 4 ч инкубации 70,2 нмоль/мл плазмы.

После курса плацебо мониторирование ЭКГ по Holter выявило 1 эпизод депрессии сегмента ST на 0,25 мВ в отведении типа V5-V6 при ходьбе. Показатели ВЭМ: пороговая мощность нагрузки 75 Вт, общий объем выполненной нагрузки 300 кДж, общее время работы 5 мин. В остальном состояние больного было без существенной динамики; концентрация ТБК-РП через 24 ч инкубации с ионами меди 120 нмоль/мл плазмы; концентрация ТБК-РП через 4 ч инкубации 66,4 нмоль/мл плазмы.

После одного месяца дополнительной терапии СоQ10 состояние больного несколько улучшилось. Уменьшилось число приступов стенокардии до 3 приступов/сут и снизилось количество таблеток нитроглицерина до 3 т/сут. При мониторировании ЭКГ по Holter эпизоды депрессии сегмента ST выявлены не были. Показатели ВЭМ: пороговая мощность нагрузки -100 Вт, общий объем выполненной работы 675 кДж, общее время работы 9 мин. При этом уменьшились показатели концентрации ТБК-РП через 24 ч инкубации с ионами меди на 35% (88,7 нмоль/мл плазмы), а через 4 ч инкубации – на 40% (47,2 нмоль/мл плазмы).

Дальнейшая терапия CoQ10 в течение второго месяца привела к снижению числа приступов стенокардии до 2 приступов/сут и количества таблеток нитроглицерина до 2 т/сут. При мониторировании ЭКГ по Holter эпизоды депрессии сегмента ST не регистрировались. Увеличилась толерантность к физической нагрузке по данным ВЭМ: пороговая мощность нагрузки составила 125 Вт, общий объем выполненной работы вырос до 925 кДж, общее время работы – до 11 мин.

Уровень концентрации ТБК-РП через 24 ч инкубации достиг 81,3 нмоль/мл плазмы (на 47% ниже уровня ТБК-РП после курса плацебо). Концентрация ТБК-РП через 4 ч инкубации снизилась до 38,4 нмоль/мл плазмы, что на 73% ниже по сравнению с уровнем после курса плацебо.

Приведенный клинический пример демонстрирует высокую эффективность дополнительной антиоксидантной терапии у больных с высоким функциональным классом стенокардии и исходно высоким уровнем окисляемости плазмы, т.е. с низкой окислительной устойчивостью плазмы крови.

IV.Обследование больных в динамике позволяет рассматривать окислительную устойчивость плазмы в качестве прогностического фактора
Окислительная устойчивость плазмы и толерантность к физической нагрузке (по данным велоэргометрии) были оценены в динамике (через 3 года) у 21 больного. У 15 больных (7 больных II ФК и 8 больных III ФК) выявлено прогрессирование ИБС: у всех больных уменьшилась толерантность к физической нагрузке, более высокий ФК стенокардии выявлен у 5 больных II ФК, двое больных II ФК перенесли острый инфаркт миокарда и двое больных II ФК направлены на операцию аорто-коронарного шунтирования (АКШ). Уровень ТБК-РП плазмы недостоверно увеличился в данной группе больных со 120 до 126,5 нмоль/мл. При этом достоверно уменьшилась (по данным ВЭМ) толерантность к физической нагрузке: пороговая мощность нагрузки на 36%, общий объем выполненной нагрузки – на 50% и общее время работы – на 35% (табл.8, фиг.8).

Клинический пример:
Больной К. , 64 лет, был включен в исследование 5.08.97 г. Ранее (в январе 1997 г.) пациент проходил курс терапии в отделении ИБС ФТК ММА им. И.М. Сеченова с клиническим диагнозом: ИБС. Стенокардия напряжения II ФК. Атеросклеротический кардиосклероз. Атеросклероз аорты, коронарных и церебральных артерий. Больному была рекомендована терапия, включавшая 40 мг/сут изосорбида динитрата и 50 мг/сут атенолола. На фоне принимаемой терапии у больного сохранялись редкие приступы стенокардии (не более 1-2 приступов в сутки), по поводу которых он дополнительно нерегулярно принимал таблетки нитроглицерина.

Объективно: состояние удовлетворительное. Больной нормостеничного телосложения, видимых отеков нет. При аускультации легких – дыхание везикулярное. Перкуторные границы сердца в пределах нормы. Тоны сердца приглушены, ритм сердечных сокращений правильный, ЧСС 64 уд/мин, АД -120/80 мм рт. ст., пульсация на артериях голеней и стоп сохранена. Живот мягкий, при пальпации безболезненный во всех отделах. Печень – по краю реберной дуги.

Данные анализов крови и мочи в пределах нормы. ЭКГ: ритм синусовый с ЧСС 62 уд/мин, вертикальное положение эл. оси сердца. Рентгенологическая картина органов грудной клетки – в пределах возрастной нормы. При мониторировании ЭКГ по Holter эпизоды депрессии сегмента ST не зарегистрированы. Показатели ВЭМ: пороговая мощность нагрузки 125 Вт, общий объем выполненной работы 1175 кДж, общее время работы 15 мин. Исследование окислительной устойчивости плазмы выявило: концентрация ТБК-РП через 24 ч инкубации 100,3 нмоль/мл плазмы.

В период наблюдения с 1997 по 2000 г. у больного последовательно прогрессировала стенокардия напряжения со II ФК до IY ФК. Больной получал кардикет 120 мг/сут, атенолол 50мг/сут, триметазидин 60 мг/сут. От проведения коронароангиографии (КАГ) и интервенционного лечения ИБС до 2000 г. отказывался. С января 2000 г. приступы стенокардии участились, снизилась толерантность к физической нагрузке; в марте 2000 г. перенес острый инфаркт миокарда с последующей постинфарктной стенокардией. На фоне комплексной терапии с максимально увеличенными дозами препаратов у больного сохранялись приступы стенокардии (до 5-6 приступов в сутки), по поводу которых он дополнительно принимал до 6 таблеток нитроглицерина в сутки. Показатели ВЭМ: пороговая мощность нагрузки уменьшилась на 40% -75 Вт, общий объем выполненной работы уменьшился в 4 раза -300 кДж, общее время работы уменьшилось более чем в 2 раза -7 минут. Исследование окислительной устойчивости плазмы выявило увеличение уровня концентрации ТБК-РП через 24 ч инкубации со 100,3 до 143,6 нмоль/мл плазмы.

При проведении КАГ выявлены множественные стенозы коронарных артерий, изменения дистального русла. Больной направлен на операцию АКШ.

Приведенный клинический пример подтверждает предположение о высоком риске прогрессирования и осложненного течения ИБС у больных II ФК с повышенными значениями показателя окисляемости плазмы, т.е. у больных с низкой окислительной устойчивостью плазмы.

V. Определение границ показателя окислительной устойчивости плазмы, при которых высок риск осложненного течения ИБС и необходима дополнительная антиоксидантная терапия
Для определения границ нормы и патологии показателя окисляемости плазмы был применен непараметрический метод математического анализа – дисперсионный анализ (Kruskal – Wallis ANOVA test для сравнения достоверности различий в нескольких группах). При помощи этого метода мы проследили распределение показателей внутри групп здоровых лиц и больных II ФК. Данные концентрации ТБК-РП представлены как медиана разница 25 и 75 процентиля, в которые укладывается 50% исследованной выборки (нижняя граница -25 процентиль, верхняя -75 процентиль).

Такой подход позволяет определить границы нормы для здоровых и больных стенокардией, дает возможность выделить больных, нуждающихся в антиоксидантной терапии. Например, выбрав в данном исследовании тех лиц, чьи показатели на фигурах располагаются выше медианы группы больных II ФК, равной 100 нмоль/мл плазмы, что соответствует верхней границе максимального отклонения в группе здоровых (фиг.9,10). При обследовании больных в динамике, выявлено прогрессирование и осложненное течение ИБС у больных с уровнем ТБК-РП > или = 100 нмоль/мл плазмы (табл.8). Для контроля эффективности антиоксидантной терапии можно использовать границы значений (нижняя граница -25 процентиль, верхняя -75 процентиль) здоровых лиц. Показатель нормы для здоровых лиц, рассчитанный таким образом, будет составлять: через 4 ч инкубации с ионами меди – 30-45 нмоль/мл, а через 24 ч инкубации с ионами меди – 65-85 нмоль/мл. Значения выше 70 нмоль/мл (для 4 ч инкубации) и 100 нмоль/мл (для 24 ч инкубации) следует рассматривать как показатели высокого риска осложненного течения ИБС у обследуемых больных с необходимостью назначения дополнительной антиоксидантной терапии.

Научное и практическое значение изобретения:
1. Результаты проведенных исследований позволяют выделить патогенетическую взаимосвязь между свободнорадикальной атерогенной модификацией плазмы крови и вариантами клинического течения стенокардии у больных ИБС. Возможно, следует выделять в симптомокомплексе больных ИБС “свободнорадикальный синдром” и с учетом степени его выраженности прогнозировать нестабильность коронарного синдрома, проводить превентивную дополнительную антиоксидантную терапию, направленную на стабилизацию течения стенокардии и атеросклероза у данной категории больных.

2. Метод определения окислительной устойчивости плазмы крови позволяет выделить ФК стенокардии (степень ее тяжести) в качестве одного из значимых факторов риска осложненного течения ИБС и учитывать его наличие и степень выраженности при назначении дополнительной антиоксидантной терапии.

3. Показатель окислительной устойчивости плазмы может служить дополнительным критерием для оценки степени тяжести, стабильности, эффективности терапии атеросклероза и различных форм ИБС и, возможно, рассматриваться в качестве прогностического фактора.

4. Способ оценки тяжести течения ИБС с определением окислительной устойчивости плазмы может оказаться чувствительным и доступным тестом для дифференцированного подхода к ведению больных ИБС, предупреждению нестабильных состояний, рестенозов после оперативного лечения ИБС, при лечении как конкретных больных, так и при проведении профилактических программ, направленных на предупреждение атеросклероза, ИБС и их осложнений.

Литература
1. Климов А. Н. , Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. Санкт-Петербург, 1995, 297.

2. Berliner J. A., Heinnecke J. W. The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis. Free Radic. Biol. Med. 1996;20:707-727.

3. Steinbrecher S., Zheng H., Lougheed M. Role of oxidatevely modified LDL in atherosclerosis. Free. Radic. Biol. Med. 1990; 9:155-168.

4.Азизова О.А., Вахрушева Т.В., Дремина Е.С. Динамика образования первичных и вторичных продуктов ПОЛ при медьзависимом окислении липопротеинов низкой плотности сыворотки крови больных ИБС. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1996;7:32-36.

5. Derijke Y.B., Verwey H. F., Vogelezang С. G. M., Vandervelde E. A. et al. Enhanced susceptibility of low-density lipoproteins to oxidation in coronary artery bypass patients with progression of atherosclerosis, dim. Chem. Acta. 1995; 243:137-149.

6. Miwa К. , Miyagi Y., Fugita M. Susceptibility of plasma low-density lipoprotein to Cu²⁺ ion-induced peroxidation in patients with variant angina. J. Am. Col. Cardiol. 1995;26:632-638.

7. Fuller C. J. , Chadalia M., Garg A., Grundy S. M., Jialal I.. RRR-alpha-tocopheryl acetate supplementation at pharmacologyc doses decreases low-density lipoprotein oxidative susceptibility but not protein glycation in patients with diabetes mellitus. Am. J. Clin.Nutr. 1997;63:753-759.

8.Рагино Ю.И., Латынцева Л.Д., Иванова М.В., Никитин Ю.П. Резистентность к окислению липопротеинов низкой плотности у больных артериальной гипертонией при приеме валсартана и эналаприла. Клин. Фарм. и Терапия. 1999;8:32-34.

9. Musanti R. , Chirelli G. Interaction of oxidized HDLs with J774-A1 macrophages causes intracellular accumulation of unesterified cholesterol. Arterioscl. Thromb. 1993;13:1334-1345.

10. Nogano Y., Arai H., Kit A. High density lipoprotein loses its effect to stimulate efflux of cholesterol from foam cells after oxidative modification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991;88:6457-6461.

12. Locory O.H., Nira J. Rosebrough, A. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-275.

13.Кейтс M. Техника липидологии. Москва 1975; 376.

14. Burstein M., Sholnick H.R., Morfin R. Rapid method for isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J. Lipid. Res. 1970,11:583-595.

15.Friedewald W. Т., Levy R.I., Fredrickson D.S. Estimation of the concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge. Clin.Chem. 1972,18:499-502.

16. Santini S. A. , Marra G., Giardina В., Cotroneo P. et al. Defective plasma antioxidant defenses and enhanced susceptibility to lipid peroxidation in uncomplicated IDDM. Diabetes. 1997;46:1853-1858.

17.Crawford M.A. Background to Essential Fatty Acids and their prostanoid derivatives British. Medical Bulletin. 1983; 39:210-213.

18. Bowie A, Owens D, Collins P, Johnson A, Tomkin G. Glycosylated low density lipoprotein is more sensitive to oxidation: implications for the diabetic patient? Atherosclerosis. 1993; 102 (1):63-67,
19. Lyons Т. J. Glycation and oxidation/ A role in the patogenesis of atherosclerosis. Am. J. Cardiol. 1993;71:B26-B31.

20.Rifici V.A., Schneider S.H., Khachadurian A.K. Stimulation of low-density lipoproteins oxidation by insulin and insulin like growth factor. Atherosclerosis. 1994; 107:99-108.

Формула изобретения

Способ оценки тяжести течения заболевания и определения показаний для антиоксидантной терапии у больных ишемической болезнью сердца, заключающийся в том, что разведенную стандартным буферным раствором 1: 20-1: 50 плазму крови пациента окисляют водным раствором СuSO₄5Н₂О с концентрацией СuSO₄ 10-20 мкмоль, через 4 и 24 ч инкубации при 37^oС регистрируют накопленное количество продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой в пересчете на 1 мл неразведенной плазмы и при значениях соответственно выше 70 нмоль/мл и 100 нмоль/мл констатируют высокий риск осложненного течения ИБС и необходимость дополнительной антиоксидантной терапии.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.04.2006

Извещение опубликовано: 7.03.2007 БИ: 09/2007