Патент на изобретение №2192463
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ 138 СЕРОГРУППЫ 0139 – ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО 0139 АНТИГЕНА
(57) Реферат: Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению штамма, и может быть использовано для получения холерной диагностической 0139-антисыворотки, а также вакцинных препаратов. Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ 138 серогруппы 0139 обладает высокой антигенностью, о чем свидетельствует высокий титр реакции агглютинации как капсульных (1:1600), так и бескапсульных (1:3200) штаммов серогруппы 0139 с антисывороткой, полученной против штамма КМ 138. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению штамма, и может быть использовано в производстве для получения холерной диагностической 0139-антисыворотки. Известен также спонтанный бескапсульный штамм Vibrio cholerae P16064 сар– 0139-серогруппы KM137, который получен при выращивании капсульного штамма P16064 в LB бульоне при 37oС в течение 18 ч и последующем рассеве полученной культуры до изолированных колоний на агаре Мартена. Образование спонтанных бескапсульных клонов в этих условиях происходит с частотой 3,0  10-3. Сыворотка, полученная против штамма КМ137, агглютинирует капсульные штаммы в титре 1:800, а бескапсульные – 1:600.
Для получения холерной высокочувствительной диагностической 0139-антисыворотки необходим штамм с высоким выходом продукции 0139-антигена.
Задачей изобретения является получение стабильного бескапсульного штамма Vibrio cholerae 0139-серогруппы с высокой продукцией 0139-антигена.
Сущность изобретения заключается в том, что заявляемый полученный штамм удовлетворяет поставленным требованиям.
Определяющим отличием предлагаемого штамма является высокий уровень антигенности.
Культурально-морфологические свойства штаммаПодвижные, слегка изогнутые палочки. На твердых питательных средах растет в виде круглых с ровными краями прозрачных голубоватых колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение среды. Хорошо растет при рН среды 7,6, при температуре 37oС. Прототроф. Ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. Не лизирует эритроциты барана. Резистентен к диагностическим холерным фагам С и Эльтор. Резистентен к антибиотикам стрептомицину (100 мкг/мл), канамицину (50 мкг/мл). Вирулентен, холерогенный эффект наблюдается при заражающей дозе 105 м.т. на модели крольчат сосунков, в хромосоме присутствуют vсt гены. Штамм агглютинируется 0139-специфической холерной сывороткой. Не агглютинируется диагностическими холерными сыворотками О, Инаба, Огава, RO. Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии. Получение штамма-продуцента 0139-антигена описано ниже. Предлагаемый штамм получен методом инсерционного мутагенеза с использованием транспозона Тn51S50L::рhоА (TnphoA), кодирующего резистентность к канамицину, в качестве мутационного агента. В клетки исходного капсульного штамма Р16064 конъюгацией вводят плазмиду – “самоубийцу” pRT733, определяющую резистентность к ампицилину (АрR), а также за счет присутствия в ней транспозона TnphoA устойчивость к канамицину (КmRR AmS, поскольку такой фенотип должны иметь клоны, несущие внедренный в хромосому транспозон TnphoA (KmR), но утратившие плазмидный репликон с маркером АрR. Инсерция транспозона могла произойти в различные сайты хромосомы штамма Р16064, поэтому у полученных трансконъюгантов была проверена продукция 0139-антигена и капсулы. Продукция капсулы четко коррелирует с морфологией колоний. Капсульный штамм Р16064 при рассеве на плотных питательных средах формирует мутные непрозрачные колонии (Р16064-0). Среди полученных трансконъюгантов обнаружен один прототрофный штамм, формирующий прозрачные, типичные для холеры колонии (Р16064 chr:TnphoA-T). Отсутствие продукции капсулы у данного трансконъюганта подтверждено электронной микроскопией. Таким образом получен штамм Vibrio cholerae P16064 chr::TnphoA, который депонирован Государственной коллекцией патогенных бактерий научно-исследовательского противочумного института “Микроб”, регистрационный номер КМ138. Пример, иллюстрирующий уровень антигенности по 0139-антигену штамма КМ138. oС с продолжительным встряхиванием культуру прогревают при 100oС в течение 2 часов. После чего культуру центрифугируют при 3000 оборотов в мин в течение 15 мин. Полученный осадок дважды отмывают физиологическим раствором, а затем суспендируют в физиологическом растворе до двойного исходного объема. Полученные взвеси являются антигенами. Данными антигенами внутривенно иммунизируют кроликов с 4-дневным интервалом (0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 4,0). Через 7 дней после последней иммунизации кроликов обескровливают, получают сыворотку и изучают ее титр. Оказалось, что наибольшей антигенностью характеризуются клетки штамма КМ138, о чем свидетельствует более высокий титр реакции агглютинации как капсульных, так и бескапсульных штаммов Р16064 с антисывороткой, полученной против штамма КМ138. Антисыворотка против штамма КМ138 агглютинирует клетки капсульного штамма Р16064 в разведении 1: 1600, а клетки бескапсульного штамма КМ137 – в разведении 1:3200. Титры антисыворотки, полученной к бескапсульному штамму КМ137, следующие: в реакции с капсульным штаммом Р16064 – 1:800, а с бескапсульным штаммом KM137 – 1:1600. Таким образом, бескапсульный штамм КМ138 из-за более высокой антигенности (превышающей в 2 раза антигенность штамма КМ137) может быть использован при получения холерных диагностических 0139-антисывороток с высоким титром. Формула изобретения
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 27.04.2003
Номер и год публикации бюллетеня: 18-2004
Извещение опубликовано: 27.06.2004
|
||||||||||||||||||||||||||
