Патент на изобретение №2191825

(54) ШТАММ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ “БИО-92” ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН, ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ДРУГИХ БИОПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при изготовлении вакцин для профилактики инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ), диагностических и других биопрепаратов. Штамм “БИО-92” легко поддерживается и культивируется в культуре клеток перепелов, эмбрионов кур и эмбрионов SPF – кур. Штамм обладает высокой иммуногенной активностью.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к ветеринарной вирусологии, и может быть использовано при производстве вакцин против инфекционной бурсальной болезни птиц, диагностических и других биологических препаратов.

Цель изобретения – получение нового, аттенуированного, адаптированного к культуре клеток перепелиных эмбрионов штамма вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ, болезни Гамборо), легко культивируемого в культуре клеток эмбрионов перепелов и культуре клеток эмбрионов кур, а также в эмбрионах кур. Апатогенный штамм “Био-92” вируса инфекционной бурсальной болезни был изолирован из тканей фабрициевой сумки цыплят с признаками острой формы инфекционной бурсальной болезни, адаптирован к культуре клеток перепелиных эмбрионов, селектирован по степени репродукции в культуральных системах, безвредности для суточных цыплят, иммуногенной активности (приживляемости в организме цыплят разного возраста). Штамм депонирован во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123002, Москва, Звенигородское шоссе, 5, Всероссийский Государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов – ВГНКИ) в качестве производственного штамма для изготовления вакцин против инфекционной бурсальной болезни птиц – регистрационный номер 115 штамм “Био-92 115-ДЕП”. Штамм поддерживается и титруется в культуре фибробластов перепелиных эмбрионов, культуре фибробластов куриных эмбрионов и/или в SPF-куриных эмбрионах. По серологическим характеристикам штамм “Био-92” вируса ИББ отнесен к бирна-вирусам птиц 1-го серотипа. По результатам нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Vp2 штамм относится к генетической группе “мягких” вакцинных штаммов.

Морфологически штамм “Био-92” соответствует параметрам бирна-вирусов птиц, безвреден для 1-25-суточных цыплят в двукратной и десятикратной дозах при оральном и парентеральном введении. Вирус штамма “Био-92”, введенный двукратно оральным или другим методом цыплятам разного возраста, индуцирует образование поствакцинальных антител через 14-28 суток – обладает высокой антигенной активностью. Штамм обладает высокой иммуногенной активностью – эффективность иммунизации при контрольном заражении вирулентным штаммом вируса ИББ интраназальным методом в дозе 100 цыплячьих инфекционных доз на голову (ЦИД/гол) составила более 90%.

Штамм “Био-92 115-ДЕП” вируса ИББ птиц (Bursitis infectiosa gallinae) относится к семейству Birnaviridae, роду Avibimavirus, серотипу 1, обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид Т 13, внешняя оболочка отсутствует. Штамм “Био-92 115-ДЕП” является РНК-содержащим вирусом с мол. массой РНК 2,1610⁶ Да. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (А и В). Вирион содержит 5 видов белков (Vp₁-Vp₅). Липиды отсутствуют.

По своим антигенным свойствам штамм “Био-92” относится к сероварианту 1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:2-1:32, в ИфА – 1: 400-1: 6000, в РН 1:128-1:2048 и более, при гипериммунизации – в РДП – до 2048, в ИфА – до 1:10000, в РН – до 1:2048 и более. При определении антигенного соответствия вакционного штамма “Био-92” с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области Vp-2 полевых изолятов как с таковой штамма “Био-92”, так и образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена Vp2, кодирующую основной конформационный эпитоп. Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакционного штамма “Био-92”.

Штамм “Био-92” проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность, а также высокую степень гомологии (96%) при сравнении с многочисленной группой изолятов, выделенных на территории РФ. Большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, в большей или меньшей степени антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм “РонМерье” (Франция), “Интервет” (Голландия), “Солвей Дюфар” (США), “Сафит” (Израиль), тогда как заявляемый штамм “Био-92” более близок к вышеуказанным полевым изолятам и, соответственно, более эффективно защищает вакцинированную птицу от “полевых” штаммов, циркулирующих в хозяйствах РФ.

Штамм “Био-92” предназначен для использования в качестве производственного для приготовления вакцин против ИББ птиц, диагностических и других биологических препаратов. Этот штамм репродуцируется в культуре клеток эмбрионов кур (КЭК), а также в культуре клеток эмбрионов перепелов (КЭП). В течение 96-132 часов инкубирования вирус накапливается в титре до 7,75-8,25 lg ТЦД₅₀/см³ при титровании в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Штамм “Био-92” является стабильным и безвредным.

Штамм “Био-92 115-ДЕП” проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в VP₂. Аминокислотные изменения в VP₂ определяют антигенную вариабельность. Сегмент А нуклеиновой кислоты содержит 2 частично перекрывающие открытые рамки для считывания малого VP₅ и большого полипротеинового предшественника белков VP₂ и VP₃. Сегмент В кодирует VP₁.

Масса вириона – 5510⁶ Д. Коэффициент седиментации – 460 S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33-1,34 г/см³ в градиенте CsCl.

Штамм “Био-92” устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, -облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства:
– иммуногенная активность – 90%;
– реактогенность отсутствует – безвреден для суточных цыплят в 2-10-кратной и более дозе;
– патогенность отсутствует – безвреден для суточных цыплят в 2-10-кратной и более дозе;
– вирулентность отсутствует – безвреден для суточных цыплят в 2-10-кратной и более дозе;
– онкогенность отсутствует;
– контагиозность отсутствует;
– стабильность аттенуации отмечена при проведении 15 последовательных пассажей на чувствительных цыплятах.

По сравнению с прототипом вирус-вакцина на основе аттенуированного штамма “Био-92 115-ДЕП” обладает более высокой иммуногенной активностью, является безвредной и способна преодолевать материнские антитела против ИББ птиц даже в суточном возрасте независимо от их титра.

Пример 1. Штамм поддерживается в культуре клеток перепелиных эмбринов путем последовательного пассирования в течение 15-19 пассажей. Последующий пассаж проводится после выраженного проявления цитопатического действия вируса через 120-132 часа культивирования. Аналогичным способом штамм поддерживается в культуре клеток куриных эмбрионов.

Пример 2. Для титрования вируса ИББ штамма “Био-92” используют культуру клеток перепелиных или куриных эмбрионов. Клеточную взвесь готовят путем трипсинизации (0,25%-ный раствор трипсина) ткани эмбриона в колбе с магнитной мешалкой. Культуру выращивают общепринятым способом в течение 24 часов. После формирования сплошного монослоя ростовую среду из культуральной емкости сливают, культуры отмывают от ростовой среды и заражают разными разведениями вируса. На каждое разведение (начиная с 10^-3 до 10^-9) используют не менее 4-х культуральных флаконов. Титр определяют после 2-3-кратной микроскопии зараженных культур на 4-6 сутки инкубирования с целью определения максимального разведения и количества флаконов, в которых проявляется цитопатическое действие вируса штамма “Био-92”. Используют общепринятые методы математической обработки результатов.

Пример 3. Вакцинный штамм “Био-92” вируса ИББ безвреден для цыплят любого возраста, в том числе для суточных, как при парентеральном или оральном, так и при других методах применения в двукратной или десятикратной и более дозах.

Пример 4. Штамм “Био-92”, введенный двукратно орально или другим методом цыплятам разного возраста, индуцирует образование поствакцинальных антител через 14-28 суток, обладает высокой антигенной активностью. Штамм обладает высокой иммуногенной активностью – эффективность иммунизации при контрольном заражении вирулентным штаммом вируса ИББ интраназальным методом в дозе 100 ЦИД/гол составила более 90%.

Формула изобретения

Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц “БИО-92”, депонированный под номером 115-ДЕП в ВГНКИ, используемый для приготовления вакцин, диагностических и других биопрепаратов.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.03.2004

Извещение опубликовано: 20.04.2005 БИ: 11/2005