Патент на изобретение №2191782

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

(57) Реферат:

Описывается способ получения химически модифицированной гиалуроновой кислоты, заключающийся в активации карбоксильных групп гиалуроновой кислоты 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидом и реакции образующейся O-ацилмочевины с водной суспензией 5-аминосалициловой кислоты при начальной температуре реакции 40^oС в течение 2-4 ч с последующей очисткой полимерного амида диализом, оксидом алюминия и осаждением этиловым спиртом. В зависимости от времени проведения реакции получают гиалуроновую кислоту с различной степенью замещения карбоксильных групп. Пленки из модифицированного полисахарида можно использовать как биоматериал в абдоминальной хирургии для защиты анастомозов при резекциях кишечника, для пропитки шовного материала (хирургических нитей), искусственных протезов и т.п. 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине.

Гиалуроновая кислота (ГК), природный полисахарид из класса гликозаминогликанов, состоит из повторяющихся единиц D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина (см. формулу I в конце описания).

ГК находится в межклеточном матриксе всех высших животных и может быть выделена различными методами из соединительной ткани или получена с помощью продуцирующих ГК специальных бактерий.

ГК является полианионным полимером с молекулярной массой от нескольких сотен Да до 10 миллионов Да (средняя М=1-2 млн Да). Эти характеристики обусловливают уникальные физико-химические свойства полисахарида и его производных.

Биологические функции ГК можно разделить на “пассивные” и “активные”. Как инертный материал ГК участвует в гомеостазе тканей, в стерическом регулировании (осмос) проникновения каких-либо субстанций, выполняет функцию “смазки”, улучшающей подвижность суставов, и т. д.

“Активные” функции ГК заключаются в специфическом связывании с белками в межклеточном матриксе и на поверхности клетки; такое взаимодействие играет важную роль в образовании хрящевой ткани, в процессах клеточной пролиферации, в морфогенезе и эмбриональном развитии животных, а также в механизмах воспаления и возникновения рака.

ГК находит применение как адьювант в офтальмологии (препараты Ргоvisk, Healon), как матрица в так называемых “системах доставки” лекарственных средств, а также в хирургии для предупреждения послеоперационой адгезии тканей (спаечной болезни). Установлено, что ГК усиливает абсорбцию лекарств и некоторых протеинов через слизистые оболочки, а эффективность применения некоторых лекарств, например нестероидных противовоспалительных средств или циклоспорина, заметно улучшается в сочетании с ГК. В комбинации с ГК некоторые лекарственные субстанции образуют в эпидермисе как бы депо этих лекарств и высвобождаются из композиции медленнее, чем в отсутствие ГК.

Функционализация ГК или синтез биоконъюгатов с ГК имеет ряд преимуществ по сравнению с простыми смесями ГК-лекарство. Во-первых, химическая модификация позволяет изменить физико-химические свойства ГК под соответствующее применение и может значительно воздействовать на клиренс производных ГК. Во-вторых, биоконъюгаты ГК могут обладать большей растворимостью по сравнению с самими лекарствами. В-третьих, гидрогели ГК-лекарство могут применяться для локального контролируемого высвобождения субстанций в органах-мишенях. И, наконец, высокая аффинность рецепторов ГК в метастазирущих клетках может быть использована для направленной доставки противоопухолевых агентов в клетки-мишени.

Как известно, полимерные материалы широко используются для изготовления разнообразных медицинских изделий. Синтетические полимеры оптимизируются по механическим свойствам и часто не обладают достаточной биосовместимостью; напротив, биополимеры обычно не имеют необходимых механических характеристик. Смешивая синтетические полимеры с биологическими макромолекулами, например, ГК, можно получить композиты с требуемыми физико-химическими и биологическими свойствами.

Композиции ГК с полиакриловой кислотой приготовляют растворением обоих полимеров в воде в различных соотношениях, затем формируют пленки, которые лиофилизируют и подвергают реакции сшивки с помощью термической обработки при 130^o

₃СООН при рН 3,2, добавляли в раствор ГК. После коагуляции, промывания и высушивания осадка получали тонкую пленку, которую затем подвергали сшивке в растворе диальдегида.

Известны полимерные комплексы ГК и ее натриевых, калиевых или литиевых солей с природными полисахаридами и белками: хитином, альгиновой кислотой, фибрином, коллагеном и т.д., которые могут применяться в качестве покрытия различных медицинских изделий, например искусственных сосудистых протезов [ЕР 0544259 A1].

С использованием метода карбодиимидной активации синтезировано много биоконъюгатов ГК с лекарственными средствами. Большинство проводимых опытов основано на реакции КДИ-активированной карбоксильной функции D-глюкуроновой кислоты в ГК с соединением, содержащим аминогруппы.

Запатентованы биоматериалы на основе ГК, карбоксиметилцеллюлозы, альгиновой кислоты и др., одна часть карбоксильных групп которых используется для сшивки макромолекул, другая часть этерифицируется моно- или полиспиртами или взаимодействует с аминами, включая различные лекарственные вещества. Активирующим агентом карбоксигрупп в этом случае является 2-хлор-1-метилпиридинийиодид, а реакции со спиртами или аминами проводят при нагревании или воздействии радиации [ЕР 341745] . Материалы, синтезированные описанным способом, могут предназначаться для изготовления фармацевтических композиций, различных медицинских изделий, например хирургических нитей, пленок для регенерации эпидермиса, для лечения кожных заболеваний и т.п.

Реакцию так называемой ионной сшивки ГК проводят с помощью солей трехвалентного железа: получают гидрогель ГК с 0,5% FeCl₃

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является получение ГК, модифицированной по карбоксильным группам -аминокапроновой кислотой. -Аминокапроновая кислота является известным кровоостанавливающим средством. Присоединение -аминокапроновой кислоты осуществляется посредством активации кислотных групп ГК с помощью КДИ или N-гидроксисукцинимида. В этом случае получаются производные ГК, растворимые в органических растворителях. Вторично активируя с помощью КДИ уже карбоксильные группы -аминокапроновой кислоты, можно проводить дальнейшую модификацию ГК, например, дауномицином [ЕР 0506976 B1, 1992].

Авторами предлагается химически модифицированная ГК, полученная из ГК и 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) методом карбодиимидной активации карбоксильных групп полисахарида. Модифицированную ГК с различной степенью замещения карбоксильных групп (от 30 до 50 мол.%) получают следующим образом.

Пример 1. 1 г ГК растворяют в 50 мл воды с рН 4,7-4,8, добавляют 0,476 г водорастворимого 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида. Затем этот раствор при интенсивном перемешивании приливают к 0,382 г 5-АСК, суспендированной в 40 мл воды, с рН 4,7-4,8 при 40^oС. После добавления всего раствора температуру реакционной смеси снижают до комнатной и реакцию проводят в течение 1 часа. По завершении реакции с целью удаления низкомолекулярных исходных соединений раствор модифицированной ГК диализуют против подкисленной дистиллированной воды в течение 24 ч, затем продукт очищают на колонке с оксидом алюминия. После очистки на колонке рН водного раствора полимера доводят НСl до 3-4 и осаждают 4-кратным объемом этилового спирта, осадок центрифугируют, промывают спиртом, затем эфиром и высушивают в вакууме. Таким образом получают модифицированную ГК с кислотными группами в составе 5-АСК со степенью замещения карбоксильных групп полимера 30 мол.% (см. схему в конце описания). Количество 5-АСК, ковалентно связанной с полимером, определяют фотометрически при 304 нм после гидролиза точной навески продукта в 20%-ной соляной кислоте. Сразу после осаждения модифицированная ГК (в виде кислоты) хорошо растворяется в воде, после высушивания ее растворимость значительно уменьшается.

Если после очистки ГК окисью алюминия полимер осаждать спиртом из раствора с рН 8,0-8,5, можно получать натриевую соль модифицированной ГК (см. формулу II в конце описания). Натриевая соль модифицированной ГК является хорошо растворимым в воде полимером, из которого можно изготовлять лекарственные пленки различного назначения.

Пример 2. Реакцию ГК с 5-АСК проводят аналогично примеру 1. Время реакции – 4 ч. При этом количество 5-АСК, ковалентно связанной с полимером, составляет 50 мол.%.

В зависимости от времени проведения реакции можно получать продукты с различной степенью замещения карбоксильных групп ГК.

Как все салицилаты, модифицированная ГК способна образовывать окрашенные комплексы с FеСl₃, которые являются малорастворимыми в воде соединениями. Обрабатывая поверхность пленок из модифицированной ГК раствором FеСl₃, можно изготовлять нерастворимые в воде материалы.

Изучение противовоспалительных свойств проводили на белых крысах массой 180-200 г. Опытную группу крыс вначале лечили с помощью внутрибрюшинного введения раствора модифицированной ГК в дозе 60 мг/кг. Через 30 мин в апоневроз задней лапки крыс вводили 0,1 мл 3%-ного формалина, вследствие чего развивался отек лапки. Контрольная группа крыс оставалась нелеченной. Через 3 ч сравнивали лапку с отеком с лапкой без отека путем измерения количества воды, вытесняемой из сосуда при погружении лапок до нижнего сустава костей голени. Установлено достоверное уменьшение отека лапок леченых крыс по сравнению с контрольной группой животных (Р<0,05).

Пленки, изготовленные из модифицированной ГК (натриевой соли), были испытаны в качестве эксплантатов для защиты анастомозов у беспородных собак после выполнения резекций тонкого кишечника.

Опыты проводили на 21 беспородной собаке весом 10-15 кг. Под тиопенталовым наркозом проводили резекции тонкой кишки с наложением двухрядного анастомоза “конец в конец”. У 9 собак анастомоз был защищен аппликацией эксплантата без дополнительной фиксации, т.е. только за счет хорошей адгезии пленки к тканям кишки. Животных выводили из опыта на 3-ий, 7-ой и 30-ый день. Проведен анализ гистологического материала, окрашенного гематоксилинэозином, выполнены гистохимические реакции на гликозаминогликаны по Хейлу и на гликоген (ШИК-реакция). Гистохимические реакции оценивали по 4-балльной шкале: инактивная, слабая, умеренная и высокая активности.

Сравнительные результаты морфологических исследований приведены в таблице.

Как следует из приведенных результатов экспериментов, применение пленочных эксплантатов на основе гиалуроновой кислоты способствует активной регенерации тканей, предупреждает воспалительный и спаечный процессы в области межкишечного анастомоза.

Модифицированную гиалуроновую кислоту также можно применять для пропитки шовного материала (хирургических нитей), искусственных сосудистых протезов и т.п.

Формула изобретения

Способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты, заключающийся в карбодиимидной активации карбоксильных групп гиалуроновой кислоты и последующей реакции образующейся О-ацилмочевины с соединением, содержащим аминогруппу, отличающийся тем, что гиалуроновая кислота сначала взаимодействует с 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидом с образованием О-ацилмочевины, а затем О-ацилмочевина реагирует с водной суспензией 5-аминосалициловой кислоты при начальной температуре реакции 40^oС в течение 2-4 ч, после чего продукт диализуют против подкисленной дистиллированной воды, затем очищают на колонке с оксидом алюминия, осаждают этиловым спиртом и высушивают под вакуумом.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.09.2003

Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004