Патент на изобретение №2191603
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
(57) Реферат: Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения сибиреязвенных сывороток, позволяющих дифференцировать Bacillus anthracis от близкородственных микроорганизмов. Бесклеточный культуральный фильтрат B. anthracis СТИ концентрируют на ультрафильтрах HLP-10 и РМ-10 в 150 раз, до содержания белка в фильтрате 8-10 мг/мл, затем выделение антигенных компонентов осуществляют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300, уравновешенном 0,3 М раствором NaCl с 0,025 М трис-HCL буфером рН 8,4, с регистрацией выхода фракций при  = 280 нм, для получения высокоспецифичной сыворотки используют антиген с м.м. более 150 кДа, что соответствует первому пику выхода фракций. Полученная по способу сыворотка к антигену реагирует в реакции иммунодиффузии в геле только с антигенами различных вариантов возбудителя сибирской язвы, что позволяет идентифицировать возбудитель сибирской язвы от близкородственных по антигенным свойствам бацилл. 2 ил.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения сывороток, позволяющих дифференцировать Bacillus anthracis от близкородственных микроорганизмов. Известная антигенная схожесть B.anthracis с близкородственными микроорганизмами, такими как B.cereus, B.megaterium, В.thuringiensis, B.mycoides B. subtilis, затрудняет получение видоспецифических препаратов для диагностики сибирской язвы. В настоящее время пригодные для идентификации диагностические препараты получают в большинстве случаев путем многократной адсорбции сибиреязвенных сывороток близкородственными микроорганизмами (авторское свидетельство (19) SU (II) 1637325 A1. Р.Н. Низамов, Д.Ш. Ахмеров, Р.Х. Шиганова и И.Н. Садыков. Способ получения флуоресцирующих антител для диагностики сибирской язвы; Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций. Докторская диссертация, Ставрополь, 2000), что усложняет и удорожает разработку диагностических препаратов. Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является “Identification of Bacillus anthracis by polyclonal antibodies against extracted vegetative cell antigens” A.P. Phillips, I.W. Ezzel; I. of Applied Bacteriology, 1989, 66, 419-432. Для получения сывороток эти авторы использовали легко экстрагируемые из клеток B. anthracis белковые антигены. Однако сыворотки против этих антигенов не позволяли в полной мере дифференцировать штаммы возбудителей сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов даже с использованием моноклональных антител. Недостатком метода выделения этих антигенов является использование детергентов, прогревания препарата, что усложняет и удорожает получение антигена и не гарантирует нативности выделенных антигенов. Целью изобретения является получение сыворотки с использованием нативного сибиреязвенного антигена, позволяющей дифференцировать возбудителя сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов. Поставленная цель достигается тем, что антиген выделяют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300 (Upsala, Sweden) культурального фильтрата B. anthracis СТИ-I, который выращивают в синтетической питательной среде при 37oС, с шуттелированием. Клетки B. anthracis отделяют фильтрованием, компоненты стерильного культурального фильтрата концентрируют на ультрафильтрах НLР-10 и PM-10 (фирма Amicon, Sweden) в 150 раз, до содержания белка 8-10 мг/мл. Для получения сывороток кроликов иммунизируют антигеном с м.м. более 150 кДа (1 пик), который элюируется в свободном объеме с регистрацией при =280 нм. Животным внутрикожно вдоль позвоночника и внутримышечно в паховые области вводят возрастающие дозы антигена от 250 мкг до 750 мкг с гидроокисью алюминия.
Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с культуральным фильтратом (разведение 1: 4). Животных обескровливают при титре сыворотки 1:8-1:16.
Специфичность сывороток проверяют в реакции иммунодиффузии в геле с выросшими в течение 18 часов на питательном агаре возбудителями сибирской язвы и близкородственными микроорганизмами.
О принадлежности микроорганизма к возбудителю сибирской язвы судят по зоне преципитата, образовавшейся между выросшей культурой и лункой с сывороткой.
Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.
Пример 1. Получение бесклеточного культурального фильтрата.
B.anthracis СТИ-I выращивали в 500 мл колбах с 200 мл жидкой питательной среды в течение 21 часа, с шуттелированием 72 об/мин. Стерилизовали культуральную среду после выращивания в ней B. anthracis фильтрованием через фильтр ДР-045 (фирма “Amicon”). Проверяли на стерильность посевом в жидкие и на плотные питательные среды, затем концентрировали на установке ДС-2 с волоконным фильтратом HLP-10 и РМ-10 в 150 раз. Содержание белка в концентрированном культуральном фильтрате обычно составляло 6-10 мг/мл белка.
Пример 2. Выделение гельхроматографией антигенных компонентов B. anthracis СТИ.
Фракционирование компонентов культурального фильтрата В.anthraсis СТИ осуществляли в колонке 2х70 см со сверхтонким сефакрилом S-300, который уравновешивали 0,3 М раствором NаСl с 0,025 М трис-НСl буфером рН 8,4, при скорости элюции 25 мл/ч. Выход фракций регистрировали при 280 нм с помощью спектрофотометра “Uvicord SII (ЛКБ, Sweden). Выход фракций регистрировали в виде четырех отдельных пиков (фиг.1). Фракции концентрировали на РМ-10 до исходного объема использованного культурального фильтрата.
Пример 3. Получение сывороток к антигенам отдельных фракций.
Кроликов породы “Шиншилла” весом 2,5-3 кг иммунизировали возрастающими дозами фракций – от 250 до 750 мкг белка на животное, которые вводили с гидроокистью алюминия (Alu Gel фирма “Serwa”) через 2 недели, внутрикожно вдоль позвоночника и внутримышечно в обе паховые области.
Активность сывороток проверяли в реакции иммунодиффузии в геле с культуральным фильтратом. Животных обескровливали при титре сывороток 1:8-1:16.
Пример 4. Определение специфичности сывороток, полученных к отдельным антигенам В. anthracis СТИ.
Штаммы В. anthracis и близкородственных микроорганизмов засевали в виде газонов на питательный агар. После 18-часовой инкубации при 37oС против газонов выросших культур в агаре пробивали лунки (диаметром 6 мм), в которые вносили исследуемые сыворотки, чашки оставляли при комнатной температуре. Через 18-24 часа между выросшими культурами и лунками с сывороткой образовывались зоны преципитатов.
После образования преципитатов культуры обеззараживали парами формалина, смывали, чашки фотографировали (фиг. 2).
На фиг. 2 (а, б, в) в центре – сыворотки соответственно к фракциям 1, 2 и коммерческий сибиреязвенный глобулин (С7 К946, Тбилисский НИИ вакцин, и сывороток).
Штаммы: 1 – B. anthracis CTU (tox+, cap–)2 – B. anthracis 81/1 (tox+, cap–) 3 – B. anthracis 81/1 (tox–, cap–) 4 – B. anthracis 81/1 (tox+, cap+) 5 – B. anthracis 619/42 (tох+, сар+) 6 – B. anthracis 591/2 (tox+, cap+) 7 – B. anthracis Davies (tox–, cap+) 8 – B. cereus NP 569 9 – B. cereus АТСС 6464 10 – B. megaterium 216 11 – B. thuringiensis V. thuringiensis “Pasteur” 12 – B. thuringiensis V. tburingiensis “Galleria” 13 – B. subtilis 407 14 – B. subtilis BD 430 Из фиг. 2 видно, что сыворотка к антигену фракции 1 культурального сибиреязвенного фильтрата образует зону преципитата только с антигенами В. anthracis как содержащими плазмиды вирулентности (px01, px02), так и с антигенами бесплазмидных сибиреязвенных штаммов. В отличие от сыворотки к фракции 1 сыворотки к фракции 2 (а также к фракциям 3 и 4 – данные не приведены) и коммерческий сибиреязвенный глобулин образуют зоны преципитатов как с антигенами сибиреязвенных штаммов, так и с антигенами близкородственных микроорганизмов. Таким образом, сыворотка к высокомолекулярному антигенному комплексу B. anthracis в отличие от сывороток к другим внеклеточным антигенам B. anthracis и коммерческого сибиреязвенного глобулина является высокоспецифичной и может быть использована для идентификации штаммов B. anthracis как содержащих плазмиды вирулентности, так и бесплазмидных штаммов. Формула изобретения
= 280 нм при разделении бесклеточного культурального фильтрата B.anthracis СТИ, сконцентрированного на ультрафильтрах HLP 10 и РМ 10 до содержания белка 8-10 мг/мл.
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 30.06.2003
Извещение опубликовано: 20.11.2004 БИ: 32/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
