Патент на изобретение №2190847

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОРОНАРНОЙ РЕПЕРФУЗИИ У БОЛЬНЫХ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к методам оценки эффективности тромболитической терапии у больных острым инфарктом миокарда. Способ определения коронарной реперфузии при тромболитической терапии основан на исследовании структурно-функциональных характеристик нейтрофилов до и после введения тромболитических средств, при этом коронарную реперфузию определяют по динамике содержания в нейтрофилах кальция 0,013-0,034 мкмоль/10⁶ кл, диеновых коньюгатов 13,2-27,3 нмоль/10⁶ кл., миелопероксидазы 0,03-0,024 у. е. /10⁶ кл. Способ обеспечивает высокую точность диагностики. 11 табл., 2 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к методам оценки эффективности тромболитической терапии у больных острым инфарктом миокарда.

Известно, что коронарная реперфузия при инфаркте миокарда сопровождается активированием нейтрофилов и их массивной миграцией в миокард [1,2,3 ].

Общепринятые методы оценки коронарной реперфузии при тромболитической терапии включают инвазивное. либо изотопное исследование коронарного русла, изучение динамики сегмента ST на ЭКГ и определение динамики активности кардиоспецифических ферментов – MB КФК, миоглобина.

Использовать динамику структурно-функциональных характеристик нейтрофилов для оценки эффективности тромболитической терапии у больных инфарктом миокарда ранее не предлагалось. Наиболее близким техническим решением к заявляемому является исследование R.E. Engler [2]. в котором показано, что при ишемии и реперфузии клетки белой крови (нейтрофилы) способны накапливаться в тканях сердца и вызывать их повреждение через механизм кислородзависимого метаболизма.

Целью настоящего изобретения является определение структурно-функциональных характеристик нейтрофилов, пригодных для диагностики коронарной реперфузии при тромболитической терапии у больных острым инфарктом миокарда и оценка чувствительности и специфичности предлагаемых тестов.

Поставленная цель достигается исследованием структурно-функциональных характеристик нейтрофилов до и после тромболитической терапии у больных острым инфарктом миокарда и выделением параметров, ассоциирующихся с коронарной реперфузией, при этом оценка реперфузии проводится по динамике сегмента ST на ЭКГ и динамике активности фермента MB КФК. Согласно изобретению на основе исследования и по динамике содержания в клетках крови (нейтрофилах) диеновых конъюгатов 13.2-27.3 нмоль/10⁶кл. кальция 0.013 – 0.034 мкмоль/10⁶кл. , миелопероксидазы 0.03-0.024 у.е./10⁶кл. диагностируют реперфузию у больных инфарктом миокарда.

Использовать структурно-функциональные характеристики нейтрофилов для оценки эффективности тромболитической терапии ранее не предлагалось, в связи с чем заявляемое решение соответствует критерию “новизна”. Признаки, реперфузии при проведении тромболитической терапии у больных острым инфарктом миокарда, не выявлены в других работах при изучении данного раздела медицинской диагностики и, следовательно, обеспечивают заявленному решению соответствие критерию” изобретательный уровень”.

В исследование включали больных с крупноочаговым острым инфарктом миокарда, диагностированным по наличию хотя бы двух из следующих признаков: ангинозный приступ длительностью более 20 минут, критерные для инфаркта миокарда изменения и динамика ЭКГ, повышение более двух норм хотя бы двух из трех миокардиальных ферментов (ACT, КФК, MB КФК). В исследование не включали больных с сопутствующими заболеваниями, при которых происходят нарушения состояния нейтрофилов (заболевания крови, почек, печени, легких, сахарный диабет, язвенная болезнь), а также при наличии состояний, являющихся противопоказанием к проведению тромболитической терапии: инфаркт миокарда с депрессией сегмента ST, либо изолированным изменением зубцов Т на ЭКГ, срок заболевания более 12 ч, острое, либо перенесенное менее 6 месяцев назад нарушение мозгового кровообращения, оперативные вмешательства в течение предшествующих 3 недель, расслаивающая аневризма аорты, устойчивая гипертензия (АД систолическое более 180 мм рт. ст.), прием непрямых антикоагулянтов, недавно проведенная лазерная терапия сетчатки, применение стрептокиназы в течение предшествующего двухлетнего периода. Всем больным при поступлении в клинику записывали ЭКГ в 12-ти стандартных отведениях, исследовали анализ крови на “лейкоформулу”, содержание в крови трансаминаз, креатинфосфокиназы и MB КФК. До госпитализации всем пациентам была проведена внутривенная инфузия нитроглицерина и подкожное введение гепарина в дозе 10000 ЕД.

Введение тромболитических средств осуществляли в блоке интенсивной терапии. Применяли стрептокиназу (кабикиназу, Pharmacia and Upjohn, США). Длительность внутривенной инфузии составляла 30 мин. До введения кабикиназы и через 1.5 ч после окончания инфузии записывали ЭКГ в 12-ти стандартных отведениях, забирали кровь для исследования активности MB КФК, структурно-функциональных характеристик нейтрофилов.

Оценку эффективности тромболитической терапии проводили согласно общепринятым неинвазивным критериям: устранению боли, появлению нарушений ритма деятельности сердца, динамике сегмента ST на ЭКГ, активности MB КФК [4,5,6]. При этом реперфузию окклюзированного коронарного сосуда считали наступившей и тромболитическую терапию эффективной при наличии следующих ЭКГ и биохимических критериев:
1. Снижение сегмента ST в наиболее информативном отведении ЭКГ на 50% и более от исходного через 90 минут после тромболитической терапии.

2. Повышение активности изоэнзима MB КФК в течение указанного срока в 2.2 и более раз при нижнем, 2.5 и более раз -при переднем инфаркте миокарда.

В работе использовали следующие методы оценки состояния нейтрофилов: содержание миелопероксидазы [7], адгезия [8], тест восстановления нитросинего тетразолия [9]. Определяли содержание в клетках калия методом пламенной фотометрии и кальция с помощью наборов фирмы “Лахема”, диеновых конъюгатов [10], малонового диальдегида [11], шиффовых оснований [12]. Исследовали активность фосфолипазы А2 [13], каталазы [14], супероксиддисмутазы [15] в нейтрофилах. Проводили количественное определение содержания в клетках фракций фосфолипидов: лизофосфатидилхолина, фосфатидилсерина, сфингомиелина. фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина [16]. Методические аспекты этих исследований представлены нами ранее [17].

Рассчитывали средние величины исследованных тестов, ошибку средней величины. Различия между тестами в группах больных с неэффективным тромболизисом и восстановленной коронарной перфузией определяли на основании критерия t Стьюдента. Значимыми считали различия при Р<0.05.

В исследование было включено 50 больных мужского пола в возрасте от 35 до 65 лет. Средний возраст пациентов составил (55.82.2) лет. Передний инфаркт миокарда был у 32, нижний – у 18 пациентов, крупноочаговый – у 20, трансмуральный – у 25, повторный – у 5 больных. Средняя длительность заболевания – (8.41.57 лет). Срок от начала болей в грудной клетке до введения кабикиназы – (3,20.46) ч. Максимальная активность КФК составила (77.013.2) у. е. , ACT- (0.890.09) ммоль/л. Нарушения ритма деятельности сердца в виде фибрилляции желудочков зарегистрированы у 2 (4,0%). желудочковой тахикардии – у 1 (2.0%) пациента.

Динамика активности MB КФК в группе больных инфарктом миокарда с восстановленной коронарной перфузией и без таковой при введении кабикиназы представлена в таблице 1.

Больных с неэффективным тромболизисом согласно представленным критериям было 32, с восстановленной коронарной реперфузией – 18 человек.

Динамика структурно-функциональных характеристик нейтрофилов при тромболитической терапии у пациентов с неэффективным тромболизисом представлена в таблицах 2-4.

Из таблиц 2 и 3 видно, что при отсутствии коронарной реперфузии после введения кабикиназы достоверных изменений в содержании продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, шиффовых оснований), в активности ферментов антиоксидантной защиты (каталазы и супероксиддисмутазы), фосфолипазы А2, в уровне клеточных электролитов калия и кальция, в составе отдельных фракций фосфолипидов в нейтрофилах не выявлено. Из таблицы 4 следует, что изменений в функциональной активности нейтрофилов (содержании миелопероксидазы, способности клеток к адгезии и восстановлению нитросинего тетразолия) не наблюдается при отсутствии коронарной реперфузии после введения кабикиназы.

Динамика структурно-функционального состояния нейтрофилов у больных с эффективным тромболизисом представлена в таблицах 5-7.

Из таблиц 5, 6 видно, что у пациентов с эффективным тромболизисом в период реперфузии в сравнении с показателями состояния нейтрофилов в фазу ишемии происходило увеличение содержания в клетках диеновых конъюгатов, кальция, повышение активности супероксиддисмутазы. Результаты, представленные в таблице 7, свидетельствуют, что при восстановлении коронарной перфузии после тромболитической терапии значимо снижается содержание в нейтрофилах миелопероксидазы – теста, отражающего цитотоксический потенциал гранулоцитов. Динамика показателей нейтрофилов, ассоциирующихся с коронарной реперфузией при тромболитической терапии у больних острым инфарктом миокарда, представлена в таблице 8.

Итак, результаты исследования свидетельствуют, что динамика структурно-функциональных характеристик нейтрофилов при тромболитической терапии соотносится с состоянием коронарного русла. У пациентов с неэффективным тромболизисом структурно-функциональное состояние нейтрофилов не меняется. При восстановлении коронарного кровотока в результате тромболитической терапии выявлены изменения в состоянии нейтрофилов, которые проявлялись повышением содержания диеновых конъюгатов, кальция, активности супероксиддисмутазы и снижением миелопероксидазы. В реперфузионном периоде инфаркта миокарда в сравнении с ишемическим выраженность нарушений структурно-функционального состояния нейтрофилов была выше. Нарастание содержания в клетках диеновых конъюгатов в реперфузионном периоде является отражением интенсификации процессов перекисного окисления липидов. Увеличение активности супероксиддисмутазы, очевидно, имеет компенсаторный характер и направлено на нейтрализацию продуктов перекисного окисления липидов. Снижение содержания миелопероксидазы в нейтрофилах расценено нами как повышение функциональной активности клеток. Известно, что нейтрофилы способны не только к поглощению и перевариванию чужеродных частиц внутри клетки, но и к экзоцитозу энзимов во внеклеточную среду [18]. По данным некоторых авторов имеется обратная зависимость между содержанием миелопероксидазы в нейтрофилах и в плазме крови [19]. Поэтому снижение уровня миелопероксидазы в нейтрофилах в период реперфузии расценено нами как проявление повышенной функциональной активности клеток, отражение их “истраченного” функционального резерва. Согласно представленным данным реперфузия после тромболитической терапии ассоциируется с повышенной функциональной активностью нейтрофилов.

Следовательно, повышение функциональной активности нейтрофилов в ближайшие часы после введения тромболитических средств свидетельствует о “восстановлении” коронарного кровотока. Значимое увеличение уровня в нейтрофилах диеновых конъюгатов, кальция, снижение содержания миелопероксидазы могут служить диагностическими критериями коронарной реперфузии.

Предсказующая точность тестов, предлагаемых для диагностики коронарной реперфузии при проведении тромболитической терапии, составляет: для диеновых конъюгатов – 74,0%, кальция – 88,0%, миелопероксидазы – 74,0%, чувствительность тестов – для диеновых конъюгатов – 77,7%, кальция – 41,4%, миелопероксидазы – 85,7%, а их специфичность – 66,6%, 66,6%, 50,0% для диеновых конъюгатов, кальция и миелопероксидазы соответственно.

Больной Тепляков С.М., 30 лет, поступил в отделение неотложной кардиологии клиники 17 декабря 1996 г. через 2 часа от начала постоянных интенсивных давящих болей за грудиной. Заболел впервые. На догоспитальном этапе проводилась терапия наркотическими анальгетиками и гепарином в дозе 10000 ЕД в/в.

При поступлении состояние больного тяжелое. Сохраняется неинтенсивная давящая боль за грудиной. Астенического телосложения. Кожные покровы чистые, физиологической окраски, цианоз губ. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Верхушечный толчок в Y межреберье, по срединно-ключичной линии. Левая граница сердца соответствует верхушечному толчку, правая – по правому краю грудины. Тоны сердца приглушены, ритм правильный ЧСС 100 в мин, АД 120/80 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. Край печени у реберной дуги безболезнен. Периферических отеков нет.

Больному проведена запись ЭКГ в 12-ти стандартных отведениях на аппарате “Cardimax FX-326 (Fukuda, Япония)”.

На ЭКГ зарегистрированы признаки острейшей фазы Q-типа переднебокового инфаркта миокарда: зубец Q в отведениях V1-V3, подъем сегмента ST в V1-V5 (максимальный подъем сегмента ST в отведении V2 составил 8 мм над изолинией), депрессия сегмента ST в отведениях III и avF до 1 мм, отрицательные зубцы Т в отведениях I, avL.

Осуществлен забор крови из вены для исследования активности миокардиальных ферментов: АСТ, КФК, МВ КФК и показателей состояния нейтрофилов.

Активность АСТ, КФК исследовали общепринятыми методами, экстинцию определяли на автоанализаторе ФП-905.

Активность АСТ и КФК у пациента составила 0,33 и 36 ЕД соответственно. Активность МВ КФК определяли иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы Human (Германия). Активность МВ КФК у пациента составила 30,8 МЕ/л.

Кровь для исследования состояния нейтрофилов забирали в пластиковые пробирки с гепарином из расчета 25 ЕД/мл. Проводили исследование тестов, характеризующих структурно-функциональное состояние нейтрофилов.

Введение кабикиназы осуществляли в блоке интенсивной терапии с учетом противопоказаний, разработанных рабочей группой по лечению инфаркта миокарда Европейского общества кардиологов [20].

В связи с наличием признаков острейшей фазы Q-типа инфаркта миокарда и отсутствием противопоказаний к проведению тромболитической терапии нашему пациенту проведена внутривенная инфузия кабикиназы (Pharmacia and Upjohn, США) в дозе 1,5 млн. ЕД. Длительность инфузии составила 30 минут. Ангинозные боли в грудной клетке полностью купированы. Нарушений ритма сердца не зарегистрировано.

Через 1,5 часа после введения кабикиназы повторно была записана ЭКГ в 12-ти стандартных отведениях, забрана кровь из вены для исследования активности МВ КФК, состояния нейтрофилов.

На повторно снятой ЭКГ у нашего пациента отмечалось отчетливое снижение сегмента ST в отведениях V1-V4, здесь же формирование отрицательной фазы зубца Т, возвращение сегмента ST к изолинии в отведениях III, avF. В наиболее показательном отведении V2-снижение сегмента ST составило 7 мм (с 8 до 1 мм), т. е. более, чем на 50% от исходного. Активность МВ КФК повысилась до 80,7 МЕ/л, т.е. в 2,6 раза от исходного уровня. Согласно общепринятым критериям [4,5,6] тромболитическая терапия считается эффективной при устранении болей в грудной клетке, снижении сегмента ST в наиболее информативном отведении ЭКГ на 50% и более от исходного уровня, повышении активности изоэнзима МВ КФК в 2,5 и более раз от исходного уровня (при переднем инфаркте миокарда).

У обследуемого пациента после введения кабикиназы наблюдали перекращение болей в грудной клетке, снижение сегмента ST в отведении V2 на ЭКГ на 87% и повышение активности МВ КФК в 2,6 раза, что соответствует критериям эффективной тромболитической терапии. Динамика сегмента ST на ЭКГ у обследуемого пациента представлена на фиг. 1, 2.

После повторного забора крови исследовали состояние нейтрофилов у обследуемого пациента.

Нейтрофилы выделяли из цельной венозной гепаринизированной крови центрифугироваием (центрифуга ОПН-3) в двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 и 1,092 г/см² по методу [21]. Забирали клетки нижней интерфазы. Содержание нейтрофилов среди клеток нижнего кольца составляло около 90%, а их жизнеспособность, оцененная в тесте с трипановым синим – 97-98%. Нейтрофилы трижды отмывали в среде Хенкса. Количество клеток во взвеси доводили до 2 млн. в 1 мл, их подсчет осуществляли на автоматическом счетчике частиц “Пиксель” (Венгрия).

Исследование структурно-функционального состояния нейтрофилов включало определение:
– содержания фракций фосфолипидов: лизофосфатидилхолина, фосфатидилсерина, сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина
– содержания продуктов перекисного окисления липидов: диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, шиффовых оснований
– активности антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы, каталазы
– активности фосфолипазы А2
– содержания калия методом пламенной фотометрии и общего кальция с помощью наборов реактивов фирмы “Лахема”
– способности клеток к восстановлению нитросинего тетразолия
– содержания миелопероксидазы
– адгезивных свойств клеток
Динамика тестов, характеризующих состояние нейтрофилов у нашего пациента при введении кабикиназы, представлена в таблицах 9, 10, 11.

Из таблиц 9-11 следует, что у обследуемого пациента после введения кабикиназы наблюдалось существенное нарастание содержания в нейтрофилах диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, клеточного кальция и снижение уровня миелопероксдазы.

Таким образом, у нашего пациента согласно динамике сегмента ST на ЭКГ, активности фермента МВ КФК тромболитическая терапия была эффективной, а реперфузия сопровождалась накоплением содержания в нейтрофилах диеновых конъюгатов (с 15,2 до 26,3 нМ/10⁶ кл.), малонового диальдегида (с 3,8 до 6,4 нМ/10⁶ кл.), кальция (с 0,016 до 0,029 мкм/10⁶ кл.), снижением уровня миелопероксидазы (с 0,030 до 0,026 у.е./10⁶ кл.). Динамика представленных тестов отражает повышение функциональной активности нейтрофилов в период реперфузии при тромболитической терапии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АД – артериальное давление
АСТ – аспартатаминовая трансаминаза
ДК – диеновые коньюгаты
К – клеточный калий
кЛ. – клетки
КФК – креатинфосфокиназа
ЛФХ – лизофосфатидилхолин
МВ КФК – миокардиальная фракция креатинфосфокиназы
МДА – малоновый диальдегид
МЕ – международные единицы активности фермента
МПО – миелопероксидаза
NSTсп – спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия NST ст- стимулированный тест восстановления нитросинего тетразолия
ПОЛ – перекисное оксиление липидов
Са – клеточный кальций
СОД – супероксиддисмутаза
СФМ – сфингомиелин
у.е. – условные единицы
у.е. т. – условные единицы торможения активности фермента
у.е. фл. – условные единицы флюоресценции
ФЛ – фосфолипиды
ФЛ А2 – фосфолипаза А2
ФС – фосфатидилсерин
ФХ – фосфатидилхолин
ФЭА – фосфатидилэтаноламин
ШО – шиффовые основания
ЧСС – частота сердечных сокращений
ЭКГ – электрокардиограмма
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Reimer K. A. , Murry C.E., Richard V.J. The role of neutrophils and free radicals in the ischemic – reperfused heart: why the confusion and controversy. J Mol Cell Cardiol 1989; 21:1225-1239.

2. Engler R. E. Free radical and granulocyte – mediated injury durihg myocardial ischemia and reperfusion. Am J Cardiol 1989; 63: 19E-23E.

3. Mehta J.L., Nichols N.W., Mehta P. Neutrophils as potential participants in acute myocardial ischemia: relevance to reperfusion. J. Am Coll Cardiol 1988; 11: 1309-1316.

4. Чазов В.И., Руда М.Я. Тромболитическая терапия при инфаркте миокарда. Кардиология 1987; 2: 5-12.

5. Klootwijk K.P., Langert A., Meij S. et al For the GUSTO-1 ECG – ischaemia monitoring substudy. Non-invasive prediction of reperfusion and coronary artery patency by continuons ST – segment monitoring in the GUSTO-I trial. Eur Heart J 1996; 17: 689-698.

6. Pasceri V., Amdreotti F., Maseri A. Clinical markers of thrombolytic success. Eur Hert J 1996; 17:E: 35-41.

7. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках. Лаб дело 1991; 3: 56-60.

8. Бутаков А. А. , Оганезов В.К., Пинегин Б.В. и др. Спектрофотометрическое определение адгезивной способности полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови. Иммунология 1991; 5: 71-72.

9. Мельников В. П. Тест восстановления нитросинего тетразолия мононуклеарными фагоцитами. Лаб дело 1991; 8: 51-54.

10. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных жирных кислот. В кн. Современные методы в биохимии. М., 1977; 63-64.

11. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. В кн.: Современные методы в биохимии. М., 1977; 66-68.

12. Меерзон Ф.З., Каган В.Е., Прилипко Л.А. и др. Активация перекисного окисления липидов при эмоционально-болевом стрессе. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1979; 10: 404-406.

13. Тужилин С.А., Салуэнья А.И. Методы определения фосфолипазы А2 в сыворотке крови. Лаб. дело 1975; 6: 334-336.

14. Королюк М. А., Шанова Л.И., Майорова И.Г. и др. Методы определения активности каталазы. Лаб. дело 1988; 1: 16-18.

15. Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф. Количественный метод определения цинк-, медь-зависимой суперксиддисмутазы в биологическом материале. Вопр. мед. химии 1977; 5: 712-713.

16. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. Пер. с англ. М., 1965, 508.

17. Кремнева Л.В., Абатурова О.В., Шалаев С.В. Нарушения функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов при гиперлипидемии у больных ИБС и возможности их коррекции фенофибратом. Кардиология 1998; 5: 42-44.

18. Пигаревский Е.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства. М., 1978; 128.

19. Нагоев Б.С. Очерки о нейтрофильном гранулоците. Нальчик 1986.

20. Task foree on the management of acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology Acute Myocardial Infarction: pre-hospital and in-hospital management. Eur Heart J 1996; 17: 43-63.

21. Подосинников И. С, , Нилова Л.Г., Бабаченко И.Б. Метод определения хемотаксичекой активации лейкоцитов. Лаб. дело 1981; 8: 468-470.

Формула изобретения

Способ диагностики коронарной реперфузии у больных инфарктом миокарда, включающий исследование структурно-функциональных характеристик нейтрофилов до и через 90 мин от начала тромболитической терапии и оценку реперфузии, основанную на показаниях электрокардиограммы в виде снижения сегмента ST на 50% и более от исходного уровня ST больного и повышения активности миокардиальной фракции креатинфосфокиназы (MB КФК) в 2,2 раза и более при нижнем и в 2,5 раза и более при переднем инфаркте миокарда через 90 мин от начала тромболитической терапии, отличающийся тем, что дополнительно по динамике содержания в клетках крови нейтрофилах диеновых конъюгатов 13,2-27,3 нмоль/10⁶кл. , кальция 0,013-0,034 мкмоль/10⁶кл. , миелопероксидазы 0,03-0,024 у. е. /10⁶ кл. диагностируют реперфузию у больных инфарктом миокарда.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 18.02.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 32-2003

Извещение опубликовано: 20.11.2003