Патент на изобретение №2189592
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПИЛОРИЧЕСКОГО ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА
(57) Реферат: Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в медицинской микробиологии и гастроэнтерологии для выявления Helicobacter pylori (HP). У больного производят сочетанный забор желудочного содержимого и сыворотки крови, проводят определение уровня аммиака фотометрическим способом с использованием метода H. Keller и мочевины стандартным диацетил-монооксимным способом, рассчитывают индексы соотношения мочевины сыворотки крови к аммиаку желудочного содержимого (А) и аммиака сыворотки крови к аммиаку желудочного содержимого и при их значении ниже 11 и выше 1 соответственно устанавливают диагноз пилорического хеликобактериоза. Способ надежен, прост в использовании. Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в гастроэнтерологии для выявления Helicobacter pylori. Известен способ диагностики Helicobacter pylori [1], который выполняется следующим образом: во время эндоскопического исследования осуществляют забор биоптата слизистой оболочки желудка и погружают его в стандартную индикаторную среду Christensen при комнатной температуре на 24 часа. Под воздействием фермента – микробной уреазы H.pylori происходит расщепление мочевины в растворе до аммиака, который, вызывая сдвиг рН в щелочную сторону, обусловливает изменение желтой окраски раствора на красную (розовую, фиолетовую) благодаря изменению окраски индикатора. Способ имеет ряд следующих недостатков: – способ травматичен для больного; – способ длителен (продолжительность анализа 24 часа); – вследствие очагового расселения H.pylori на слизистой оболочке желудка биоптат может не содержать искомый микроорганизм и дать исследователю ложную информацию об отсутствии H. pylori у данного больного (ложноотрицательный результат); – поскольку используется не чистая культура, а биоптат, который может содержать разнообразную контаминантную микрофлору, тест может дать ложноположительный результат и повлечь необоснованное применение антибиотиков у исследуемого пациента; – специфичность и чувствительность теста достаточно низкие (вследствие вышеперечисленных условий) и составляют соответственно 88 и 74%. Известен способ диагностики Helicobacter pylori [2], который выполняется следующим образом: голодный пациент с пробным завтраком принимает раствор, приготовленный на дистиллированной воде и содержащий 250 мг мочевины, помеченной изотопом 13С. Затем через 20, 30, 40, 50 минут у исследуемого пациента берутся пробы выдыхаемого воздуха и исследуются при помощи автоматизированного масс-спектрометра с калькуляцией содержания изотопа, а затем и общей продукции CO2 к общей поверхности тела. Уреазная активность выражается как количество микромоль мочевины, гидролизованной за 1 минуту. Несмотря на высокую точность способа стоимость оборудования для его осуществления чрезвычайно высока и составляет несколько сотен тысяч долларов и даже в США такая лаборатория доступна только единичным крупным научным центрам. Кроме того, указанный способ чрезвычайно трудоемкий и требует участия большого количества персонала. Все вышеупомянутые условия крайне ограничивают возможности широкомасштабного применения данного способа в клинической практике и в научных исследованиях. Наиболее близким к предлагаемому способу является уреазный тест, основанный на определении уровня аммиака в желудочном содержимом [3]. Указанный способ диагностики пилорического хеликобактериоза осуществляется следующим образом: желудочное содержимое пациента подвергают анализу в колбе Erlenmeyer, закрытой резиновой пробкой с вентилем после подщелачивания едким натром (индикатор феноловый красный) с помощью газораспылительных трубок Dr  ger-L beck.. Через 10 минут после начала реакции газ откачивается с помощью специального насоса через трубочку 5/а. Образующийся аммиак определяется полуколичественно по зоне изменения цвета индикатора бромфенолблау.
Недостатком прототипа является низкая точность способа: чувствительность равна 83%, а специфичность – 80%. Из полученных данных следует вывод, что у 17% больных правильный диагноз с помощью данного способа установить невозможно, а 20 больным из 100 согласно указанному способу будет необоснованно рекомендовано употребление антибиотиков. Кроме того, способ технологически достаточно сложен и трудоемок. Следует также отметить, что при повышении уровня как мочевины, так и аммиака в сыворотке крови (по различным причинам) концентрация аммиака в желудочном содержимом может значительно повыситься за счет прямой диффузии и привести исследователя к ложным результатам [4, 5, 6] . Таким образом, вышеупомянутый последний способ недостаточно информативен и может сопровождаться ложноположительными и ложноотрицательными результатами вследствие недостаточной чувствительности реактива и возможных колебаний уровней исходных азотистых метаболитов крови.
Технический результат – повышение точности и упрощение способа.
Предлагаемый способ диагностики осуществляется следующим образом: у больного производят сочетанный забор желудочного содержимого и сыворотки крови, проводят определение уровня аммиака фотометрическим способом с использованием метода Н. Keller и мочевины стандартным диацетил-монооксимным методом и устанавливают диагноз пилорического хеликобактериоза по расчету следующих индексов соотношения:A) X/Y, где Х – мочевина сыворотки крови (ммоль/л), Y – аммиак желудочного содержимого (ммоль/л) B) Y/Z, где Y – аммиак желудочного содержимого (ммоль/л), Z – аммиак сыворотки крови (ммоль/л). Диагноз пилорического хеликобактериоза устанавливают при величине индекса А не выше 11, а индекса В – более 1. Общими для предлагаемого объекта изобретения и прототипа существенными признаками являются: забор желудочного содержимого, определение в оном концентрации аммиака и установление диагноза исходя из данных анализа, указывающих на неадекватное увеличение уровня ионов аммония в желудочном содержимом пациента. Отличительными признаками предлагаемого способа являются определение наряду с аммиаком желудочного содержимого уровней мочевины и аммиака в сыворотке крови пациента, использование индексов соотношения, позволяющих исключить ложноположительный результат анализа. Существенным моментом, позволяющим преодолеть низкую чувствительность способа-прототипа является использование для детекции аммиака другого метода, основанного на цветной реакции, предложенной М. Berthelot [7], и позволяющего определить аммиак в среде без предварительного выделения. Обязательная предшествующая реакция депротеинизации позволяет исключить ложнопозитивный результат за счет удаления из реакционной среды потенциальных источников аммиака, не связанных с присутствием H.pylori. Определение уровня аммиака проводится при помощи прямого колориметрирования, а не с использованием полуколичественной шкалы оценки, как в прототипе. Использование метода, предложенного Н. Keller et al. [7], позволяет практически свести к нулю ложноотрицательные результаты и продемонстрировать значительно более высокую чувствительность предлагаемого способа в сравнении с способом прототипа. По своей точности данную группу методов можно считать методом выбора [8] . Метод, предложенный Н. Keller et al. [7], прост в исполнении и не требует привлечения дополнительной аппаратуры и специальных реактивов, не имеющихся в распоряжении стандартно оснащенной биохимической лаборатории. Определение уровня мочевины сыворотки крови также является рутинной процедурой, проводящейся всегда наряду с определением уровня белка, билирубина и аминотрансфераз. Сочетанный забор желудочного содержимого (для рН-метрии) и сыворотки крови является обязательнoй рутинной процедурой для любого гастроэнтерологического стационара и не потребует дополнительной нагрузки персонала. Предлагаемый способ вследствие своей технологической простоты и доступности лабораторного оборудования может быть использован в любой биохимической лаборатории, где имеется фотоэлектроколориметр. Способ удобен еще и тем, что он является малоинвазивным и атравматичным, т.е. не требует эндоскопии с биопсией и может быть использован у пациентов с катетеризацией желудка (в т.ч. и тех, кто находится в отделении ургентного профиля), а также у пациентов, у которых взятие биопсии может привести к серьезной угрозе для здоровья (гемофилия и т.д.). Приведенная совокупность существенных признаков в литературе не описана. Проведенный анализ позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию “новизна”. Пробы желудочного содержимого и сыворотки крови, взятые от 90 пациентов, исследовали на присутствие пилорического хеликобактериоза. Полученные данные верифицировали цитологически, серологически (наборы “Anti-H.pylori EIA”, Roche, Швейцария) и при помощи полимеразной цепной реакции на обнаружение фрагмента ДНК H.pylori, кодирующего синтез субъединицы А уреазы микроорганизма. Величина индекса А у H.pylori-позитивных пациентов (n=70) составила 4,84  2,92 (0,23-10,64), а у H.pylori-негативных пациентов (n=20) – 105,949,5 (28,94-334,16). Величина индекса В у H.pylori-позитивных пациентов (n=70) составила 16,49,8 (3,74-106,8), а у H.pylori-негативных пациентов (n= 20) – 0,650,17 (0,16-0,94). Согласно данным статистического анализа (стандартный параметрический тест Стьюдента) различие было достоверно (р<0,01). Чувствительность и специфичность индекса А были равны соответственно 100% при произвольном значении, равном 11 и исчисленном из величины mean+2SD для H.pylori-позитивных пациентов. Чувствительность и специфичность индекса В были равны соответственно 100% при произвольном значении верхней границы нормативного показателя 1,0, исчисленного из величины mean+2SD для H. pylori-негативных пациентов. Таким образом, расхождения результатов индексов А и В при внутригрупповом сравнении предлагаемым способом отмечено не было.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Больной Марат X., 10 лет, обратился в клинику с жалобами на боли в области пупка, возникающие сразу после приема пищи, тошноту и рвоту. При фиброгастроскопии выявлена плоская эрозия, диаметром 4 мм в области привратника, а также язва, 4 мм диаметром, в луковице двенадцатиперстной кишки. После проведения анализов по описанному способу величина индекса А была равна 0,23, что соответствует инфицированию H.pylori. Величина индекса В была равна 8,89, что окончательно подтвердило факт инфицирования пациента H. pylori. При цитологическом, серологическом и молекулярно-биологическом исследовании диагноз H.pylori инфекции был подтвержден.
Пример 2. Больной Артем П., 14 лет, обратился в клинику с жалобами на боли в околопупочной области, не связанные с приемом пищи. При проведении фиброгастроскопии у больного обнаружен гипертрофический дуоденит и слабая эритема слизистой оболочки тела желудка. В процессе тестирования по описанному способу величина индекса А была равна 38,3, что не соответствует инфицированию H. pylori. Величина индекса В была равна 0,76, исходя из чего был сделан вывод об отсутствии инфекции H.pylori. При цитологическом, серологическом и молекулярно-биологическом исследовании у пациента было подтверждено отсутствие пилорического хеликобактериоза.
Проведенное исследование свидетельствует о том, что предложенный способ диагностики пилорического хеликобактериоза является эффективным и надежным и может быть рекомендован для широкого клинического применения.
Источники информации
13C-urea breath test. In: Campylobacter pylori and gastroduodenal disease. Ed. by B. J. Rathbone, R.V. Heatley. Blackwell Scientific publ., Oxford, 1990, p. 94-105.
7. Keller H., M
Формула изобретения
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 13.03.2003
Номер и год публикации бюллетеня: 18-2004
Извещение опубликовано: 27.06.2004
|
||||||||||||||||||||||||||
