Патент на изобретение №2189040

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии. Способ включает приготовление тест-микроба, получение сыворотки крови, внесение тест-микроба в сыворотку, инкубирование в термостате при 37^oС. Перед инкубированием и после него определяют рН сыворотки крови с тест-микробом и по его изменению определяют бактерицидную активность. Способ позволяет повысить точность определения бактерицидной активности сыворотки крови. 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной иммунологии, и может быть использовано при оценке неспецифических защитных факторов организма животных.

Известен фотонефелометрический способ определения бактерицидной активности сыворотки крови (О.В. Смирнова, Т.А. Кузьмина, ЖМЭИ, – 1966, 4. – С. 8-11).

Способ заключается в том, что с помощью нефелометра (ФЭК-4-57) учитывают изменения оптической плотности жидкой питательной среды, содержащей микробную взвесь и испытуемую сыворотку крови. Бактерии в процессе размножения уменьшают прозрачность среды, сыворотка крови этому препятствует. В пробирки с 4,5 мл стерильного питательного бульона вносят по 1,0 мл испытуемой сыворотки. Затем во все пробирки пипеткой добавляют по одной капле суточной бульонной культуры Escherichia coli, (по данным авторов в капле 24-х часовой культуры Е.coli содержится от 5 до 6 млн микробных клеток). Контролем служит пробирка с питательной средой и микробной взвесью без сыворотки крови. Измерение оптической плотности испытуемых проб и контроля проводят дважды: сразу после смешивания ингредиентов и через 3 ч инкубации в термостате.

Результат реакции вычисляют по формуле:

где D₁ – оптическая плотность пробы до термостата;
D₂ – оптическая плотность пробы после 3 ч в термостате;
D_1k – оптическая плотность контроля до термостата;
D_2k – оптическая плотность контроля после 3 ч в термостате.

Недостатком данного способа является то, что оптическая плотность смеси, состоящей из трех компонентов: жидкой питательной среды, сыворотки крови и бактерий, увеличивается не только в результате размножения бактерий, но и в процессе склеивания органических веществ мясного бульона, что снижает достоверность полученного результата. Ферменты и прочие белки крови реагируют не только с микробными, но вообще с любыми аминокислотами, которых в мясопептонном бульоне содержится, независимо от того, есть в нем бактерии или нет, до 5 г/л, поэтому смешивание крови с каким бы то ни было мясным отваром снижает точность оценки ее защитных свойств.

Белки сыворотки крови, соединяясь с мясным бульоном, вступают в серологические и биохимические реакции, дающие осадок. Это заведомо лишает нефелометрический метод объективности.

Кроме того, после выдержки данной смеси в термостате дольше 6 ч в ней невооруженным глазом обнаруживается процесс агглютинации бактерий иммуноглобулинами крови. Относительное содержание сыворотки крови в данной биохимической системе хотя и невысокое (оно составляет по отношению к другим компонентам около 1/5), но и при такой концентрации неизбежно возникает непредвиденная авторами нефелометрического метода реакция агглютинации микробной взвеси: на дне пробирок, наряду с осадком из живых бактерий, образуется характерный для РА зонтичный осадок. Этот осадок нарастает первые 18 ч выдержки в термостате, и на вторые сутки соответствует оценке “три креста”. Агглютинат во взвешенном состоянии увеличивает показания шкалы нефелометра, от которых % БАСК находится в обратной зависимости, однако такое увеличение указывает не на низкую бактерицидную активность, а, напротив, на высокую антибактериальную активность иммуноглобулинов крови.

Цель изобретения – повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающем приготовление тест-микроба, получение сыворотки крови, внесение тест-микроба в сыворотку, инкубирование в термостате при +37^oС и определение бактерицидной активности, перед инкубированием и после него определяют рН сыворотки крови с тест-микробом и БАСК вычисляют по формуле

где H₁ – рН пробы до постановки в термостат;
Н₂ – рН пробы после 24 ч выдержки в термостате;
Н₃ – рН пробы после 36 ч в термостате;
Н₄ – рН пробы после 48 ч в термостате;
H_1k – рН контроля до постановки в термостат;
Н_2k – рН контроля после 24 ч выдержки в термостате;
Н_3k – рН контроля после 36 ч в термостате;
Н_4k – рН контроля после 48 ч в термостате.

Кровь для микрофлоры является не столько агрессивной средой, сколько питательной. Бактерии E. coli штамм О4 микробиологического семейства Энтеробактер способны жить в абсолютно чистой (без примесей) и свежей сыворотке крови рогатого скота и свиней при температуре +37^oС.

Кровь млекопитающих имеет стабильное значение рН, равное 7,4. (А.А.Кудрявцев с соавт. Гематология животных и рыб, М.: Колос, 1969). Вне организма, под действием бактерий, рН крови (в т.ч. сыворотки) снижается.

В пробах сыворотки крови, имеющих высокую бактерицидную активность, рН изменяется в кислую сторону на значительно меньшие значения, чем в пробах с низкой активностью. При хорошей бактериостатической способности исходное значение рН 7,4 сохраняется дольше суток. Таким образом, о бактериостатических свойствах сыворотки крови судят по изменению величины ее рН в течение 48 ч.

Способ осуществляется следующим образом.

Кровь для исследования берут непосредственно от животного с соблюдением правил асептики и антисептики. После отстаивания сыворотки отбирают 1,5-2 мл от ее объема стерильной мерной пипеткой в сухие пробирки и центрифугируют 10 мин при скорости 15000 оборотов в минуту. Затем каждую пробу сыворотки, очищенной от продуктов гемолиза, делят на две неравные части: по 1 мл и 0,3 мл. На каждую пробу приходится 2 пробирки, пронумерованные одинаковым номером.

В качестве тест-микроба используют Escherihia coli штамм О4. Количество пробирок с посевами Е.coli готовят по числу обследуемых животных (+ одна для контроля) и нумеруют теми же числами или знаками, что и кровь.

Бактерии культивируют при температуре +37^oС на скошенном в пробирках агаре в течение 20-24 ч, после чего их смывают с поверхности агара малым количеством сыворотки (по 0,3 мл) в строгом соответствии с номерами. Смыв собирают капиллярной пипеткой и по каплям вносят его в пробирки с 1 мл испытуемой сыворотки. Тем самым доводят концентрацию бактерий в сыворотке крови с 0 до 2 млрд/мм³ по оптическому стандарту мутности. На этом приготовление опытной смеси завершено. В данной смеси нет 1) воды, 2) питательной среды. Это повышает точность оценки БАСК.

Измеряют рН и помещают пробы в термостат при +37^oС на 24 ч.

Приготовление контрольной смеси осуществляют следующим образом: оставшуюся в центрифужных пробирках сыворотку крови нагревают одномоментно до +50^oС с тем, чтобы защитные белки – иммуноглобулины, ферменты утратили свои противомикробные свойства, затем сыворотки смешивают в отдельной посуде и отбирают пипеткой оттуда в две пробирки 1 мл и 0,3 мл. Малым объемом смывают тест-микроб с агара, по каплям добавляют этот смыв в больший объем до концентрации E. coli 2 млрд/мм³. Измеряют рН контрольной смеси непосредственно перед постановкой в термостат.

Контрольную пробирку помещают в термостат одновременно с опытными.

Через 24, 36 и 48 ч вновь измеряют рН опытных и контрольной сывороток крови. Предлагаем вычислять средний показатель БАСК по трем измерениям

где H₁ – рН пробы до постановки в термостат;
Н₂ – рН пробы после 24 ч выдержки в термостате;
Н₃ – рН пробы после 36 ч в термостате;
Н₄ – рН пробы после 48 ч в термостате;
H_1k – рН контроля до постановки в термостат;
Н_2k – рН контроля после 24 ч выдержки в термостате;
н_3k – рН контроля после 36 ч в термостате;
Н_4k – рН контроля после 48 ч в термостате.

Пример 1
У группы, состоящей из 10 шестимесячных подсвинков, были взяты пробы сыворотки крови для определения бактерицидной активности общепринятым методом. По 1,0 мл сыворотки внесли в пробирки, содержащие 4,5 мл жидкой питательной среды. Питательный бульон, предназначенный для культивирования бактерий, был изготовлен по соответствующей методике: при изготовлении бульона использовали вещества, реактогенные по отношению к иммуноглобулинам и ферментам крови: мясо, белок куриного яйца, пептон и др.

После внесения тест-микроба измеряли оптическую плотность смеси и помещали пробирки в термостат. Через 3 и 24 ч извлекали пробы из термостата для повторных измерений оптической плотности. В качестве контроля использовали пробирку с бульоном и тест-микробом, без сыворотки крови (табл. 1).

Бактерицидную активность определяли по формуле

где D₁ – оптическая плотность пробы до термостата;
D₂ – оптическая плотность пробы после 3 ч в термостате;
D_1k – оптическая плотность контроля до термостата;
D_2k – оптическая плотность контроля после 3 ч в термостате.

При постановке нами дополнительного контроля, состоящего только из мясного бульона и свежей сыворотки крови, наблюдали непредвиденное О.Смирновой, Т.Кузьминой, (1966) увеличение оптической плотности среды после выдержки ее в термостате в стерильных условиях (без тест-микроба) в течение 3 ч. Это говорит о наличии иммунологической реакции между компонентами крови и непосредственно самой безмикробной питательной средой, в которую эти активные компоненты были искусственно помещены. Поправка на нестабильную плотность жидкой питательной среды в формуле О.Смирновой, Т.Кузьминой не предусмотрена.

В последней строке таблицы показаны изменения, происходящие без участия тест-микроба в сыворотке крови, смешанной с мясным бульоном. Эти непредусмотренные в нефелометрическом методе изменения оптической плотности сыворотки крови (на 0,015 и 0,028) снижают точность оценки БАСК.

При сравнении бактерицидной активности одних и тех же сывороток крови в двух повторностях (через 3 и 24 ч) установили, что ранговое положение проб сыворотки крови в данной статистической выборке полностью нарушается. В пробах, лучших по бактерицидной активности в первые 3 ч ( 3, 4, 6 и 8), через 24 ч показатели были субъективно (О.Смирнова, Т.Кузьмина”, 1966) худшими, т.к. в них наблюдалось наибольшее количество осадка, дающего помутнение при взбалтывании. В действительности же причиной осадка являлась агглютинация и гибель бактерий, а не их рост, поэтому результаты второго вычисления БАСК противоречат результатам первого (табл. 1). Для данного метода в целом характерна разноречивость показателей, определенных в одних и тех же пробах. В пробах 3, 4, 6 и 8 большое количество осадка (высокая оптическая плотность) указывает в большей степени не на увеличение количества живых бактерий, а на способность иммуноглобулинов склеивать между собой и обезвреживать микробные клетки.

Пример 2
У той же группы животных были взяты пробы сыворотки крови для определения бактерицидной активности предлагаемым способом. Питательный бульон для определения БАСК не использовался. Тест-микроб смывали с поверхности агара сывороткой крови из пробирок с соответствующими номерами. Концентрацию доводили по оптическому стандарту мутности до 2 млрд/мм³ сыворотки, измеряли рН и помещали пробы в термостат. Контролем служила сыворотка крови, разрушенная нагреванием до +50^oС. Повторные измерения рН проводили через 24, 36 и 48 ч. БАСК определяли по формуле

где H₁ – рН пробы до постановки в термостат;
Н₂ – рН пробы после 24 ч в термостате;
Н₃ – рН пробы после 36 ч в термостате;
Н₄ – рН пробы после 48 ч в термостате;
H_1k – рН контроля до постановки в термостат;
Н_2k – рН контроля после 24 ч в термостате;
Н_3k – рН контроля после 36 ч в термостате;
H_4k – рН контроля после 48 ч в термостате.

Результаты всех трех измерений были сопоставимыми, т.е. ранговое положение проб по величине рН практически не изменялось, сдвиг в кислую сторону проходил относительно равномерно (табл. 2). Промежуточные значения БАСК также уменьшались во всех пробах пропорционально, без резких колебаний, по мере естественного расходования защитных факторов крови.

Таким образом, из реакции была исключена питательная среда, прежде оказывающая отрицательное влияние на точность определения БАСК, вступающая в самостоятельную реакцию с ферментами и глобулинами крови.

Концентрация тест-микроба в предложенном методе более точно выверена по стандарту, что особенно важно, т.к. бактериальные клетки в процессе деления количественно увеличиваются в геометрической прогрессии и разница в 1 млн микробных клеток/мм³ среды через 3 ч возрастает до 8 млн клеток.

Предложенным способом изменение рН сыворотки крови при контакте с тест-микробом более точно характеризовало ее бактерицидную активность (коэффициент временной повторяемости 0,69), чем изменение оптической плотности питательной среды, содержащей только 20% сыворотки (коэффициент временной повторяемости 0,29), как было ранее в ходе нефелометрического метода. Статистическая ошибка метода в результате предложенных мероприятий снижается с 7,3 до 1,5%.

Формула изобретения

Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови сельскохозяйственных животных, включающий приготовление тест-микроба, получение сыворотки крови, внесение в нее тест-микроба, инкубирование в термостате при 37^oС и определение бактерицидной активности, отличающийся тем, что перед инкубированием и после него определяют рН сыворотки с тест-микробом и БАСК вычисляют по формуле

где Н₁ – рН пробы до постановки в термостат;
Н₂ – рН пробы после 24 ч в термостате;
Н₃ – рН пробы после 36 ч в термостате;
Н₄ – рН пробы после 48 ч в термостате;
Н_1k – рН контроля до постановки в термостат;
Н_2k – рН контроля после 24 ч в термостате;
Н_3k – рН контроля после 36 ч в термостате;
Н_4k – рН контроля после 48 ч в термостате.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.08.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 16-2004

Извещение опубликовано: 10.06.2004