Патент на изобретение №2189038

(54) СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ ДЕТЕКТОР ДЛЯ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И КАПИЛЛЯРНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области аналитического приборостроения и найдет применение в приборах капиллярного электрофореза и хроматографах при проведении высокочувствительного детектирования компонентов проб, движущихся в капилляре. В спектрофотометрическом детекторе, содержащем источник света 1, расположенные последовательно по ходу общего светового луча входную щель 2 и дифракционную решетку 3, делитель света 5, разделяющий световой луч на измерительный канал с установленными в нем коллектором 6, измерительной ячейкой 7, вторым коллектором 8 и первым фотоприемным устройством 9, и опорный канал с коллектором 10 и вторым фотоприемным устройством 11, между источником света и входной щелью установлена осветительная линза 18, а делитель света 5 выполнен в виде пластины и расположен по ходу луча после дифракционной решетки 3, измерительный и опорный каналы снабжены выходными щелями 19 и 20, установленными после делителя света 5, а фотоприемные устройства 9 и 11 обоих каналов выполнены в виде микросхем, в каждой из которых фотодиоды 12 и 13 соединены с входами введенных нелинейных преобразователей 21 и 22 фототоков в другие физические величины, например в интервалы времени, при этом выходы фотоприемных устройств обоих каналов присоединены к микропроцессорному устройству 16, выход которого соединен с устройством регистрации 17. Пластина делителя света выполнена в виде зеркала с отверстием в зоне прохождения луча света измерительного канала. Нелинейный преобразователь выполнен в виде операционного усилителя с конденсатором в цепи обратной связи, компараторов, соединенных с выходом усилителя, и ключей начальной установки, соединенных с компараторами и конденсатором. Коллекторы в измерительном канале выполнены в виде вогнутых зеркал, а источник света выполнен в виде дуговой дейтериевой лампы и лампы накаливания, у которых излучающая область имеет вертикальный размер больше, чем горизонтальный размер. Техническим результатом является повышение чувствительности и расширение динамического диапазона детектора. 4 з.п.ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области аналитического приборостроения и может быть использовано в приборах капиллярного электрофореза и хроматографах для проведения высокочувствительного детектирования компонентов проб, движущихся в капилляре.

При фотометрическом (спектрофотометрическом) детектировании концентрация компонентов в капилляре определяется путем измерения поглощения света, прошедшего через измерительную ячейку. Известно устройство для проведения капиллярного электрофореза [1] , имеющее капилляр, заполненный разделительной средой с раствором разделяемых компонентов, источник света и фотоприемник, расположенные по разные стороны относительно капилляра. Световые потоки, падающие на капилляр и на фотоприемник, малы, поскольку в этом устройстве отсутствуют устройство фокусировки света на капилляре и коллектор для сбора света на фотоприемнике. Поэтому устройство обладает малой чувствительностью.

Известен оптический детектор для капиллярных разделительных колонок [2], в котором дополнительно имеются устройство фокусировки светового пучка на участке капилляра, через который протекает разделенная на компоненты проба, и коллектор, собирающий свет, прошедший через капилляр, на фотодетекторе. Устройство фокусировки переносит изображение источника на капилляр, что приводит к увеличению светового потока, падающего на фотодетектор. За счет устройства фокусировки и коллектора достигается большая чувствительность по сравнению с предыдущим устройством. Общим недостатком подобных детекторов, выполненных по однолучевой схеме, являются значительные шумы, связанные с нестабильностью света источника. Обычно в качестве источника используются дуговые дейтериевые лампы. Эти лампы имеют кратковременные флуктуации светового потока и длительную нестабильность, в несколько раз превосходящие шумы и нестабильности источников питания. Флуктуации светового потока источника пропорционально преобразуются фотодетектором и вызывают шумы и дрейф нулевой линии электрофореграммы (порядка 0,05% от предела детектирования).

Известен способ обнаружения поглощения света пробой в растворе жидкости [3] с помощью двухканальной фотометрической системы. Первый луч проходит через ячейку с пробой, второй луч служит для получения опорного сигнала. Для выделения из широкого спектра монохроматического луча используется дифракционная решетка. Поглощение света пробой определяется путем логарифмирования отношения напряжений сигналов, пропорциональных мощности луча, прошедшего через ячейку с пробой, и опорного луча. За счет двухканальной схемы достигается значительная компенсация шумов и нестабильностей источника света.

Ближайшим из известных является детектор для жидкостной хроматографии [4] , функциональная схема которого изображена на фиг.1. Источником света 1 является дейтериевая лампа или лампа накаливания. Выбор лампы осуществляется путем их перемещения. От источника света 1 выделяется световой луч с рабочей длиной волны с помощью расположенных последовательно входной щели 2, дифракционной решетки 3 и выходной щели 4. С помощью делителя света 5, выполненного на основе волоконной оптики, часть луча фокусируется через коллектор 6 на измерительной ячейке 7. После ячейки излучение через коллектор 8 подается на фотоприемник измерительного канала 9. Остальная часть излучения делителя света подается через коллектор 10 на фотоприемник опорного канала 11. В качестве фотоприемников использованы фотодиоды 12 и 13 и линейные усилители 14 и 15, преобразующие токи фотодиодов в напряжения, которые подаются в логарифматор 16. Выходное напряжение логарифматора определяется поглощением в измерительной ячейке в единицах оптической плотности и подается в регистрирующее устройство 17.

Недостатки этого устройства заключаются в ограниченной чувствительности и ограниченном динамическом диапазоне измеряемых сигналов. Ограничение чувствительности и динамического диапазона определяется в основном малыми величинами световых потоков, падающих на фотоприемники, и свойствами усилителей фототоков. Для повышения чувствительности и расширения динамического диапазона выгодно увеличивать световой поток. Максимально измеряемый сигнал в одном канале равен току фотодиода I, который определяется величиной падающего светового потока. Минимальный сигнал i (предел обнаружения) определяется шумовой составляющей этого тока I в полосе частот f по известной формуле
i = (2 e I / f)^1/2. (1)
При реально достижимом токе I=3,210^-9 шумовой ток фотодиода равен i= 3,210^-14 А.

Известный усилитель фототока содержит резистор R в цепи обратной связи, который выбирается исходя из максимального тока фотодиода i и максимально допустимого выходного напряжения усилителя U (порядка 10 В).

R=U/I=3,1ГOм.

В установившемся режиме ток через резистор приблизительно равен току фотодиода. Это значит, что его шумовая составляющая приблизительно равна шумовому току фотодиода. Следовательно, известный усилитель обладает повышенными шумами за счет шума тока резистора в цепи обратной связи. Шумы тока фотодиода и тока резистора в цепи обратной связи складываются. Эти шумы ограничивают динамический диапазон усилителя со стороны минимальных значений измеряемого сигнала. При линейной амплитудной характеристике усилителя и указанных значениях фототока и шумового тока динамический диапазон ограничен снизу и сверху и равен I/i=10⁵.

Под чувствительностью понимается величина, обратная динамическому диапазону. В рассмотренном примере эта величина равна i/I=10^-5. Реально верхнее значение динамического диапазона каждого канала значительно ниже приведенного значения по трем причинам.

1. Световой поток в каждом канале не достигает своего максимального значения, которое может быть обеспечено источником света, поскольку свет проходит через делитель света. Шумы двух каналов суммируются на выходе детектора по квадратичному закону, поэтому выгодно делить свет между каналами поровну, при этом в каждый канал попадает 50% света источника. Суммарные шумы на выходе детектора, вычисленные с учетом формулы 1 при уменьшенных значениях фототоков определяются следующим образом:
i = (0,5 I + 0,5 I)^1/2 (2 e / f)^1/2 = (2 e I / f)^1/2. (2)
Если сравнить результаты вычисления шумов по формулам 1 и 2, то можно сделать вывод, что шумы на выходах одноканального детектора и двухканального детектора при равной мощности источника света совпадают. Однако при двухкратном уменьшении света в измерительном канале двухканального детектора в два раза уменьшается сигнал и отношение сигнала к шуму.

Увеличение светового потока за счет увеличения мощности источника ограничено, поскольку при этом яркость фактически не возрастает, а увеличивается площадь излучающей поверхности, а для сохранения выбранной апертуры входного светового пучка возникает необходимость удаления источника от капилляра.

2. Световой поток в каждом канале изменяется в рабочем диапазоне длин волн и значительно уменьшается в коротковолновой ультрафиолетовой его части, при этом фототоки одновременно уменьшаются за счет резкого уменьшения чувствительности фотоприемников в этой области спектра.

3. При использовании в качестве коллекторов линз при изменении рабочей длины волны происходит изменение фокусировки пучка света, падающего на измерительную ячейку. Особенно сильно это влияет на сигнал в случае, если в качестве измерительной ячейки используется капилляр диаметром порядка 50 мкм. При ухудшении фокусировки пучка уменьшается световой поток, проходящий через центральную часть капилляра, в которой находятся исследуемые компоненты пробы, и соответственно пропорционально уменьшаются сигналы. Часть света, которая проходит мимо центральной части капилляра, не только не несет информации об исследуемых компонентах, но и вызывает дополнительные шумы и вносит погрешность в результат измерения оптической плотности.

По этим причинам динамический диапазон преобразователя уменьшается по сравнению с теоретически достижимым значением, вычисленным по формуле 1, соответственно ухудшается чувствительность.

Настоящее предлагаемое изобретение решает задачу повышения чувствительности и расширение динамического диапазона детектора.

Поставленная задача решается за счет того, что в спектрофотометрическом детекторе для капиллярного электрофореза и капиллярной жидкостной хроматографии, содержащем источник света, расположенные последовательно по ходу общего светового луча входную щель и дифракционную решетку, делитель света, разделяющий световой луч на измерительный канал, в котором установлены коллектор, измерительная ячейка, второй коллектор и первое фотоприемое устройство, и опорный канал, в котором установлены коллектор и второе фотоприемное устройство, при этом выходы фотоприемных устройств соединены с устройством обработки информации, выход которого соединен с устройством регистрации, между источником света и входной щелью установлена осветительная линза, делитель света, выполненный в виде пластины, расположен по ходу луча после дифракционной решетки, измерительный и опорный каналы снабжены выходными щелями, установленными после делителя света, а фотоприемное устройство каждого канала выполнено в виде микросхемы, которая содержит фотодиод и нелинейный преобразователь фототока в интервал времени, выход фотодиода соединен с входом нелинейного преобразователя, а выход нелинейного преобразователя является выходом фотоприемного устройства, при этом устройство обработки информации выполнено в виде микропроцессорного устройства, преобразующего упомянутые интервалы времени в цифровые значения, которые используются при вычислении изменения оптической плотности.

Все элементы фотоприемных устройств, выполненных в виде микросхем, сосредоточены в малом объеме и на площади малых размеров, что значительно уменьшает вредное энергетическое воздействие внешних электрических и магнитных полей, порождающих избыточные шумы фотоприемных устройств. Использование металлостеклянного корпуса с оптическим окном из кварца для приема входного оптического сигнала позволяет наиболее эффективно осуществить электрическую и магнитную экранировку, а также защиту от неблагоприятных условий внешней среды (повышенная влажность, наличие паров химически активных веществ и т.д.).

В предлагаемом спектрофотометрическом детекторе нелинейный преобразователь выполнен в виде операционного усилителя с конденсатором в цепи обратной связи, компараторов, соединенных с выходом усилителя, и ключей начальной установки, соединенных с компараторами и конденсатором. Такой интегрирующий преобразователь позволяет наиболее эффективно подавлять содержащиеся во входном сигнале аддитивные флуктуационные и периодические помехи.

В предлагаемом спектрофотометрическом детекторе коллекторы в измерительном канале выполнены в виде вогнутых зеркал.

В предлагаемом спектрофотометрическом детекторе источник света выполнен в виде дуговой дейтериевой лампы или лампы накаливания, у которых излучающая область имеет вертикальный размер больше, чем горизонтальный размер.

Схема предлагаемого спектрофотометрического детектора представлена на фиг. 2. Спектрофотометрический детектор содержит источник света 1, входную щель 2, дифракционную решетку 3, делитель света 5, разделяющий световой луч на 2 канала: измерительный, содержащий коллектор 6, измерительную ячейку 7, второй коллектор 8 и фотоприемое устройство 9, и опорный, содержащий коллектор 10 и фотоприемое устройство 11, при этом фотоприемные устройства каждого канала 9 и 11 содержат фотодиоды 12 и 13. Спектрофотометрический детектор содержит также устройство обработки информации 16 и устройство регистрации 17.

Между источником света и входной щелью установлена осветительная линза 18, делитель света 5 выполнен в виде пластины и расположен по ходу луча после дифракционной решетки 3, измерительный и опорный каналы снабжены выходными щелями 19 и 20, установленными после делителя света 5, фотоприемные устройства каждого канала 9 и 11 выполнены в виде микросхем, которые содержат фотодиоды 12 и 13 и нелинейные преобразователи фототоков в интервалы времени 21 и 22, входы нелинейных преобразователей 21 и 22 соединены соответственно с выходами фотодиодов 12 и 13, а выходы нелинейных преобразователей 21 и 22 являются выходами фотоприемных устройств 9 и 11 и присоединены к устройству обработки информации 16, выход которого соединен с устройством регистрации 17. При этом устройство обработки информации 16 выполнено в виде микропроцессорного устройства, преобразующего упомянутые интервалы времени в цифровые значения, которые используются в микропроцессорном устройстве при вычислении изменения оптической плотности.

Работает предлагаемый спектрофотометрический детектор следующим образом.

Световой луч от источника света 1 проходит через осветительную линзу 18 и фокусируется на входной щели 2. Через входную щель световой луч попадает на дифракционную решетку 4, затем на делитель света 5, выполненный в виде светоделительной пластины, которая разделяет световой луч на 2 канала -измерительный и опорный. Световой луч измерительного канала через выходную щель 19 попадает на коллектор 6, с помощью которого фокусируется на капилляре измерительной ячейки 7. Световой луч, интенсивность которого после измерительной ячейки 7 в каждый момент времени определяется степенью поглощения его компонентами пробы, фокусируется коллектором 8 на фотодиоде 12 фотоприемного устройства 9. Нелинейный преобразователь 21 преобразует ток l₁ фотодиода 12 в интервал времени T₁:
T₁=CU/l₁,
где С – емкость конденсатора в цепи обратной связи,
U – перепад напряжения на конденсаторе.

Световой луч опорного канала через выходную щель 20 попадает на коллектор 10, с помощью которого фокусируется на фотодиоде 13 фотоприемного устройства 11. Нелинейный преобразователь 22 преобразует ток I₂ фотодиода 13 в интервал времени Т₂:
Т₂=CU/I₂.

Зависимость времени заряда Т от зарядного тока I нелинейная: время заряда обратно пропорционально зарядному току (гиперболическая зависимость). При линейном преобразовании максимальная величина фототоков ограничивается максимально допустимым периодом преобразования порядка 1 секунды. Преимущество нелинейного преобразователя проявляется в отсутствии ограничения со стороны больших значений фототоков, поскольку при увеличении фототоков длительность интервалов времени уменьшается. Погрешность преобразования не увеличивается, поскольку в течение допустимого периода преобразования возможно усреднение результата преобразования.

Таким образом, при CU=const. вся информация о величине сигнала (потоке оптического излучения) преобразуется в значения интервалов времени Т.

Устройство обработки информации 16 выполнено в виде микропроцессорного устройства, которое преобразует интервалы T₁ и Т₂ в цифровые величины, усредняет их за период измерения (например, за 1 секунду) и использует при вычислении в реальном времени приращений оптической плотности А, соответствующих измеряемым компонентам пробы:
A=log(T₁/T₁₀xT₂₀/T₂),
где Т₁₀ и T₂₀ интервалы времени на выходах фотоприемных устройств начале эксперимента (в этот момент времени А=0). Эта формула позволяет не вычислять промежуточные значения фототоков и таким образом уменьшает объем вычислений.

Последовательность величин А запоминается в микропроцессорном контроллере 16 в виде файла, который передается на индикатор и принтер устройства регистрации 17.

Предлагаемое техническое решение обеспечивает повышение чувствительности и расширение динамического диапазона детектора. На чувствительность и динамический диапазон детектора сильно влияют следующие его характеристики:
– качество фокусировки света на капилляре, связанное с информативностью светового потока,
– количество света в измерительном и опорном каналах,
– свойства фотоприемных устройств, обеспечивающих преобразование света и выделение сигналов на фоне шума.

Излучающая область источника света выполнена таким образом, что ее вертикальный размер больше, чем горизонтальный размер. Такая конфигурация излучающей области источника позволяет наилучшим образом использовать его световой поток, поскольку в итоге излучающая область источника проектируется с уменьшением на капилляр, у которого допустимый размер пятна засветки по вертикали в несколько раз больше, чем по горизонтали (последний размер ограничивается диаметром капилляра).

Делитель света выполнен в виде пластины таким образом, что большая часть света попадает в измерительный канал. Выходные щели определяют границы пропускаемых длин волн измерительного и опорного каналов. Уменьшение светового потока опорного канала компенсируется путем увеличения площади выходной щели в этом канале. Для этого ширина и высота щели в опорном канале выбирается в несколько раз больше, чем ширина и высота щели в измерительном канале. Увеличение доли света в измерительном канале повышает чувствительность.

В качестве примера используем в качестве делителя света тонкую кварцевую пластину. Примерно 10% света, падающего на нее от источника, отражается в опорный канал. Остальные 90% падающего света попадают в измерительный канал. По этой причине сигнал в измерительном канале уменьшается всего на 10% по сравнению с одноканальным детектором и почти в 2 раза больше, чем в известном двухканальном детекторе. Если выбрать в опорном канале ширину выходной щели в 5 раз больше, чем в измерительном (например, 50 и 10 нм соответственно), и в 5 раз больше по высоте, то световой поток опорного канала, пропорциональный площади щели, будет в 2,5 раза больше, чем световой поток измерительного канала. При этом шумами опорного канала можно пренебречь. Из этого примера можно сделать вывод, что в измерительном канале используется центральная часть светового потока, расположенного в малом телесном угле, а в опорном канале – часть светового потока, расположенного в большем телесном угле. Однако при использовании прозрачной пластины в опорный канал попадает только 10% падающего света.

С целью наиболее полного использования светового потока в предлагаемом спектрофотометрическом детекторе делитель света выполнен в виде зеркала с отверстием в средней части. При этом через отверстие проходит световой поток в измерительный канал, а от зеркальной части отражается световой поток в опорный канал. Оба потока разделяются без потерь.

В качестве коллекторов в измерительном канале используются вогнутые зеркала, которые сохраняют фокусировку во всем рабочем диапазоне длин волн. Вогнутое зеркало коллектора, расположенное перед капилляром, совместно с осветительной линзой обеспечивает оптимальное увеличение оптической системы для получения максимального светового потока через капилляр. При этом изображение светящейся области лампы проектируется на капилляр со значительным уменьшением и не зависит от рабочей длины волны.

Нелинейный преобразователь выполнен в виде операционного усилителя с конденсатором в цепи обратной связи, компараторов, соединенных с выходом усилителя, и ключей, соединенных с компараторами и конденсатором. Из формулы Т=CU/I видно, что ограничение сверху не происходит, поскольку при увеличении светового тока происходит уменьшение интервала времени. Интервал времени измеряется микропроцессорным контроллером известными способами в очень большом динамическом диапазоне с высокой точностью. Одновременно, применение операционного усилителя с конденсатором цепи обратной связи исключает шумы тока через резистор обратной связи, которые в известном устройстве ограничивают динамический диапазон преобразователя со стороны минимальных значений измеряемого сигнала.

Таким образом, задача повышения чувствительности и расширения динамического диапазона детектора решается за счет новых технических решений, обеспечивающих увеличение светового потока в измерительном и опорных каналах, улучшение фокусировки светового луча на капилляре, уменьшение шумов на нижнем пределе и устранение ограничения на верхнем пределе динамического диапазона детектора.

Источники информации
1. Патент США 5169511, G 01 N 27/26, B 01 D 57/02, 1992 г.

2. Патент ЕПВ (ЕР) 0527652, G 01 N 30/74, 35/08. 21/05, 27/26, 1993 г.

3. Патент ЕПВ (ЕР) 0497434, G 01 N 21/27, G 01 J 1/16, 3/42, 1992 г.

4. Проспект фирмы Spectra-Physics, The UV-VIS detectors for liquid chromatography SpectraChrom, 1989 г.

Формула изобретения

1. Спектрофотометрический детектор для капиллярного электрофореза и капиллярной жидкостной хроматографии, содержащий источник света, расположенные последовательно по ходу общего светового луча входную щель и дифракционную решетку, делитель света, разделяющий световой луч на измерительный канал, в котором установлены коллектор, измерительная ячейка, второй коллектор и первое фотоприемное устройство, и опорный канал, в котором установлены коллектор и второе фотоприемное устройство, при этом выходы фотоприемных устройств соединены с устройством обработки информации, выход которого соединен с устройством регистрации, отличающийся тем, что между источником света и входной щелью установлена осветительная линза, делитель света, выполненный в виде пластины, расположен по ходу луча после дифракционной решетки, измерительный и опорный каналы снабжены выходными щелями, установленными после делителя света, а фотоприемные устройства каждого канала выполнены в виде микросхем, которые содержат фотодиоды и нелинейные преобразователи фототоков в интервалы времени, входы нелинейных преобразователей соединены соответственно с выходами фотодиодов, а выходы нелинейных преобразователей являются выходами фотоприемных устройств, при этом устройство обработки информации выполнено в виде микропроцессорного устройства, преобразующего упомянутые интервалы времени в цифровые значения для вычисления изменения оптической плотности.

2. Спектрофотометрический детектор по п. 1, отличающийся тем, что пластина делителя света выполнена в виде зеркала с отверстием в зоне прохождения луча света измерительного канала.

3. Спектрофотометрический детектор по п. 1, отличающийся тем, что каждый нелинейный преобразователь выполнен в виде операционного усилителя с конденсатором в цепи обратной связи, компараторов, соединенных с выходом усилителя, и ключей начальной установки, соединенных с одним из компараторов и конденсатором.

4. Спектрофотометрический детектор по п. 1, отличающийся тем, что коллекторы в измерительном канале выполнены в виде вогнутых зеркал.

5. Спектрофотометрический детектор по п. 1, отличающийся тем, что источник света имеет излучающую область, у которой вертикальный размер больше, чем горизонтальный размер.

РИСУНКИ