Патент на изобретение №2188829

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА ДЛЯ ПРОТИВОЛУЧЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Описывается способ получения низкомолекулярного хитозана. Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для создания на основе природных полисахаридов новых радиопротекторов. Сущность предложенного способа заключается в том, что ферментативное расщепление раствора хитозана проводят растворимым комплексом микробных хитинолитических ферментов при рН 4,5-5,5 температуре 40-50^oС в течение 30-60 мин при соотношении хитиназная активность-хитозан от 0,5 до 2,0 ед. активности на 1 г хитозана, затем реакционную массу выдерживают 3-7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют, фильтруют, фракционируют, выделяя фракцию со средневязкостной молекулярной массой от 8 до 12 кДа, полученный раствор диализуют против воды, продукт сушат. Полученное вещество водорастворимо (до 50 мг в 1 мл) и легко стерилизуется кипячением, нетоксично. Выживаемость животных, защищенных полученным хитозаном, составляет 75-90% при практически полной гибели в контроле, после облучения дозой 8,0 Гр. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для создания на основе природных полисахаридов новых радиопротекторов.

Известен способ получения низкомолекулярного хитозана кислотным гидролизом хитозана с помощью азотистой кислоты [1]. Однако в этом случае трудно получить продукт со средневязкостной молекулярной массой ниже 20000 Да, к тому же происходит химическое дезаминирование концевого остатка сахара с изменением строения полисахарида.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана ферментативным гидролизом хитозана с помощью иммобилизованного хитиназного комплекса [2]. Главным достоинством этого способа является возможность получения с высоким выходом низкомолекулярного водорастворимого хитозана с высокой степенью чистоты. Однако процесс проводится в две стадии, сначала при рН 4,5-5,0, а потом при рН 6,0-6,5. Суммарное время проведения процесса составляет от 24 до 28 часов, и при этом получается хитозан с широким разбросом по средневязкостной молекулярной массе от 5 до 20 кДа.

С целью преодоления указанных недостатков предлагается упрощенный способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана ферментативным гидролизом раствора хитозана с последующим выделением фракции, характеризующейся радиопротекторными свойствами.

Выбор оптимальной средневязкостной молекулярной массы низкомолекулярного хитозана, получаемого предложенным способом, был осуществлен на основе сравнительной оценки показателей острой токсичности и противолучевой эффективности хитозанов с ММ 30, 10 и 5 кДа. Острую токсичность образцов хитозана определяли по показателю летальности в опытах на нелинейных мышах-альбиносах. Наблюдение за животными проводили в течение 5 суток после внутривенного введения образцов в разных дозах. Результаты обработаны пробит-методом и установлены значения полулетальных доз (СД 50), а также СД 84 и СД 16. Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что по мере уменьшения молекулярной массы хитозана уменьшается и его токсичность.

Противолучевая (защитная) эффективность хитозана исследована на нелинейных белых мышах и гибридах F1(CBAC57B1). Образцы с ММ 30, 10 и 5 кДа вводили внутривенно перед облучением (за 10-20 минут). Мышей облучали гамма-лучами Cs137 в дозах 8,0 и 8,25 Гр с мощностью 1,25 Гр/мин. Установлено, что хитозан с ММ 30 и 10 кДа, вводимый соответственно в дозе 20 и 50 мг/кг, способствует выживаемости 89-100% животных при почти полной гибели контрольных. Увеличение или уменьшение доз этих образцов приводит к уменьшению или отсутствию защитного действия. При использовании хитозана с ММ 5 кДа защитное действие либо заметно уменьшается, либо не проявляется совсем.

Таким образом, по совокупности свойств, т.е. проявлению наименьшей токсичности при максимальной противолучевой защите, оптимальными оказались образцы хитозана с ММ 102 кДа.

Сущность предложенного способа заключается в том, что 1-2% раствор хитозана при рН 4,5-5,5 инкубировали при 40-50^oС в присутствии комплекса хитинолитических ферментов в течение 20-60 минут. Затем реакционную массу выдерживали 3-7 минут на кипящей водяной бане, охлаждали, фильтровали и фракционировали либо с помощью хроматографии, либо с помощью мембранных технологий, выделяя при этом фракцию с ММ от 8 до 12 кДа. Продукт диализовали против воды и высушивали. Полученное вещество водорастворимо (до 50 мг в 1 мл) и легко стерилизуется кипячением, нетоксично.

Пример 1.

Растворяют 1 г крабового хитозана со степенью деацетилирования (СД) 85% и молекулярной массой около 400 кДа в 100 мл 0,2 М ацетата натрия при рН 5,0. Раствор нагревают до 45^oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii (1 единицу активности) и инкубируют 30 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 5 минут на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют на роторном испарителе, фильтруют и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Био-Гель П-4, уравновешенную 0,1 М ацетатом натрия при рН 6,0. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с ММ 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и лиофильно высушивают.

Получают 0,7 г низкомолекулярного хитозана в виде белого порошка, растворимого в воде.

Эффективность низкомолекулярною хитозана с ММ 8-12 кДа устанавливалась в опытах на облученных мышах. Хитозан вводили мышам F₁(CBAC57B1) внутривенно в дозе 50 мг/кг за 10-30 мин до облучения в дозе 8,25 Гр: из 7 защищенных мышей через 30 суток после облучения выжило 7 при гибели всех контрольных животных.

Пример 2.

Растворяют 1 г хитозана антарктической креветки (криля) со СД 90% и молекулярной массой 150 кДа в 100 мл 0,1 М ацетата натрия при рН 5,5. Раствор нагревают до 50^oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости (0,5 единиц активности) и инкубируют 60 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 3 минуты на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют методом ультрафильтрации до объема 10 мл, фильтруют и наносят на колонку с сорбентом Сефадекс Г-25, уравновешенную 0,15 М ацетатом натрия при рН 5,0. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с молекулярной массой 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и высушивают на распылительной сушилке. Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана в виде белого водорастворимого порошка.

Изучение эффективности проведено аналогично примеру 1 на нелинейных мышах альбиносах, облученных в дозе 8,0 Гр: к концу срока наблюдения (30 суток) из 11 защищенных хитозаном мышей выжило 10, в контроле из десяти – одна.

Пример 3.

Растворяют 1 г хитозана креветки со СД 75% и ММ 250 кДа в 100 мл 0,3 М ацетата натрия при рН 4,5. Раствор нагревают до температуры 40^oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii (2 единицы активности) и инкубируют 45 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 7 минут на кипящей бане, охлаждают, концентрируют на роторном испарителе до объема 10 мл, фильтруют и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Фрактогель HW-50, уравновешенную 0,05 М ацетатом натрия при рН 5,5. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с ММ 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и лиофильно высушивают.

Получают 0,5 г низкомолекулярного хитозана в виде белого порошка, растворимого в воде.

Эффективность полученного хитозана изучена аналогично примеру 2. Введение хитозана до облучения способствовало выживанию 8 мышей из 10, при этом в контроле пали все 10 мышей.

Пример 4
Аналогично примеру 1, однако берут хитозан со СД 95% и ММ 200 кДа.

Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 5
Аналогично примеру 1, однако берут фермент в количестве 0,5 единиц и время гидролиза составляет 50 минут.

Получают 0,7 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 6
Аналогично примеру 1, только хитозан растворяют при рН 4,5, при этом же значении и проводят гидролиз в течение 40 минут.

Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 7
Аналогично примеру 1, только хитозан берут со СД 70% и процесс гидролиза проводят 45 минут.

Получают 0,5 г низкомолекулярного хитозана.

Противолучевая активность образцов, полученных в примерах 4-7, изучена в четырех последовательных сериях экспериментов на нелинейных мышах аналогично примеру 2. Выживаемость животных, защищенных хитозаном, составила 87%, 75%, 80% и 90% при практически полной гибели в контроле.

Предложенный способ экологически безопасен, менее трудоемок по сравнению с известными способами и позволяет получать продукт высокого качества с выходом 50-70%.

Источники информации

2. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Патент РФ N 2073016, Бюлл. 4, 1997.

Формула изобретения

Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов ферментативным расщеплением раствора хитозана, отличающийся тем, что ферментативное расщепление проводят растворимым комплексом микробных хитинолитических ферментов при рН 4,5-5,5, температуре 40-50^oС в течение 30-60 мин при соотношении хитиназная активность-хитозан от 0,5 до 2,0 ед. активности на 1 г хитозана, затем реакционную массу выдерживают 3-7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют, фильтруют, фракционируют и полученный раствор диализуют против воды.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.12.2004

Извещение опубликовано: 20.02.2006 БИ: 05/2006