Патент на изобретение №2188037

(54) ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АГОНИСТА-ЛИГАНДА, СПЕЦИФИЧНОГО ДЛЯ РЕЦЕПТОРОВ ТИПА RAR-, ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ СКОРОСТИ АПОПТОЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, конкретно – к фармакологии, а также к дерматологии и косметологии. Предложено новое средство для увеличения скорости апоптоза в раковых клетках, в клетках в предраковом состоянии и в тимоцитах. В качестве такого средства используется агонист-лиганд, специфичный для рецепторов типа RAR-. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения или профилактики рака, для снижения эффектов, приводящих к отторжению трансплантата. Кроме того, изобретение можно использовать для предупреждения и лечения старения кожи. 3 с. и 9 з.п.ф-лы, 1 табл.

Настоящее изобретение относится к использованию определенных ретиноидов для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для увеличения скорости апоптоза. Эти ретиноиды также можно использовать в косметических композициях, которые, в частности, предназначены для предупреждения и/или борьбы со светоиндуцированным и/или возрастным старением кожи.

В гибель клеток вовлекаются два механизма. Первый, представляющий собой классический тип, называется некрозом. Морфологически некроз характеризуется набуханием митохондрий и цитоплазмы, деформацией ядра с последующей деструкцией клетки и ее аутолизисом, последний сопровождается воспалением. Некроз протекает в пассивной или внезапной форме. Например, некроз тканей обычно возникает в результате того, что клетки подвергались физической травме или воздействию химического яда.

Другая форма смерти клетки называется апоптозом (Кеrr J.F.R. and Wyllie A. H. , Br. J.Cancer, 265, 239, (1972)), однако в противоположность некрозу апоптоз не приводит ни к какой воспалительной реакции. Сообщалось о том, что апоптоз может иметь место при различных физиологических состояниях. Это высоко избирательная форма гибели клеток характеризуется хорошо заметными морфологическими и биохимическими признаками. Так, особенно характерны конденсация хроматина, которая связана или нет с эндонуклеазной активностью, образование апоптозных телец и фрагментация дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в результате активации эндонуклеаз на фрагменты ДНК, состоящие из 180-200 пар оснований (эти фрагменты можно обнаружить с помощью электрофореза в агарозовом геле).

Апоптоз можно рассматривать как запрограммированную гибель клеток, которые участвуют в процессах развития, дифференциации и восстановления тканей. Также можно полагать, что дифференциация, рост и созревание клеток тесно связаны с апоптозом и что вещества, способные влиять на дифференциацию, рост и созревание клеток, также связаны с явлением апоптоза.

В области медицины при многих патологических состояниях имеет место модифицированный и даже неуправляемый механизм апоптоза. Так, сообщалось о том, что преднамеренная модуляция апоптоза, его индуцированием или подавлением, может позволить лечить большое количество заболеваний и, в частности, заболеваний, связанных с клеточной гиперпролиферацией, как это имеет место при раке, аутоиммунных заболеваниях и аллергиях, или, с другой стороны, заболеваний, связанных с исчезновением клеток, как в случае вируса синдрома иммунодифицита человека (ВИЧ), нейродегенеративных заболеваний (болезнь Алзеймера) или значительных поражений, возникающих в результате инфаркта миокарда.

Особо было отмечено в онкологии, что большое количество противоопухолевых препаратов, таких как дексаметазон, циклофосфамид и цисплатин, способны индуцировать апоптоз.

В области косметологии апоптоз играет особую роль при признаках старения кожи, возникающих в основном в результате дисфункции главных биологических механизмов кожи. Следовательно, возможно представить, что любой продукт, который индуцирует механизм апоптоза, является продуктом, приемлемым для предупреждения и/или борьбы с появлением признаков старения и имеющимися признаками старения, такими как крупные или мелкие морщины.

В области ретиноидов известно, что полностью транс-ретиноевая кислота является мощным модулятором (т.е. ингибитором или, с другой стороны, стимулятором, в зависимости от природы обрабатываемых клеток) дифференциации и пролиферации многих нормальных и трансформированных клеточных типов. Например, она ингибирует дифференциацию эпителиальных клеток, таких как клетки рогового слоя эпидермиса. Она также подавляет пролиферацию многих трансформированных клеток, таких как клетки меланомы. Подобное действие на пролиферацию или дифференциацию может одновременно проявляться в отношении одного и того же типа клеток, как, например, в случае клеток человеческих промиелоцитов HL-60; так, известно, что пролиферация этих клеток ингибируется полностью транс-ретиноевой кислотой, и в то же время индуцируется их дифференциация в гранулоциты и их апоптоз.

Известно, что в целом полностью транс-ретониевая кислота оказывает влияние на дифференциацию и пролиферацию клеток посредством взаимодействия с нуклеорецепторами, которые называют RAR-рецепторы (рецепторы ретиновой кислоты) и которые находятся в клеточном ядре. В настоящее время идентифицировано три подтипа RAR-рецепторов, обозначенных RAR-,, RAR- и RAR, соответственно. После связывания с лигандом (т.е. полностью транс-ретиноевой кислотой) данные рецепторы взаимодействуют со специфическими ответными элементами (RARE) в промоторной области генов, регулируемых ретиноевой кислотой. Для того, чтобы связаться с ответными элементами, RARs гетеродимеризуются с рецептором другого типа, известным как RXR-рецепторы. Природным лигандом для RXRs является 9-цис-ретиноевая кислота. RXRs считаются образцовыми регуляторными белками, поскольку они взаимодействуют с другими членами подгруппы стероидных /тиреоидных рецепторов, таких как рецептор для витамина Д₃ (VDR), рецептор для трийодтироксина (TR) u PPARs (пероксисомальные рецепторы, активирующие пролиферацию) с образованием гетеродимеров, как это происходит с RARs. Более того, RXRs способны взаимодействовать со специфическими ответными элементами (RXRE) в форме гомодимеров. Наличие этих сложных взаимодействий, существование многочисленных RAR- и RXR-рецепторов, которые экспрессируются по-разному в зависимости от ткани и типа клеток, объясняет плейотропное действие ретиноидов фактически во всех клетках.

В литературе уже давно описано большое количество синтетических структурных аналогов полностью транс-ретиноевой кислоты или 9-цис-ретиноевой кислоты, обычно называемых “ретиноидами”. Некоторые из этих молекул способны связываться и специфически активировать RARs или, с другой стороны, RXRs. Более того, некоторые аналоги способны связываться и активировать определенный подтип RAR-рецепторов (, или ). Наконец, другие аналоги не проявляют никакой особой избирательной активности в отношении этих различных рецепторов. В этом отношении, например, 9-цис-ретиноевая кислота активирует как RARs, так и RXRs без какой-либо избирательности к какому-нибудь из этих рецепторов (неспецифичный агонист-лиганд), в то время как полностью транс-ретиноевая кислота избирательно активирует RARs (RAR – специфичный агонист-лиганд) независимо от подтипа. В целом, в качественном отношении данное вещество (или лиганд) является специфичным для рецепторов данной группы (или по отношению к особому рецептору этой группы), когда упомянутое вещество проявляет более сильное сродство ко всем рецепторам этой группы (или соответственно к особому рецептору этой группы) по сравнению с тем, который проявляется в отношении всех рецепторов любой другой группы (или соответственно для всех других рецепторов этой же группы или другой).

Сообщалось, что 9-цис-ретиноевая кислота и полностью транс-ретиноевая кислота являются модуляторами апоптоза (активатором или ингибитором апоптозом, в частности, в зависимости от типа клеток) и что из двух этих модуляторов 9-цис-ретиноевая кислота более активна, это явление можно объяснить тем фактом, что 9-цис-ретиноевая кислота активирует как RARs, так и RXRs в противоположность полностью транс-ретиноевой кислоте, которая активирует только RARs.

В связи с вышесказанным представляет интерес поиск новых модуляторов апоптоза.

В этом отношении обнаружено, что агонисты-лиганды, которые специфичны для рецепторов типа RAR-, представляют собой прекрасные индукторы апоптоза для разнообразных клеточных типов, и особенно в отношении тимоцитов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию по меньшей мере одного агониста-лиганда, специфичного для рецепторов типа RAR- для приготовления фармацевтической композиции, которая предназначена для увеличения скорости апоптоза по меньшей мере в одной клеточной популяции, в которой апоптоз может быть индуцирован посредством активации рецепторов типа RAR-.
Изобретение также относится к использованию в косметической композиции по меньшей мере одного агониста-лиганда, специфичного для рецепторов типа RAR-, в качестве индуктора апоптоза по меньшей мере в одной клеточной популяции кожи, в которой апоптоз может быть индуцирован посредством рецепторов типа RAR-.
Таким образом, эта композиция даст возможность предупреждать и/или бороться со светоиндуцированным или возрастным старением кожи, в частности, путем удаления посредством апоптоза клеток кожи, которые проявляют недостаток в их восстановительной функции и которые накапливаются в течение времени.

Следовательно, изобретение, наконец, относится к косметическому способу предупреждения и/или борьбы со светоиндуцированным или возрастным старением кожи, отличающемуся тем, что индуцирующая апоптоз косметическая композиция, такая как описана ранее, применяется на кожу.

Фармацевтическая или косметическая композиция изобретения включает физиологически приемлемую среду.

Под агонистом-лигандом, специфичным для рецепторов типа RAR-, в соответствии с настоящим изобретением, понимают агонист-лиганд, который имеет отношение R константы диссоциации этого лиганда для рецепторов типа RAR- к константе диссоциации этого лиганда для рецепторов типа RAR- выше или равным 10 и который индуцирует дифференциацию F9 клеток.

Так, известно, что полностью транс-ретиноевая кислота и некоторые из ее аналогов способны индуцировать дифференциацию мышиных эмбриональных клеток тератокарциномы (F9 клеток); следовательно, они рассматриваются в качестве агонистов для RAR-рецепторов. Секреция плазминогенного активатора, который сопровождает эту дифференциацию, является показателем ответной биологической реакции F9 клеток на ретиноиды (Skin pharmacol., 1990; 3: рр.256-267).

Константы диссоциации определяют с помощью тестов, которые являются стандартными для специалиста в данной области. Эти тесты описаны, в частности, в следующих источниках:
1. “Selective Synthetic Ligands for Nuclear Retinoic Acid Receptor Subtypes” in RETINOIDS, Progress in Research and Clinical Applications, Chapter 19 (pp. 261-267), Marcel Dekker Inc., edited by Maria A. Livrea and Lester Packer;
2. “Synthetic Retinoids: Receptor Selectivity and Biological Activity” in Pharmacol Skin, Basel, Karger, 1993, Volume 5, pp. 117-127;
3. “Selective Synthetic Ligands for Human Nuclear Retinoic Acid Receptors” in Skin Pharmacology, 1992, Vol.5, pp. 57-65;
4. “Identification of Synthetic Retinoids with Selectivity for Human Nuclear Retinoic Acid Receptor-” in Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.186, No. 2, July 1992, pp. 977-983;
5. “Selective High Affinity RAR- or RAR- Retinoic Acid Receptor Ligands” in Mol. Pharmacol., Vol.40, pp. 556-562.

Другие характеристики, аспекты, цели и преимущества данного изобретения станут яснее из приведенного ниже описания, а также из различных конкретных примеров, которые предназначены для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Агонистами-лигандами, специфичными для рецепторов типа RAR-, и которые могут быть упомянуты, являются 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойная кислота, (Е)-4-(1-гидрокси-1-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-2-пропенил)бензойная кислота, 4-[(Е)-2-(3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-1-пропенил] бензойная кислота, 5′,5′,8′,8′-тетраметил-5′,6′, 7′,8′-тетрагидро-[2′,2′]бинафталенил-6-карбоновая кислота, 2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-бензо [в] тиофен-6-карбоновая кислота, 4-(5,5,8,8-тетраметал-5,6,7,8-тетрагидро-нафто [2,3-в] тиофен-2-ил) бензойная кислота, 6-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафталин-2-карбонил) нафталин-2-карбоновая кислота, 3,7-диметил-7-(1,2,3,4-тетрагидро-1,4а,9в-триметил-1,4-метанодибензофуран-8-ил)-2,4,6-гептатриеновая кислота, 6-(1,2,3,4, -тетрагидро-1,4а, 9в-триметил-1,4-метандибензофуран-8-ил)-нафталин-2-карбоновая кислота, 6-[гидроксиимино-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8- тетрагидро-нафтален-2-ил-метил] нафталин-2-карбоновая кислота, 4-[(6-гидрокси-7-(1-адамантил)-2-нафтил] бензойная кислота, 5-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-антрацен-2-ил)-тиофен-2-карбоновая кислота, (-), -6-[гидрокси-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-метил] -нафталин-2-карбоновая кислота, 6-(3-адамантан-1-ил-4-проп-2-инилокси-фенил)-нафталин-2-карбоновая кислота, 4-[(2-оксо-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-этокси] -бензойная кислота, 4-[2-оксо-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-ацетиламино]-бензойная кислота, 4-[2-фтор-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-ацетиламино]-бензойная кислота, 6-[3-(1-адамантил-4-(2-гидроксипропил)фенил]-2-нафтойная кислота, 5-[3-оксо-3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-пропенил] -тиофен-2-карбоновая кислота, 6-[3-(1-адамантил-4-(2,3-ди-гидроксипропил)фенил] -2-нафтойная кислота, 4-[3-гидрокси-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-1-пропинил] -бензойная кислота, 4-[3-оксо-3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-проп-1-инил] бензойная кислота, 4-[(3-(1-метилциклогексил)-4-гидроксифенил)винил] -бензойная кислота, 4-[(Е)2-(3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-винил]-бензойная кислота, 4-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенилэтинил] -бензойная кислота, 5-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенилэтинил] -2-тиофенкарбоновая кислота, 5-[3-(1-адамантил)-4-метоксифенилэтинил]-2-тиофенкарбоновая кислота, 4-[2-(3-трeт-бутил-4-метоксифенил)-пропенил] бензойная кислота, 4-{2-[4-метокси-3-(1-метилциклогексил) фенил]-пропенил}-бензойная кислота, 6-[3- (1-адамантил)-4-(3-метокси-2-гидроксипропил)-фенил] -2-нафтойная кислота, 2-гидрокси-4-[3-гидрокси-3-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-1-пропинил] -бензойная кислота, 6-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтолен-2-илокси)-нафтолин-2-карбоновая кислота, 6-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил-сульфанил)-нафталин-2-карбоновая кислота, 4-[2-пропоксиимино-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-ацетиламино] бензойная кислота, 6-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил-амино)нафталин-2-карбоновая кислота, 1-метил-4-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидроантрацен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота, 2-метокси-4-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-антрацен-2-ил)-бензойная кислота, 4-[2-нонилоксиимино-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-ацетиламино] -бензойная кислота, (-)-2-гидрокси-4-[3-гидрокси-3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-проп-1-инил]-бензойная кислота, (+)-2-гидрокси-4-[3-гидрокси-3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-проп-1-инил] -бензойная кислота, 2-гидрокси-4-[3-гидрокси-3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-бут-1-инил] -бензойная кислота, 6-(3-бром-5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-илокси)-нафталин-2-карбоновая кислота, 3-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-2Н-1-бензопиран] -7-карбоновая кислота, 4-[3-(3,5-ди-трeт-бутил-4-гидрокси-фенил)-проп-1-инил] бензойная кислота, 4-[3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-проп-1-инил]-бензойная кислота, 4-[3-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8- тетраметил-2-нафтил)-1-пропинил] -салициловая кислота, 4[{3-(1-адамантил)-4-(2-гидроксиэтил)-фенил}этинил]-бензойная кислота и 4-[{3-(1-адамантил)-4-(3-гидрокси-пропил)фенил}этинил] -бензойная кислота.

В настоящем изобретении предпочтительно использовать агонисты-лиганды, специфичные для рецепторов типа RAR-, которые имеют отношение R, большее или равное 50. К таким соединениям относятся: 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойная кислота, 6-(5,5,8,3-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафтален-2-карбонил)-нафталин-2-карбоновая кислота, 6-(1,2,3,4-тетрагидро-1,4а, 9в-триметил-1,4- метанодибензофуран-8-ил)-нафталин-2-карбоновая кислота, 6-[гидроксиимино-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-метил] -нафталин-2-карбоновая кислота, 5-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-антрацен-2-ил)-тиофен-2-карбоновая кислота, (-)-6-[гидрокси-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафтален-2-ил)-метил] -нафталин-2-карбоновая кислота, 6-[3-(1-адамантил-4-(2-гидроксипропил)-фенил] -2-нафтойная кислота, 6-[3- (1-адамантил-4-(2,3-дигидроксипропил)-фенил]-2-нафтойная кислота, 4-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенилэтинил]-бензойная кислота, 5-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенилэтинил] -2-тиофенкарбоновая кислота, 5-[3-(1-адамантил)-4-метоксифенилэтинил] -2-тиофенкарбоновая кислота, 6-[3-(1-адамантил)-4-(3-метокси-2-гидроксипропил)-фенил] -2-нафтойная кислота, 1-метил-4-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидроантрацен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота, (-)-2-гидрокси-4-[3-гидрокси-3-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8- тетрагидронафтален-2-ил)-проп-1-инил]-бензойная кислота и 2 гидрокси-4-[3-гидрокси-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-нафтален-2-ил)-бут-1-инил]-бензойная кислота.

Особенно предпочтительна 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойная кислота.

Таким образом, будет возможным использовать фармацевтическую композицию, включающую агонист-лиганд, специфичный в отношении рецепторов типа RAR-, в тех случаях, когда необходимо увеличить скорость апоптоза. Естественно, что этот эффект будет достигаться только в клеточных популяциях, в которых апоптоз может индуцироваться путем активации рецепторов типа RAR- и следовательно, особенно в тех, где присутствуют рецепторы типа RAR-, и особенно в клетках, происходящих из тимуса.

Необходимость в увеличении скорости апоптоза может возникнуть в основном в двух случаях. Первый случай относится к заболеваниям или нарушениям, связанным с неадекватной скоростью апоптоза. Второй случай относится к терапии, необходимой во время трансплантации в целях подавления эффектов, приводящих к отторжению трансплантированного органа. Таким образом, возможно регулировать увеличение иммунотолерантности в отношении трансплантированного органа путем снижения иммунной ответной реакции Т-клеток посредством индуцирования скорости их апоптоза.

Заболевания или нарушения, связанные с неадекватной скоростью апоптоза и которые могут быть указаны особо, представляют собой нарушения, возникающие при предраковых состояниях или раковых заболеваниях, которые могут быть результатом пролиферации определенных клеточных популяций, аутоиммунные заболевания, аллергии или воспалительные реакции, при которых число клеток, вызывающих повреждение, оказывается слишком высоким, или также некоторые вирусные инфекции, при которых белки вируса обладают антиапоптозным действием.

Таким образом, в случае аутоиммунных заболеваний особо следует упомянуть инсулинзависимый диабет, активный хронический гепатит, ревматоидный артрит, пемфигус, множественный склероз, миастения, системная красная волчанка, болезнь Крона и псориаз. Можно упомянуть актиничный кератоз, как предраковое состояние. В случае раковых заболеваний особо следует назвать лимфомы, карциномы, такие как раковые поражения, эндокринологические сферы и гормонзависимые опухоли, такие как раковые поражения яичника. Из упомянутых выше вирусных инфекций особо следует перечислить герпесвирусы, аденовирусы и вариола вирусы (осповирусы). В число аллергий и воспалительных реакций, которые можно упомянуть, входят контактная экзема, атопическая экзема, астма и крапивница.

В соответствии с настоящим изобретением композицию можно вводить энтеральным, парентеральным, местным и внутриглазным путем. Предпочтительно фармацевтическая композиция пакуется в формы, приемлемые для системного способа введения (для инъекций или вливаний).

При введении энтеральным путем композиция, в частности фармацевтическая композиция, может быть в форме таблеток, твердых желатиновых капсул, таблеток с покрытием, сиропов, суспензий, растворов, порошков, гранул, эмульсий, микросфер или наносфер или липидных или полимерных везикул, при которых возможно достичь контролируемого высвобождения. При введении парентеральным путем композиция может быть в форме растворов или суспензий для вливания или инъекций.

Агонисты-лиганды, которые специфичны для рецепторов типа RAR-, и которые используют в настоящем изобретении, в основном вводят в суточной дозе от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг массы тела, причем дозу вводят за от 1 до 3 раз.

При местном введении фармацевтическая или косметическая композиция по изобретению предназначена для лечения кожи и слизистых оболочек и может находиться в форме мазей, кремов, молочка, помад, порошков, всасывающихся буферов, растворов, гелей, аэрозолей, лосьонов или суспензий. Она также может быть в форме микросфер или наносфер или липидных или полимерных везикул, или полимерных пластырей, или гидрогелей, при которых возможно достичь контролируемого высвобождения. Композиция, которую вводят местным путем, может находиться либо в безводной, либо в водной форме.

При введении внутрь глаза композиция в основном находится в форме глазных капель.

Агонисты-лиганды, специфичные для рецепторов типа RAR-, используют при накожном или внутриглазном введении в концентрации, которая обычно находится между 0,001% и 10% от массы, предпочтительнее между 0,1 и 1% от массы композиции.

Наконец, настоящее изобретение относится к способу предупреждения и/или борьбы со светоиндуцированным или возрастным старением кожи, отличающемуся тем, что косметическая композиция, которая индуцирует апоптоз, как описано выше, которая включает по меньшей мере один агонист-лиганд, специфичный для рецепторов типа RAR-, в косметически приемлемой среде, наносится на кожу.

Естественно, композиции, ранее описанные, дополнительно могут включать инертные или даже фармакодинамические активные добавки или комбинации этих добавок, в частности: смачивающие агенты; депигментирующие вещества, такие как гидрохинон, азелаиновая кислота, кофейная кислота или койевая кислота, мягчительные средства; увлажняющие вещества, такие как глицерин, ПЭГ 400, тиаморфолин и его производные или мочевина; вещества против перхоти или против прыщей, такие как S-карбоксиметилцистеин, S-бензил-цистеамин и их соли или производные или перикись бензоила; противогрибковые агенты, такие как кетоконазол или полиметилен-4,5-изотиоазолидонин-3-оны; антибактериальные агенты, каротиноиды и, в частности, -каротин; агенты против псориаза, такие как антролин и его производные; и, наконец, эйкоза-5,8,11,14-тетраноевая или эйкоза-5,8,11-триноевая кислота и их эфиры и амиды.

Эти композиции также могут включать вещества, улучшающие вкус, консерванты, такие как эфиры парагидроксибензойной кислоты, стабилизаторы, вещества, регулирующие влажность, вещества, регулирующие pН, вещества для изменения осмотического давления, эмульгаторы, УФ-А и УФ-В фильтры, антиоксиданты, такие как -токоферол, бутилгидроксианизол или бутил гидрокситолуол.

Естественно, специалисту в данной области понятно, что возможно соединение(я), добавляемое(ые) в эти композиции, выбирается/выбираются таким образом, что преимущества данного изобретения не изменяются или изменяются несущественно при их добавлении.

Далее представлено несколько примеров, которые предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения его объема.

Пример 1
Данный эксперимент демонстрирует эффективность агониста-лиганда в условиях in vivo, специфичного для RAR-, в качестве индуктора апоптоза.

Использовали самцов мышей NMRI в 4-недельном возрасте (поставлены LATI, , Венгрия). Для того, чтобы индуцировать апоптоз в тимусе, этим самцам мышей вводят однократную инъекцию либо 0,5 мг дексаметазона, или 0,5 мг 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойной кислоты, растворенных в смеси 0,8 мл физиологического раствора и 0,2 мл этанола.

Дексаметазон является хорошо известным индуктором апоптоза. Так, наблюдается инволюция тимуса: т.е. снижение примерно на 75% массы тимуса через 48 часов после вышеупомянутой обработки. Подобный эффект наблюдается и при введении 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойной кислоты, в этом случае отмечается снижение массы тимуса примерно на 60% через 48 часов после обработки.

Дополнительно, при аналогичной постановке опыта, через различные интервалы времени после обработки отбирали образцы тимуса у необработанных и обработанных животных. После промывки и гомогенизации определяли активность трансглютаминазы по включению [³Н] путресцина в N,N’-диметилказеин. Активность трансглютаминазы рассчитывается в нмолях [³Н] путресцина, включенного в белок в час.

Сообщалось о том, что тканевая трансглютаминаза является одним из элементов, принимающим участие в развитии апоптоза (Piacentini M. et al. (1994). Apoptosis: The Molecular Basis of Apoptosis in Disсase. Curr. Comm. in Cell Mol. Biol., 8 (Tomei L.D. and Cope, T.O.ed) pp.143-165). Так, наблюдали, что вышеописанная инволюция тимуса возникает в результате обработки мыши агонистом-лигандом, специфичным в отношении RAR-, и является явлением, которое сопутствует и пропорционально активности тканевой трансглютаминазы.

Более того, подобную инволюцию тимуса коррелируют с появлением ДНК-фрагментов, которые определяют анализом электрофореза в агарозовом геле ДНК, выделенной из тимуса обработанных животных (детально методика представлена в примере 2).

Пример 2
Этот пример показывает эффективность in vitro агониста-лиганда, специфичного для рецепторов типа RAR-, в качестве индуктора апоптоза в сравнении с другими типами ретиноидов.

Культивирование и приготовление клеток
Суспензии тимоцитов готовили из тимуса необработанных 4-недельных самцов мышей NMRI (поставлены LATI, , Венгрия). В качестве среды использовали среду RPMI 1640 Sigma, обогащенную фетальной телячьей сывороткой Gibco, 2 мМ глютамина, 100 ME пенициллина и 100 мкг стрептомицина/мл. Затем тимоциты промывали и разводили до конечной концентрации 10⁷ клеток/мл перед инкубацией при 37^oС в увлажненном инкубаторе в атмосфере с 5% СО₂ и 95% воздуха. Гибель клеток измеряли по поглощению трипанового синего.

Качественный и количественный анализ ДНК
Тимоциты инкубировали в 24 лунках с различными тестируемыми веществами при разных концентрациях. Через 6 часов инкубации 0,8 мл клеточных суспензий лизировали добавлением 0,7 мл лизирующего буфера, содержащего 0,5% (объем/к объему) Тритона Х-100, 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, pН 8,0 перед центрифугированием при 13000 g в течение 15 минут.

Количественный анализ ДНК: ДНК, находящуюся в надсадочной жидкости (фрагменты) и осадке (интактный хроматин) осаждали эквивалентным количеством 10% трихлоруксусной кислоты, ресуспендировали в 5% трихлоруксусной кислоте и затем определяли количественно, используя дифениламиновый реагент (Burton К. (1956), Biochem. J., 62, 315-322).

Качественный анализ ДНК: параллельно надсадочную жидкость обрабатывали этанолом, включающим 0,15 мМ СаСl, и отстаивали в течение ночи для осаждения осадка. Осадки повторно растворяли в буфере, содержащем 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pН 8,0, и эти растворы затем обрабатывали РНК-азой; затем последовательно экстрагировали равным объемом фенола и хлороформа/изоамилового спирта (24/1), после чего ДНК осаждали в этаноле перед проведением электрофореза в течение 3 часов при 60 v в 1,8% агарозовом геле. Фрагменты ДНК затем проявляли УФ-светом после окрашивания геля этидиум бромидом. Полученные гели представляли собой картину “лестницы” ДНК-фрагментов, состоящих из 180-200 пар оснований и которые были типичны для индукции апоптоза. В течение всего опыта степень фрагментации коррелировала с количеством погибших клеток, дающих положительную реакцию с трипановым синим.

Результаты количественного анализа представлены в таблице.

Процент фрагментов ДНК в этой таблице соответствует разнице между процентом фрагментов ДНК, полученных в обработанных тимоцитах, и процентом фрагментов ДНК, полученных в необработанных тимоцитах (базовая скорость апоптоза для этих тимоцитов).

Данные показывают, что процент появления фрагментов ДНК возрастает с увеличением R. Таким образом, действие, индуцирующее апоптоз, увеличивается с возрастанием специфичности лиганда в отношении RAR-.р

Формула изобретения

1. Применение по меньшей мере одного агониста-лиганда к рецепторам ретиноевой кислоты типа RAR- в качестве средства для индукции апоптоза в, по меньшей мере, одной популяции раковых клеток или клеток в предраковом состоянии, или в тимоцитах.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист-лиганд к рецепторам типа RAR- представляет собой 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойную кислоту, (Е)-4-(1-гидрокси-1-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-2-пропенил)бензойную кислоту, 4-[(Е)-2-(3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-1-пропенил]бензойную кислоту.

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что агонист-лиганд к рецепторам типа RAR- имеет отношение R выше или равное 50.

4. Применение по одному из пп.1-3, отличающееся тем, что агонист-лиганд к рецепторам типа RAR- представляет собой 6-3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил)-2-нафтойную кислоту.

5. Применение по одному из пп.1-4 для лечения заболеваний или нарушений, связанных с недостаточной скоростью апоптоза.

6. Применение по п.5, отличающееся тем, что заболевания или нарушения, связанные с недостаточной скоростью апопотоза, являются раковыми заболеваниями или предраковыми состояниями.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что раковые заболевания представляют собой раковые эндокринологические заболевания и раковые поражения яичника.

8. Применение по одному из пп.1-4 для снижения эффектов, приводящих к отторжению трансплантированного органа.

9. Применение по меньшей мере одного агониста-лиганда, специфичного к рецепторам ретиноевой кислоты типа RAR-, в косметической композиции в качестве индуктора апоптоза в по меньшей мере одной популяции клеток кожи, в которой апоптоз может быть индуцирован посредством активации рецепторов типа RAR-.
10. Применение по п.9, отличающееся тем, что агонист-лиганд, специфичный к рецепторам типа RAR-, выбирают из соединений, перечисленных в п.2.

11. Косметический способ предупреждения и/или борьбы со светоиндуцированным или возрастным старением кожи, отличающийся тем, что косметическая композиция, индуцирующая апоптоз и включающая в косметически приемлемой среде по меньшей мере один агонист-лиганд, специфичный к рецепторам ретиноевой кислоты типа RAR-, наносится на кожу.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что агонист-лиганд, специфичный к рецепторам типа RAR-, выбирают из соединений, перечисленных в п.2.2

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.10.2005

Извещение опубликовано: 7.12.2006 БИ: 36/2006