Патент на изобретение №2188036

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕННОГО САПНОГО

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и может быть использовано для определения титра специфических антител при остром и хроническом сапе в реакции непрямой гемагглютинации. Сущностью изобретения является использование микробов штамма Ц-5 В. mallei в качестве производственного, извлечение из них видоспецифического антигенного комплекса 1% раствором цетавлона, модификация поверхности эритроцитов 0,005% раствором танина. Сенсибилизацию проводят при рН 7,0-7,2 путем смешения раствора антигенного комплекса и взвеси эритроцитов из расчета 100 мкг/мл 2,5% взвеси при температуре 2-6^oС с последующей инкубацией 18-20 ч. Техническим результатом является разработка высокочувствительного, специфического и стабильного эритроцитарного диагностикума и повышение точности диагностики. 5 табл.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения эритроцитарных диагностикумов, и может быть использовано для определения титра специфических антител при остром и хроническом сапе при помощи реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Известны способы приготовления эритроцитарных диагностикумов, предназначенных для серологической диагностики многих инфекционных заболеваний (см. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. П.Н. Бургасова. – М., 1978).

Общим с заявляемым способом являются этапы получения формалинизированных эритроцитов, выделения специфического антигена, использования его для приготовления диагностикума (сенсибилизация эритроцитов), розлива диагностикума в стеклотару и укупорки ее.

Указанные диагностикумы не могут быть использованы для определения сапных антител, поскольку их готовят на основе антигенных комплексов, не являющихся специфическими для возбудителя сапа. По этой причине они не способны вступать в реакцию агглютинации со специфическими антителами, обрадующимися в организме больного при сапной инфекции либо у иммунизированных сапной вакциной.

Рассматриваемые способы осуществляют по этапам, общим для способов приготовления эритроцитарных диагностикумов, рекомендованных для других возбудителей инфекционных заболеваний. Однако практического применения они не нашли, поскольку маллеин представляет собой продукт, содержащий не только специфические для сапа аллергены, но и не обладающие специфичностью продукты лизиса клеток, их метаболиты, а также компоненты питательной среды.

Способ включает следующие этапы:
выращивание культуры сапных микробов;
выделение “полного” сапного антигена при помощи панкреатического переваривания микробной массы с последующим алкогольным осаждением и диализом;
сенсибилизация танизированных эритроцитов крови барана антигеном в дозе 50 мкг на 1 мл 2,5% взвеси эритроцитов при рН 1,2 и температуре +4^oС, в течение 20 часов;
формалинизация готовых эритроцитов путем добавления 1% формалина.

Общим с заявляемым способом является последовательность этапов приготовления диагностикума.

Задачей изобретения является разработка высокочувствительного, специфического и стабильного эритроцитарного диагностикума, пригодного для определения при помощи РНГА титра антител при сапной инфекции и сапном вакцинном процессе, что необходимо для повышения точности диагностики.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе получения сапного эритроцитарного антигенного диагностикума, включающем этапы выращивания культуры, извлечение антигенного комплекса, модификацию поверхности эритроцитов танином, сенсибилизацию их антигенным комплексом, обработку формалином, предусмотрены следующие отличия:
для приготовления диагностикума в качестве производственного используют высоковирулентный штамм Ц-5 Burkholderia (Pseudomonas) mallei;
диагностикум готовят на основе антигенного комплекса, выделенного при помощи цетавлона-цетилтриметиламмоний бромида из высушенных ацетоном микробных клеток;
модификацию поверхности эритроцитов и нагрузку их антигенным комплексом осуществляют при экспериментально обоснованных условиях;
консервацию эритроцитов обеспечивают путем добавления 5% формалина.

Указанные отличия обусловлены следующими причинами:
микробы штамма Ц-5 являются типичными представителями В.mallei и обладают всеми характерными для данного вида бактерий морфологическими, культуральными, антигенными и вирулентными свойствами. По вирулентности для золотистых хомячков при подкожном заражении они превосходят примерно в 5 раз микробов штамма 5584, принятого на отечественных биофабриках в качестве производственного штамма для приготовления сапных диагностикумов;
обработка микробов сапа поверхностно-активным веществом – цетавлоном – позволяет экстрагировать высокоочищенный антигенный комплекс с высокой сорбционной активностью в отношении эритроцитов;
подготовка эритроцитов к нанесению антигенного комплекса проводится при экспериментально обоснованных условиях и включает фиксацию формалином с последующей модификацией поверхности эритроцитов танином;
экспериментально обоснованный режим сенсибилизации эритроцитов антигеном обеспечивает получение стабильного диагностикума с высокой серологической активностью;
стабилизация диагностикума методом “закрепления” с использованием формалина в обоснованной экспериментально концентрации позволяет определить допустимый срок хранения препарата до двух лет.

Способ включает следующие этапы:
выращивание культуры микробов штамма Ц-5;
выделение антигенного комплекса В.mallei;
подготовка эритроцитов к нагрузке антигенного комплекса;
приготовление эритроцитарного диагностикума;
контроль качества диагностикума;
розлив диагностикума в стеклотару и укупорка ее.

Способ выполняется следующим образом:
1. Выращивание культуры сапных микробов.

Исходным материалом служит лиофилизированная сапная культура штамма Ц-5, сохраняемая в ампулах под вакуумом. Для выращивания микробов готовят плотную питательную среду на основе недеионизированного солянокислого гидролизата казеина с содержанием аминного азота 25…35 мг%, глицерина – 10 мл/л и агар-агар – 1,5%. рН среды 6,8…7,0. Расплавленную питательную среду разливают по 300…500 мл в матрацы. Выращивание микробов осуществляют при температуре 36…38^oС в течение двух суток.

2. Получение антигенного комплекса.

Сформировавшуюся в матрацах культуру смывают 10…15 мл фосфатного буферного раствора рН 6,9…7,0. Суспензию охлаждают до температуры 2…4^oС. В соотношении 1: 2 по объему к суспензии добавляют охлажденный до температуры минус 20^oС ацетон. Смесь выдерживают при 2…4^oС 1 сутки. Затем клетки отделяют от ацетона путем фильтрования. Отстоявшийся ацетон сливают, к осадку клеток добавляют 3 объема охлажденного ацетона. Смесь снова выдерживают при 2. ..4^oС 1 сутки. После чего процедуру повторяют, добавив 5 объемов ацетона. Осадок помещают в эксикатор и высушивают до постоянного веса.

К ацетонвысушенным клеткам добавляют 1%-ый раствор цетавлона. Полученную суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 20…24^oС в течение 18…20 ч и осаждают центрифугированием. Антигенный комплекс выделяют из надосадочной жидкости, добавляя в соотношении 1:4 ацетон. Полученный антигенный комплекс помещают на фильтрованную бумагу и досушивают на воздухе.

Специфическую активность полученного антигенного комплекса определяют в реакции диффузной преципитации (РДП) с сапной поливалентной кроличьей сывороткой. Титр полученного антигена с концентрацией 10 мг/мл должен быть не менее 1:16.

3. Подготовка эритроцитов к нагрузке антигенного комплекса.

Кровь у интактных баранов отбирают в стеклянные колбы, смешивая с консервирующим раствором на основе цитрата натрия. Кровь в консервирующем растворе хранят при (22)^oС до 10 суток для отстаивания эритроцитов.

От сывороточных белков осадок эритроцитов отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,0…7,2).

Осадок отмытых эритроцитов взвешивают и из него готовят 15% (по весу) суспензию эритроцитов в забуференном физиологическом растворе. При перемешивании эритроцитарной суспензии с помощью магнитной мешалки к эритроцитам капельным способом добавляют формалин так, чтобы его конечная концентрация составила 15%.

Эритроцитарную суспензию отстаивают при (22)^oС в течение 3 суток.

Для последующей модификации поверхности эритроцитов полученную суспензию разводят физиологическим раствором в 10 раз. Затем к ней добавляют равный объем 0,005% раствора танина в физиологическом растворе. Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 минут 26…28^oС, эритроциты осаждают центрифугированием при 2000 об/мин. Осадок эритроцитов однократно отмывают забуференным физиологическим раствором и ресуспендируют в забуференном физиологическом растворе до 5% концентрации эритроцитов.

4. Приготовление эритроцитарного диагностикума.

К полученной суспензии танизированных эритроцитов добавляют равный объем 0,02% раствора сапного антигенного комплекса в забуференном физиологическом растворе. Суспензию перемешивают и выдерживают при 2…8^oС в течение 18…20 часов. Затем эритроциты центрифугированием при 2000 об/мин отмывают трехкратно забуференным физиологическим раствором. После чего осадок ресуспендируют в забуференном физиологическом растворе с 5% формалина до 10% концентрации эритроцитов.

Полученный эритроцитарный сапной антигенный диагностикум должен определять титр специфических антител с сапной поливалентной кроличьей сывороткой не ниже 1:10240…1:20480.

Диагностикум разливают по 5,0 мл во флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками. Гарантийный срок хранения диагностикума при условии его содержания при температуре (42)^oС составляет 2 года.

Для сравнения специфичности и чувствительности сапных антигенных эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемому способу и прототипу, были приведены две серии экспериментов. В первой исследовали в РНГА иммунные сыворотки против возбудителей туляремии, бруцеллеза, чумы, сальмонеллеза и сибирской язвы, полученные гипериммунизацией кроликов убитыми фенолом культурами F.tularensis, Br.melitensis, Y.pestis, S.typhimurium, B. anthracis. Bo второй серии опытов исследовали сыворотки от людей и обезьян павианов гамадрилов, не имевших контакта с возбудителем сапа, и обезьян, зараженных сапом. Павианы гамадрилы были использованы как одна из наиболее близких человеку биологических моделей. Результаты проведенных исследований обобщены в таблицах 1 и 2.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что диагностикум, приготовленный по прототипу, отличается меньшими специфическими свойствами, что снижает его диагностические возможности. Если диагностикум, приготовленный по заявляемому способу, не реагировал с чумной, сальмонеллезной, сибиреязвенной и туляремийной сыворотками, то диагностикум-прототип показал положительные результаты не только с бруцеллезной, но и с туляремийной сыворотками и в более высоких титрах. Существенным недостатком данного препарата являлось получение в пределах фоновых значений титров довольно большого количества неспецифических результатов, обусловленных перекрестными реакциями. При исследовании сывороток людей и обезьян павианов гамадрилов, не имевших контакта с возбудителями сапа, с помощью этого диагностикума были определены титры гемагглютининов от 1:10 до 1:320. С диагностикумом, приготовленным по заявляемому способу, эти же сыворотки реагировали в титрах 1: 10…1:20.

При анализе сывороток обезьян на 15…20 сутки после заражения сапом в РНГА с диагностикумом, полученным по прототипу, результаты оказались следующими: в 43% титр антител был 1:10 и 1:20 и лишь в 13% – 1:160 и выше. Тогда как с диагностикумом, полученным по заявляемому способу, при исследовании этих же сывороток гемагглютинины были выявлены в титре 1:160 и выше – в 97%.

Диагностическая ценность полученного диагностикума была изучена в ходе Государственных испытаний. В соответствии с Программой испытаний диагностикума эритроцитарного антигенного сапного в качестве контрольного препарата использовали диагностикум эритроцитарный сапной иммуноглобулиновый для выявления антител в реакции нейтрализации антигена (РНА_г). Материалами для исследования служили сыворотки крови от людей: здоровых, вакцинированных против чумы, туляремии, бруцеллеза, больных вирусным гепатитом; морских свинок: здоровых и инфицированных В.mallei; обезьян павианов гамадрилов: здоровых и инфицированных возбудителем сапа и мелиоидоза. Диагноз у больных животных был подтвержден клинически, серологически и патоморфологически.

Полученные результаты показали, что испытуемый препарат имеет значительные преимущества перед контрольным по следующим показателям:
по чувствительности: у больных сапом обезьян на 5…7 сутки после заражения диагностические титры антител 1:320 отмечались в 23,3% случаев, на 10.. .12 сутки – в 86,3%, на 15…21 сутки – в 100% случаев при применении испытуемого диагностикума; при использовании контрольного препарата на 5…7 сутки титры 1:320 наблюдались в 10%, на 10…12 сутки – в 13,4% и на 15…21 сутки – в 10% случаев;
по специфичности: при постановке РНГА с сыворотками здоровых людей с испытуемым диагностикумом фоновые (недиагностические) титры гемагглютининов 1: 20 обнаружены всего в 9% случаев, в то время как в РНА_г с контрольным препаратом фоновые значения титров составляли от 1:20 до 1:160 и обнаруживались у 55% обследованных здоровых людей; аналогичные результаты получены при исследовании сывороток крови людей, больных вирусным гепатитом, и здоровых обезьян;
при исследовании сыворотки крови от обезьян на 7 сутки после инфицирования возбудителем мелиоидоза результаты в РНГА с испытуемым диагностикумом оказались в 48 случаев с титром 1:20 и в 52%-1:160. При анализе контрольным методом – в 50% с титрами 1:40, а в 16,7% – с диагностическим титром 1:320;
по четкости реакции: испытуемый диагностикум давал четкую реакцию в 100% случаев, для контрольного этот показатель составил 91,7%;
по скорости учета результатов: реакцию учитывали для испытуемого препарата через 2…4 ч, можно и через 20 ч, результаты совпадали, для контрольного – только через 20 ч;
по простоте и времени постановки: РНГА является двухкомпонентной реакцией для испытуемого, а РНА_г – трехкомпонентной для контрольного препарата.

Результаты Государственных испытаний позволили рекомендовать внедрение в практику здравоохранения диагностикума эритроцитарного антигенного сапного, изготовленного по заявляемому способу и оформить всю необходимую нормативно-техническую документацию (“Регламент производства диагностикума сапного эритроцитарного антигенного”, “Временная фармакопейная статья”, “Инструкция по применению”). Временная фармакопейная статья на диагностикум эритроцитарный антигенный сапной зарегистрирована за номером ВФС 42-3465-99.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в таблице 3. Из ее анализа следует, что сапной эритроцитарный диагностикум, приготовленный по заявляемому способу, показывает результаты, существенно превосходящие прототип по чувствительности, специфичности и стабильности свойств при хранении.

Возможность осуществления предложенного способа может быть продемонстрирована следующим примером.

На АТЛ, созданной в НИИ микробиологии МО РФ, были приготовлены 4 серии эритроцитарного сапного антигенного диагностикума в соответствии с утвержденной нормативно-технической документацией. Характеристика серий представлена в таблицах 4 и 5.

Из представленных в таблицах 4, 5 данных следует, что все серии сапного эритроцитарного антигенного диагностикума полностью отвечали требованиям ВФС 42-3465-99 и не реагировали с чумной, туляремийной, сальмонеллезной и сибиреязвенной иммунными сыворотками, а с бруцеллезной отмечались титры 1:10 в пределах фоновых значений.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума эритроцитарного антигенного сапного, включающий выращивание культуры сапных микробов, извлечение из них антигенов, модификацию поверхности эритроцитов танином, сенсибилизацию антигенами танизированных эритроцитов, добавление к диагностикуму формалина, отличающийся тем, что в качестве производственного используют микробов штамма Ц-5 В. mallei, а извлечение видоспецифического антигенного комплекса из ацетонвысушенных микробов осуществляют с помощью 1%-ного раствора цетавлона, модификацию поверхности эритроцитов производят 0,005%-ным раствором танина, а сенсибилизацию осуществляют при рН 7,0-7,2 путем смешивания раствора антигенного комплекса и взвеси эритроцитов из расчета 100 мкг на 1 мл 2,5% взвеси при температуре 2-6^oС с последующей инкубацией в течение 18-20 ч, консервацию диагностикума производят добавлением к нему 5% формалина.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.01.2008

Извещение опубликовано: 20.08.2009 БИ: 23/2009