Патент на изобретение №2188032
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ Т-ЛИМФОЦИТОВ
(57) Реферат: Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской промышленности, и может быть использовано для лечения иммунодефицитных состояний, сопровождающихся нарушением процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. Сущностью изобретения является применение пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего дифференцировку Т-лимфоцитов. Техническим результатом является высокая специфическая активность предложенного пептида и снижение риска побочных эффектов. 3 табл. Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и заключается в применении пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего дифференцировку Т-лимфоцитов. Дифференцировка Т-лимфоцитов представляет собой процесс образования функционально полноценных Т-лимфоцитов из клеток-предшественников, который протекает преимущественно на территории центрального органа клеточного иммунитета – тимуса. Дифференцировка заканчивается образованием зрелого Т-лимфоцита, имеющего определенные мембранные маркеры (антигены CD3, CD4, CD8), отсутствующие на ранних стадиях развития [1]. Одним из механизмов формирования иммунодефицита по Т-системе иммунитета является угнетение дифференцировки Т-лимфоцитов. Применение в таких случаях стимуляторов дифференцировки может привести к нормализации иммунного статуса организма. Известны вещества пептидной природы, стимулирующие дифференцировку Т-лимфоцитов. К ним относятся препараты, полученные из тимуса животных, такие как тимозин [2], Т-активин [3], тималин [4]. Эти препараты состоят из комплекса веществ пептидной природы, которые способны регулировать различные этапы пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов. Использование их в качестве лекарственных средств затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за наличия нежелательных побочных эффектов ввиду присутствия в природных препаратах тимуса балластных высокомолекулярных компонентов. Предпочтительнее использовать низкомолекулярные синтетические пептиды. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и не оказывают вредного воздействия на организм. Известны синтетические пептиды, обладающие способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов. К ним относятся пептид тимопентин Arg-Lys-Asp-Val-Thr (Goldstein G. , Audhya Т.К. Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies. Survey of immunologic Research. (1985), 4: suppl. 1, pp. 1-10); аналоги тимопентина (патент ЕР 1450798, С 07 К 7/64, 1985; патент США 5013723, А 61 К 37/02, 1991); пептид Tyr-Gly (патент США 5100663, А 61 К 37/02, 1992); аналог гормона тимуса, имеющий формулу Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (патент WO 95/01182, А 61 К 37/00, 37/02, С 07 R 5/00, 7/00, 15/00, 17/00, 1995); трипептид Arg-Lys-Glu, обладающий иммуностимулирующей активностью и действующий в основном на Т-клеточное звено иммунитета (патент США 4874844, С 07 К 5/08, 1989); аналог сывороточного тимического фактора общей формулы А-Gly-Gly-Ser-Asn-B-C-NH-R, где А – Glu, Gln, Ala-Lys-Ser или Glu-Ala-Lys-Ser; В и С – Gly, Phe, Leu, Ala (патент ЕР 0201646, С 07 К 07/06, 1986). Известно средство тимоген, обладающее способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов [5,6]. Тимоген синтезирован на основе выделенной из тималина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии иммуноактивной фракции, представляющей собой дипептид Glu-Trp. Данное вещество по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Согласно прототипу синтетический пептид Glu-Trp дозозависимо и избирательно стимулирует дифференцировку предшественников Т-клеток в зрелые Т-клетки, но не влияет на В-клеточную дифференцировку. Однако данный пептид обладает низкой биологической активностью, что требует применения больших доз препарата и влечет появление нежелательных побочных эффектов. Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, стимулирующих дифференцировку Т-лимфоцитов. Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства, обладающего способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов, предлагается использовать синтетический пептид структурной формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu. Пептид синтезирован стандартной методикой твердофазного синтеза путем наращивания пептидной цепи с N-конца [7]. Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu – кислый, гидрофильный пептид с ММ 761 Д. При экспериментальном изучении специфической активности заявляемого средства, проведенном в сравнении с тимогеном, выявлена его способность стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов в значительно меньшей концентрации. Это подтверждается следующими примерами. Пример 1. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию Е-рецепторов “трипсинизированных” тимоцитов. С целью получения суспензии лимфоидных клеток тимус интактных морских свинок-самцов гомогенизировали в среде 199. Затем полученную суспензию тимоцитов обрабатывали протеолитическим ферментом трипсином (“Sigma”), разрушающим большую часть Е-рецепторов на поверхности клеток к эритроцитам кролика, в результате чего снижается процентное содержание клеток, выявляемых в реакции розеткообразования (Т-лимфоцитов). В суспензии интактных тимоцитов и тимоцитов, обработанных трипсином, определяли процентное содержание “активных” Т-лимфоцитов (Еа-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика [8, 9]. Пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu и тимоген вносили в культуры “трипсинизированных” тимоцитов в диапазоне концентраций от 0,0004 до 0,05 мкг/мл. Установлено, что обработка трипсином приводит к снижению более чем в 2 раза количества тимоцитов, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Добавление пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в концентрации 0,05 – 0,002 мкг/мл и тимогена в концентрации 0,05 – 0,01 мкг/мл приводило к восстановлению количества Е-рецепторов лимфоидных клеток тимуса (таблица 1). Таким образом, минимальная концентрация, в которой заявляемое средство способствует усилению экспрессии Е-рецепторов тимоцитов в 5 раз меньше, чем у тимогена, что указывает на более высокую специфическую активность пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu. Пример 2. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов больных с ожогами in vitro. Специфическую активность заявляемого средства оценивали по способности последнего стимулировать экспрессию дифференцировочных антигенов, являющихся маркерами зрелого Т-лимфоцита. Уровень экспрессии дифференцировочных антигенов оценивали методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами LT3, LT4, LT8 к дифференцировочным антигенам CD3, CD4, CD8 (“Сорбент”, Москва) [10], являющихся маркерами зрелого Т-лимфоцита и экспрессирующихся на завершающих этапах дифференцировки Т-клеток. Исследование проводили на лимфоцитах больных с ожогами, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается дифференцировка Т-лимфоцитов и в периферической крови снижается количество зрелых форм Т-клеток [11,12]. Лимфоциты больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Полученную суспензию клеток инкубировали с пептидом Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu и тимогеном в концентрации от 0,0004 до 0,05 мкг/мл в течение 2 ч при 37oС в полной питательной среде RPMI-1640 (“Flow”) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (“Flow”), 2мМ L-глутамина (“Flow”), 40 мкг/мл гентамицина (“Фармахим”) и 5мМ HEPES-буфера. В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме. Полученные данные представлены в таблице 2. Установлено, что у больных с ожогами резко снижено количество всех изучаемых субпопуляций лимфоцитов, исключая СОВ+клетки. Тимоген восстанавливал содержание СD3+ и CD4+-лимфoцитoв в концентрациях 0,05 – 0,01 мкг/мл, а заявляемое средство оказалось активно в дозах 0,05 – 0,002 мкг/мл. Оба средства достоверного изменения количества CD8+-лимфоцитов не вызывали (табл. 2). Таким образом, пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu увеличивает экспрессию дифференцировочных антигенов в дозах в 5 раз меньших, чем тимоген, что является отражением его высокой специфической активности. Пример 3. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов у тимэктомированных мышей in vivo. Биологическую активность заявляемого средства изучали на модели тимэктомии [13] . Известно, что в тимусе происходит дифференцировка Т-лимфоцитов и его удаление сопровождается нарушением этого процесса. В трехмесячном возрасте производили оперативное удаление тимуса у мышей. Контрольная группа животных подверглась ложной операции с воспроизведением всех этапов оперативного вмешательства за исключением удаления тимуса. Через 1 месяц после оперативного вмешательства тимэктомированным животным вводили пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu и тимоген в дозах от 0,0008 до 0,1 мкг/кг веса тела в течение 7 дней. Контролем служили тимэктомированные животные, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Количество зрелых Т-лимфоцитов, имеющих кластеры дифференцировки CD4 (Т-хелперы) и CD8 (цитотоксические Т-лимфоциты), определяли в реакции прямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, меченых FITC, F7400 и F7525 к молекулам CD4 и CD8 мыши соотвественно (“Sigma”, Швеция). Известно, что CD4 и CD8 являются дифференцировочным маркером Т-клеток и определяются на заключительных этапах дифференцировки соответственно Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и отсутствуют на стадии пре-Т-клеток. Полученные результаты представлены в таблице 3. Установлено, что у тимэктомированных мышей резко снижается количество Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности дифференцировочные антигены CD4 и CD8. Введение пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu во всем диапазоне доз тимэктомированным животным приводит к повышению количества зрелых Т-лимфоцитов, имеющих кластеры дифференцировки на своей поверхности, причем максимальная активность предлагаемого средства зарегистрирована в концентрации 0,02 мкг/кг веса тела. Аналогичный эффект достигается и введением тимогена в дозах от 0,004 до 0,1 мкг/кг веса с максимальной активностью в дозировке 0,1 мкг/кг веса тела. Таким образом, пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu in vivo стимулирует дифференцировку Т-лимфоцитов в концентрациях в 5 раз меньших, чем известный пептид тимоген. Таким образом, при экспериментальном изучении специфической активности заявляемого средства установлено, что пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu обладает свойством стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов. По сравнению с тимогеном заявляемый пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu способен стимулировать дифференцировку Т-клеток в 5 раз меньших дозах. Уменьшение дозировки заявляемого средства для достижения аналогичного эффекта дает возможность уменьшить риск побочного влияния средства при введении его в организм. Предлагаемое средство может найти применение для профилактики и лечения широкого спектра иммунодефицитных состояний, сопровождающихся нарушением процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. Источники информации 1. Кетлинский С. А. , Калинина Н.М. Иммунология для врача. – Спб. ТОО, изд-во “Гиппократ”. 1998. – 156 с. 3. Арион В. Я. Т-активин и его иммунобиологические свойства: Автореф. дис. док. биол. наук. – М. – 1990. – 52 с. 4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. – М.: Медицина, 1988 – т.2, гл. 9, с. 168-175. 6. Хавинсон В.Х., Синакевич Н.В., Серый С.В. Тимоген.- СПб, 1991. – 48 с. 7. Steward J. M. , Young J.D. Solid phase peptide synthesis, San Francisco, 1969. 10. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. – М.: Мир, 1990, 395 с. 13. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 08.02.2003
Номер и год публикации бюллетеня: 8-2004
Извещение опубликовано: 20.03.2004
|
||||||||||||||||||||||||||
