Патент на изобретение №2187812

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИИ (ВАРИАНТЫ)

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития железодефицитной анемии. Для этого в выделенной методом фенольно-хлороформной экстракции ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят анализ полиморфных локусов гена цитохрома Р-4501А1 методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. После амплификации и рестрикции фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе: наличие ДНК-фрагментов размером 48 и 139 пар нуклеотидов (пн) интерпретируют как аллель изолейцин (Ilе), размером 48, 120 и 19 пн – как валин (Val). Относительный риск развития заболевания (ОR) констатируют при OR>1,5. При выявлении у обследуемого генотипа Ilе/Val прогнозируют риск развития ЖДА (вариант 1). В выделенной методом фенольно-хлороформной экстракции ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят анализ полиморфных локусов генов глутатион S-трансферазы М1 (GSTM1), N-ацетилтрансферазы 2 (Nat2), ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и активатора плазминогена (АП) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и при выявлении сочетаний генотипов 0/0,S/R,I/D,I/D; +/+,R/R,I/I,I/D; +/+, S/S,I/D,I/D; +/+,S/R,I/I,I/D; +/+,S/R,D/D,I/I прогнозируют риск развития железодефицитной анемии. Способ позволяет повысить точность прогнозирования. 2 с.п.ф-лы, 1 табл.

Предлагаемая группа изобретений относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использована для прогнозирования развития железодефицитной анемии (ЖДА).

ЖДА представляет актуальную проблему здравоохранения, что объясняется широким распространением сидеропений среди всех групп населения, особенно трудоспособного возраста, ростом рецидивирующих, тяжелых и резистентных форм заболевания. Отсюда вытекает необходимость в больших экономических затратах, связанных со значительными трудопотерями, что определяет важное социально-экономическое значение изучаемой проблемы. Первичная профилактика ЖДА зачастую проводится при имеющемся латентном дефиците железа. Поэтому изыскание современных способов прогнозирования ЖДА является актуальным.

Известен способ прогнозирования развития ЖДА путем определения микроэлементоза (дефицит железа и меди) в почве и воде [Никитин Е.Н. Железодефицитные состояния у населения в регионе Среднего Предуралья: Автореф. дис…. д-pa мед. наук.- М., 2001.- 43 с.].

Однако данные способы прогнозирования развития ЖДА проводятся на фоне возможного латентного дефицита железа, являются неточными и обобщенными.

Технический результат – повышение точности прогнозирования при отсутствии латентного дефицита железа.

Указанный технический результат достигается тем, что в выделенной методом фенольно-хлороформной экстракции ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят анализ полиморфных локусов гена цитохрома Р-4501А1 (CYP1A1) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР). После амплификации и рестрикции фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе: наличие ДНК-фрагментов размером 48 и 139 пар нуклеотидов (пн) интерпретируют как аллель изолейцин (Не), размером 48, 120 и 19 пн – как валин (Val). При выявлении у обследуемого генотипа Ile/Val риск развития ЖДА увеличивается в 2,5 раза (вариант 1).

Способ осуществляется следующим образом. Амплификацию полиморфного участка гена CYP1A1 проводят в реакционной смеси, содержащей примерно 100 нг геномной ДНК; 1ед Taq-полимеразы, 0,25 мг соответствующих праймеров -5′-GAACTGCCACTTCAGCTG ТСТ-3′ и 5′-GAAAGACCTCCCAGCGGTCA-3′ 200 мМ каждой dNTP в 50 мл 1ХПЦР-буфера. Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 95^oС в течение 10 мин, 35 циклов, включая: денатурацию при 95^oС – 1 мин, отжиг праймеров при 55^oС – 1 мин, синтез при 72^oС- 2 мин. После амплификации ПЦР-продукты подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Hindl. Для этого 10 мкл ПЦР-продукта смешивают с 5 ед фермента, смесь выдерживают при 37^oС в течение 10 ч. Электрофорез фрагментов ДНК проводят в 1 х трисборатном буфере (0,089 М трис-НСl рН 7,8; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА с рН 8,0) в вертикальных пластинах при постоянном напряжении 250-300 В после 30-минутного преэлектрофореза. Перед нанесением на гель пробы смешивают в соотношении 1: 5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. После окончания электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

Выявлено достоверное различие между распределением частоты генотипа Ile/Val гена CYP1A1 у больных ЖДА (N=93) и контрольной группы (N=70): 16,12 и 5,71% соответственно (² = 5,57; р=0,044). Вычисление относительного риска (OR) возникновения ЖДА при наличии генотипа Ile/Val гена CYP1A1 производят по формуле OR=a*d/b*c, где а – частота генотипа в выборке больных (в %); b – частота генотипа в контрольной выборке (в %); с=100-а, d=100-b, риск развития заболевания констатируют при OR>1,5. В нашем исследовании OR=2,54 при наличии генотипа Ile/Val гена CYP1A1. Данный генотип является диагностическим маркером ЖДА и может применяться для выявления группы риска возникновения заболевания до обнаружения латентного дефицита железа с целью проведения профилактических курсов железотерапии.

Пример 1. Больная К-ва Р. X., 40 лет, находилась под наблюдением с 23. 11.1999 г. по поводу хронической железодефицитной анемии тяжелой степени вследствие маточных кровопотерь. Больная поступила с жалобами на слабость, головокружение, бледность и сухость кожных покровов, выпадение волос, ломкость ногтей, сердцебиение, одышку при незначительной физической нагрузке. Больной себя считает 8 лет, лечение в прошлом не получала. Родилась 3-м по счету ребенком, мать и сестры страдали анемией. Менструации по 3 дня, необильные, цикл 25 дней, беременностей – 2, родов – 2. Питание сбалансированное. При объективном исследовании состояние средней степени тяжести, кожные покровы бледные, с желтоватым оттенком, сухие. Ногтевые пластинки мягкие, ломкие, койлонихии. Над легкими везикулярное дыхание, частота сердечных сокращений 80 в минуту, артериальное давление 110 и 70 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный; печень и селезенка не увеличены. В общем анализе крови гипохромная анемия тяжелой степени с микроцитозом и анизоцитозом, при исследовании феррокинетики – снижение сывороточного железа и ферритина. После проведенного лечения ферроплексом в течение 3 месяцев отмечалась положительная динамика заболевания. Для исследования генотипа гена CYP1A1 у больной было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена CYP1A1 в реакционной смеси, содержащей примерно 100 нг геномной ДНК; 1ед Taq-полимеразы, 0,25 мг соответствующих праймеров – 5′-GAACTGCC ACTTCAGCTGTCT-3′- и 5′-GAAAGACCTCCCAGCGGTCA-3′, 200 мМ каждой dNTP в 50 мл 1ХПЦР-буфера. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой HincII провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 30-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование гена CYP1A1 больной выявило генотип Ile/Val. Проведение генетического анализа задолго до появления симптомов заболевания позволило бы вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития ЖДА.

Пример 2. Женщина-донор 32 лет была обследована перед очередной (второй) сдачей крови. Жалоб не предъявляла. Родилась 1-м по счету ребенком, наследственность по ЖДА не отягощена. Менструации по 3 дня, необильные, цикл 29 дней, была 1 беременность, завершившаяся родами. Питание сбалансированное. При объективном исследовании состояние удовлетворительное, физикальных изменений не выявлено. В общем анализе крови отклонений не обнаружено, сывороточное железо и ферритин в пределах нормы. Для исследования генотипа гена CYP1A1 у обследованной было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена CYP1A1 в реакционной смеси, содержащей примерно 100 нг геномной ДНК; 1ед Taq-полимеразы, 0,25 мг соответствующих праймеров – 5′-GAACTGCCACTTCAGCTGTCT-3′ и 5′-GAAAGACCTCCCAGCGG ТСА-3′, 200 мМ каждой dNTP в 50 мл 1ХПЦР-буфера. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой HincII провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 В после 30-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование гена CYP1A1 обследованной выявило генотип Ile/Val. Вывод: необходимо проведение профилактических курсов лечения препаратами железа для предупреждения развития ЖДА, так как наличие данного генопипа повышает риск развития заболевания в 2,5 раза.

Однако данный способ прогнозирования развития ЖДА проводится на фоне возможного латентного дефицита железа, является неточным и обобщенным.

Технический результат – повышение точности прогнозирования при отсутствии латентного дефицита железа.

Указанный технический результат достигается тем, что в выделенной методом фенольно-хлороформной экстракции ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят анализ полиморфных локусов генов, прямо или опосредовано участвующих в патогенезе ЖДА: глутатион S-трансферазы Ml (GSTM1), N-ацетилтрансферазы 2 (Nat2), ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и активатора плазминогена (АП) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР). После амплификации и рестрикции фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Наличие гомо- и гетерозигот по нормальному аллелю гена GSTM1 (генотипы +/+ и +/0 соответственно) определяют присутствием на электрофореграммах фрагмента амплификации размером 271 пн, его отсутствие (0/0) обозначает гомозиготное состояние по делеции данного участка гена. Наличие фрагмента гена Nat2 размером 547 пн, содержащего три полиморфных сайnа, выявляемых рестриктазами Kpnl, TagI и BamH, интерпретируют как быструю форму гена Nat2 (генотип R/R); потеря одного из рестрикционных сайтов приводит к появлению мутантного аллеля, следствием чего является генотип S/S или S/R гена Nat2. Полиморфизм генов АПФ и АП обусловлен наличием (инсерция) или отсутствием (делеwия) Alu-повтора, в результате чего визуализируют аллели размером 490 п.н. – инсерция (I) или 190 п.н. – деления (D) соответственно. В соответствии с наличием инсерции/делеции в гомо- или гетерозиготном состоянии формируются следующие генотипы: I/I – гомозигота по наличию инсерции; D/D – гомозигота по делеции; I/D – гетерозигота.

При выявлении у обследуемого сочетаний генотипов, приведенных в таблице 1, риск развития ЖДА увеличивается в 3,8-20,4 раз (вариант 2).

Способ осуществляется следующим образом. Амплификацию фрагмента гена GSTM1 проводят в реакционной смеси, содержащей примерно 100 нг геномной ДНК, по 15 мМ каждого праймера (5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′ и 5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′), 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 ед Taq-полимеразы. Режим амплификации следующий: начальная денатурация (94^oС, 7 мин), 30 циклов амплификации: денатурация -94^oC, 40 с; отжиг – 55^oС, 40 с, синтез – 72^oС, 1 мин. При отсутствии делеции формируется фрагмент размером 400 пн, при наличии делеции данный фрагмент отсутствует. В качестве внутреннего контроля используют амплификацию фрагмента гена CYP1A1
Амплификацию фрагмента гена Nat2 выполняют в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 16,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА,10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP, 1 ед Taq-полимеразы и соответствующие праймеры по 15 нМ каждого (5 -GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3′ и 5′-TTGGGTGATACATAGACAAG GG-3′). После денатурации (94^oС, 7 мин) проводят 30 циклов амплификации в режиме: 94^oС – 40 с, 59^oC – 40 с, 72^oC – 1 мин с заключительным синтезом в течение 5 мин при 72^oС. При идентификации мутантного аллеля гена Nat2 проводят расщепление полученного ПЦР продукта рестриктазами Kpnl, Taql, BamHl.

Амплификацию полиморфного участка гена АПФ проводят в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH₄)₂SO₄; 5 мМ MgCl₂; 0,01% Tween-20; 0,01% желатина; 0,1 мкг геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкг каждого) и соответствующие праймеры по 10 пМ каждого (5′-CTGGAGACCACTCCCATCCТТТCT-3′ и 5′-GATGTGGCCATCACATTCGTC AGAT-3′). После денатурации при 95^oС в течение 3 мин добавляют 1 ед Taq-полимеразы. Последующие циклы включают в себя: денатурацию – 1 мин при 94^oС, отжиг – 1 мин при 62^oС, элонгацию – 1 мин при 72^oС. После 30 циклов амплификации пробы выдерживают в течение 10 мин при 72^oС и охлаждают.

Амплификацию полиморфного участка в гене АП проводят в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 50 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH₄)₂SO₄; 5 мМ MgCl₂; 0,01% Tween-20; 0,01% желатина; 0,1 мкг геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкг каждого) и соответствующие праймеры по 10 пМ каждого (5′-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3′ и 5′-CCACCCTAGG AGAACTTCTCТТТ-3′). Параметры 30 циклов амплификации следующие: денатурация – 1 мин при 94^oС, отжиг – 1 мин при 58^oС, элонгация – 1 мин при 72^oС.

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле. Электрофорез фрагментов ДНК проводят в 1х трисборатном буфере (0,089 М трис-HCl рН 7,8; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА с рН 8,0) в вертикальных пластинах при постоянном напряжении 250-300 В после 30-минутного преэлектрофореза. Перед нанесением на гель пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. После окончания электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.

Выявлено достоверное различие между распределением частот сочетаний генотипов генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП у больных ЖДА (N=99) и контрольной группы (N= 90) (p<0,05). Вычисление относительного риска (OR) возникновения ЖДА при наличии сочетаний генотипов, приведенных в таблице, производят по формуле OR=a*d/b*c, где а – частота сочетаний генотипов в выборке больных (в %); b – частота сочетаний генотипов в контрольной выборке (в %); с=100-а, d=100-b, риск развития заболевания констатируют при OR >1,5. В нашем исследовании OR – от 3,83 до 20,4 при наличии сочетаний генотипов, представленных в таблице. Данные сочетания генотипов являются диагностическими маркерами ЖДА и могут применяться для выявления группы риска развития заболевания до обнаружения латентного дефицита железа при проведении скрининговых исследований или генетической паспортизации населения с целью проведения профилактических курсов железотерапии.

Пример 1. Больная А-ва Л. Т. , 43 лет, находилась под наблюдением с 3.12.1999 г. по поводу хронической железодефицитной анемии тяжелой степени вследствие маточных кровопотерь. Больная поступила с жалобами на слабость, головокружение, бледность и сухость кожных покровов, выпадение волос, ломкость ногтей, сердцебиение, одышку при незначительной физической нагрузке. Больной себя считает 12 лет, лечение в прошлом не получала. Родилась 2-м по счету ребенком, мать и сестры страдали анемией. Менструации по 7 дней, обильные, регулярные, цикл 28 дней, беременностей – 4, родов – 3, абортов – 1. Питание сбалансированное. При объективном исследовании состояние средней степени тяжести, кожные покровы бледные, сухие. Ногтевые пластинки мягкие, ломкие, койлонихии. Над легкими везикулярное дыхание, частота сердечных сокращений 90 в минуту, артериальное давление 100 и 65 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный; печень и селезенка не увеличены. В общем анализе крови гипохромная анемия тяжелой степени с микроцитозом и анизоцитозом, при исследовании феррокинетики – снижение сывороточного железа и ферритина. После проведенного лечения ферроплексом в течение 3 месяцев положительной динамики заболевания не отмечалось. Для исследования сочетаний генотипов генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП у больной было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП в реакционных смесях, содержащих соответственно для гена GSTM1: 100 нг геномной ДНК, по 15 пМ каждого праймера (5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAA GC-3′ и 5–GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′), 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 ед Taq-полимеразы; для гена Nat2: 67мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 16,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP, 1 ед Taq-полимеразы и соответствующие праймеры по 15 нМ каждого (5′-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3′ и 5–TTGGGTGATACAT AGACAAGGG-3′) с последующей рестрикцией ПЦР-продуктов гена Nat2 рестриктазами Kpnl, Taql, BamHl; для гена АПФ: 50 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH₄)₂SO₄; 5 мМ MgCl₂ 0,01% Tween-20; 0,01% желатина; 0,1 мкг геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкг каждого) и соответствующие праймеры по 10 пМ каждого (5′-CTGGAGACCACTCCCATCCТТТCT-3′ и 5′-GATGTGGCCATCA CATTCGTCAGAT-3′); для гена АП: 50 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NН₄)₂SO₄; 5 мМ MgCl₂; 0,01% Tween-20; 0,01% желатина; 0,1 мкг геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкг каждого) и соответствующие праймеры по 10 пМ каждого (5′-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3′ и 5–CCACCCTAGGAGAACTTCT СТТТ-3′). Амплифицированные фрагменты ДНК разделили электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле под напряжением 250-300 В после 30-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование сочетаний генопов генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП выявило комбинацию генотипов +/+,S/S,I/D,I/D. Проведение генетического анализа задолго до появления симптомов заболевания позволило бы вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития тяжелой, резистентной формы ЖДА.

Пример 2. Женщина-донор, 25 лет, была обследована перед первой сдачей крови. Жалоб не предъявляла. Родилась 1-м по счету ребенком, наследственность по ЖДА не отягощена. Менструации по 4 дня, необильные, цикл 28 дней, беременностей не было. Питание сбалансированное. При объективном исследовании состояние удовлетворительное, физикальных изменений не выявлено. В общем анализе крови отклонений не обнаружено, сывороточное железо и ферритин в пределах нормы. Для исследования сочетаний генотипов генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП у больной было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП в реакционных смесях, содержащих соответственно для гена GSTM1: 100 нг геномной ДНК, по 15 пМ каждого праймера (5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′ и 5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′), 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА, 10мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 ед Taq-полимеразы; для гена Nat2: 67мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 16,7 мМ MgCl₂, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP, 1 ед Taq-полимеразы и соответствующие праймеры по 15 нМ каждого (5′-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3- и 5′-TTGGGTGATACATAG ACAAGGG-3′) с последующей рестрикцией ПЦР-продуктов гена Nat2 рестриктазами Kpnl, Taql, BamHl; для гена АПФ: 50 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH₄)₂SO₄; 5 мМ MgCl₂ 0,01% Tween-20;0,01% желатина; 0,1 мкг геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкг каждого) и соответствующие праймеры по 10 пМ каждого (5-CTGGAGACCACTCCCATCCТТТCT-3- и 5′-GATGTGGCCATCA CATTCGTCAGAT-3′); для гена АП: 50 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH₄)₂SO₄; 5 мМ MgCl₂; 0,01% Tween-20; 0,01% желатина; 0,1 мкг геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкг каждого) и соответствующие праймеры по 10 пМ каждого (5′-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3′ и 5′-CCACCCTAGGAGAACTTC ТСТТТ-3′). Амплифицированные фрагменты ДНК разделили электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле под напряжением 250-300 В после 30-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 мин и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование сочетаний генопов генов GSTM1, Nat2, АПФ и АП выявило комбинацию генотипов +/+, S/R, D/D, I/I. Вывод: необходимо проведение профилактических курсов лечения препаратами железа по 7-10 дней после менструаций для предупреждения развития ЖДА и отстранение от донорства, так как наличие данного генопипа повышает риск развития заболевания в 12,8 раз.

Предложенный способ современен и позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать заболевание.

Формула изобретения

1. Способ прогнозирования развития железодефицитной анемии, отличающийся тем, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, амплифицируют фрагменты гена цитохрома Р-4501 А1 и при выявлении генотипа изолейцин/валин прогнозируют риск развития железодефицитной анемии у обследуемого.

2. Способ прогнозирования развития железодефицитной анемии, отличающийся тем, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, амплифицируют фрагменты генов глутатион S-трансферазы M1, N-ацетилтрансферазы 2, ангиотензинпревращающего фермента и активатора плазминогена и при выявлении сочетаний генотипов 0/0, S/R,I/D,I/D; +/+,R/R,I/I,I/D; +/+,S/S,I/D,I/D; +/+,S/R,I/I,I/D; +/+,S/R,D/D, I/I прогнозируют риск развития железодефицитной анемии у обследуемого.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 07.07.2003

Извещение опубликовано: 27.09.2004 БИ: 27/2004