Патент на изобретение №2187554

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ ИНУЛИНАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения экстрацеллюлярной инулиназы, применяемой в пищевой промышленности, в медицине и производстве диетических продуктов. Способ получения экстрацеллюлярной инулиназы включает культивирование штамма-продуцента инулиназы Bacillus ВКМВ-722 на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и витаминов мелассу в количестве 8-10 маc.%, в качестве источника аминного азота и фосфора – гидрофосфат аммония в количестве 0,5-1,0 маc.%; рН среды – 7,0. Изобретение обеспечивает повышение активности инулиназы с 21ед./см³ до 67,0-76,2ед. /см³ культуральной жидкости по сравнению с известной, снижается стоимость фермента.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения экстрацеллюлярной инулиназы, применяемой в пищевой промышленности, в медицине и производстве диетических продуктов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения инулиназы, продуцируемой Bacillus subtilis B-3-3. Исследована связь синтеза инулиназы с условиями культивирования штамма (рН, концентрация субстрата, аэрация). Показано, что Bacillus subtilis B-3-3 продуцирует активную инулиназу (до 21 ед./см³) при культивировании в щелочной среде при высокой концентрации источников углерода и хорошей аэрации. Сахароза может заменять инулин в качестве источника углерода в синтезе инулиназы. Инулиназа проявляет максимальную активность при рН 6,5 и температуре 55^oС и сохраняет стабильность при рН 6,0-8,0 и температуре 40-55^o

Недостатками известного способа являются использование в качестве источников углерода инулина или сахарозы, а также высокая их концентрация в питательной среде, что экономически нецелесообразно из-за их высокой стоимости и является неоправданным, так как при этом получают продуцируемую инулиназу с низкой активностью (до 21 ед./см³).

Техническая задача изобретения – повышение активности экстрацеллюлярной инулиназы и снижение ее себестоимости.

Техническая задача достигается тем, что в способе получения экстрацеллюлярной инулиназы, включающем подготовку питательной среды, культивирование штамма-продуцента, новым является то, что в качестве штамма-продуцента инулиназы используется штамм Bacillus polymyxa 722, а в питательную среду в качестве источника углерода и витаминов вносится меласса в количестве 8-10 мас.%, в качестве источника аминного азота и фосфора – гидрофосфат аммония в количестве 0,5-1,0 мас.%; рН среды – 7,0.

Технический результат изобретения выражается в повышении активности экстрацеллюлярной инулиназы, снижение ее себестоимости.

Способ реализуется следующим образом.

Штамм Bacillus polymyxa 722 получен из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов РАН, где хранится под ВКМ В-722. Чистую культуру выращивают на мясо-пептонном агаре в течение 3-4 суток при температуре 31-33^oС. При культивировании продуцента в качестве источника углерода и витаминов используют мелассу – отход сахарного производства в количестве 8-10 мас.%, а в качестве источника аминного азота и фосфора – гидрофосфат аммония в количестве 0,5-1,0 мас.%.

Питательную среду, содержащую дигидрофосфат калия, хлорид калия, сульфат магния, сульфат железа, гидрофосфат аммония, мелассу и воду, инокулируют штаммом Bacillus polymyxa 722 и выращивают его в оптимальных (рН 7,0; 37^oС; 72 ч) для используемого штамма условиях. После завершения культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы и определяют инулиназную активность.

В предлагаемом изобретении для определения инулиназной активности использован метод, основанный на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстрата под действием фермента инулиназы. В качестве субстрата используется инулин фирмы “ICN” (США).

За единицу инулиназной активности принято такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкм редуцирующих веществ (фруктозы) за 1 мин. Методика анализа следующая. Реакционную смесь, состоящую из 2 см³ раствора инулина с массовой долей 5 % в фосфатном буфере рН 7,0 и 1 см³ раствора фермента, инкубируют в течение 20 мин при 40^oС. Параллельно готовят контрольный опыт: к 2 см³ раствора инулина с массовой долей 5 % в фосфатном буфере рН 7,0 добавляют 3 см³ щелочи (150 г NaOH и 200 г тартрата калия-натрия в 1 дм³ дистиллированной воды) и 1 см³ культуральной жидкости.

В опытной пробе по истечении 20 мин реакцию останавливают добавлением раствора щелочи 3 см³. После чего в опытную и контрольную пробы приливают по 3 см³ раствора медного купороса с массовой долей 4 %. Затем пробирки с содержимым взбалтывают и погружают сначала в кипящую водяную баню на 6 мин, потом в сосуд с холодной водой и определяют количество редуцирующих веществ полумикрометодом Бертрана. Инулиназную активность рассчитывают по формуле:

где А – активность инулиназы, ед./см³; А₀ – количество редуцирующих веществ, образующихся в результате гидролиза инулина, мкг; А_к – количество редуцирующих веществ в контрольной пробе, мкг; n – количество культуралъной жидкости, см³; – время гидролиза, мин; 180 – молекулярная масса фруктозы.

Состав питательной среды обеспечивает интенсификацию накопления инулиназной активности.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
Меласса – 6,0
(NH₄)₂HPO₄ – 0,25
KCl – 0,05
MgSO₄7H₂O – 0,05
КН₂РO₄ – 0,1
FeSO₄7H₂O – 0,01
Вода – Остальное
Готовят водно-споровую суспензию штамма Bacillus polymyxa 722. Для этого 4-суточную культуру штамма переносят со скоса в колбу емкостью 250 см³, содержащую 50 см³ стерильной воды. В колбы Эрленмейера емкостью 500 см³ вносят по 120 см³ питательной среды (рН 7,0), засевают водно-споровой суспензией в количестве 1 % к объему среды и инкубируют на качалке при скорости 1,7-1,8 с^-1, температуре 371^oС в течение 72 ч. По окончании выращивания бактерии отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (10000g, 10мин).

После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 52,6 ед./см³.

Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
Меласса – 8,0
(NH₄)₂HPO₄ – 0,5
КСl – 0,05
MgSO₄7H₂O – 0,05
KH₂PO₄ – 0,1
FeSO₄7H₂O – 0,01
Вода – Остальное
Выращивание биомассы: инокуляцию посевного материала, соблюдение условий культивирования продуцента, определение активности проводят аналогично примеру 1.

После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 67,0 ед./см³.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, маc.%:
Меласса – 10,0
(NH₄)₂HPO₄ – 1,0
КСl – 0,05
MgSO₄7H₂O – 0,05
КН₂РO₄ – 0,1
FeSO₄7H₂O – 0,01
Вода – Остальное
Выращивание биомассы: инокуляцию посевного материала, соблюдение условий культивирования продуцента, определение активности проводят аналогично примеру 1.

После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 76,2 ед./см³.

Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
Меласса – 12,0
(NH₄)₂HPO₄ – 1,5
КСl – 0,05
MgSO₄7H₂O – 0,05
КН₂РO₄ – 0,1
FеSO₄7Н₂О – 0,01
Вода – Остальное
Выращивание биомассы: инокуляцию посевного материала, соблюдение условий культивирования продуцента, определение активности проводят аналогично примеру 1.

После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 65,6 ед./см³.

Как видно из примеров, при культивировании Bacillus polymyxa 722 наиболее эффективным является внесение в питательную среду мелассы в количестве 8-10 маc. % и гидрофосфата аммония в количестве 0,5-1,0 маc.%. Активность экстрацеллюлярной инулиназы повышается с 21 ед./см³ до 67,0-76,2 ед./см³ культуральной жидкости по сравнению с известным способом.

Таким образом, предложенный способ получения экстрацеллюлярной инулиназы дает возможность получить фермент с высокой активностью и при этом снизить ее себестоимость.

Формула изобретения

Способ получения экстрацеллюлярной инулиназы, включающий подготовку питательной среды, культивирование штамма-продуцента, отличающийся тем, что в качестве штамма – продуцента инулиназы используется штамм Bacillus polymyxa 722, а при подготовке в питательную среду в качестве источника углерода и витаминов вносят мелассу в количестве 8-10 маc.%, в качестве источника аминного азота и фосфора – гидрофосфат аммония в количестве 0,5-1,0 маc.%, рН среды – 7,0.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 05.05.2003

Извещение опубликовано: 10.02.2005 БИ: 04/2005